一种精子质膜保护剂TRIS/BSA及染色液和方法

本发明涉及一种染色液，具体涉及一种精子质膜保护剂tris/bsa及染色液和方法。

背景技术：

精子质膜完整性是维持精子正常生理功能的基础。通常认为，细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。因此，精子膜的完整性常作为评价精子活率的基本指标。非荧光染料染色是目前判断精子质膜完整性最简便的方法之一。目前，国际上主要采用的精子活率检测方法——非荧光染料染色法的基本原理是：细胞损伤或死亡时，染液可穿透细胞膜，与dna结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内，故可以通过显微镜观察鉴别死细胞与活细胞。死精子质膜丧失选择通透性功能，从而使染料可透过质膜进入精子，而活精子拒染。

目前，生产和实验室最常使用的非荧光染料有：0.4％台盼蓝、0.5％伊红、0.67％伊红+10％苯胺黑(who人精子活率检测标准方法)。0.5％伊红作为国际常用检测精子活率的染料，使用设备简单，但操作比较繁琐，且对精子有毒害作用，易高估死精子比例，误差较大。另外，伊红浓度越大、染色时间越长，精子聚集成团的现象越明显，且不易辨别精子形态和染色情况。0.67％伊红+10％苯胺黑是在伊红染色法上的进一步优化，相比于伊红，能够有效避免精子聚集现象，但该方法依然存在着易高估死亡精子的问题。0.4％台盼蓝染色过程迅速，可在几分钟内对细胞进行染色分析。但是，台盼蓝染液浓度和染色时间对检测结果具有较大影响，精子容易凝聚成团。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种精子质膜保护剂tris/bsa及染色液和方法，该精子质膜保护剂tris/bsa解决了现有染色液在精子活率检测时容易出现凝聚成团影响检测结果以及易高估死亡精子的问题，不仅能够稳定精子结构，而且有效减少精子凝聚成团、减缓抹片干燥速度，易于操作。

为了达到上述目的，本发明提供了一种精子质膜保护剂tris/bsa，该保护剂tris/bsa包含：三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、果糖、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁和水；其中，所述三羟甲基氨基甲烷、果糖、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁和牛血清白蛋白的浓度分别为10mmol·l^-1、14mmol·l^-1、130mmol·l^-1、4mmol·l^-1、1mmol·l^-1、0.5mmol·l^-1、1g·l^-1。

本发明的保护剂中tris及bsa有维持溶液ph值，保护精子质膜完整性的作用。d-果糖为精子提供能量；氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁主要维持溶液的离子平衡。

本发明的另一目的是提供一种用于精子活率检测的染色液，该染色液包含：台盼蓝、pbs缓冲液，和如权利要求1所述的精子质膜保护剂tris/bsa；其中，所述台盼蓝的浓度为0.4～0.8％。

优选地，所述台盼蓝和pbs缓冲液的用量为1～2g：125ml。

本发明的另一目的是提供一种用于精子活率检测的方法，该方法采用如权利要求2或3所述的染色液对待检测的精子样品进行染色。

优选地，该方法包含：将待检测的精子样品与所述染色液以1:1体积比混合后在37℃恒温染色，染色结束后取溶液涂在载玻片上，在显微镜下观察拍照，统计死亡精子数和总精子数，求出精子活率。

本发明的精子质膜保护剂tris/bsa及染色液和方法，解决了现有染色液在精子活率检测时容易出现团聚影响检测结果以及易高估死亡精子的问题，具有以下优点：

本发明的精子质膜保护剂tris/bsa，采用三羟甲基氨基甲烷(tris)和牛血清白蛋白(bsa)，tris能够中和精子代谢过程产生的有害物质以及使精子处于一个稳定的ph环境中，bsa能通过多种途径保护精子：补充精液稀释时降低的与维持、激活精子运动有关的蛋白，保证精子运动能力；选择性结合精子质膜上的磷脂，稳定精子结构；防止精子冷冻时ca²⁺内流入精子胞质，提前获能；中和精子和细菌代谢副产物；起一定缓冲作用和抗氧化作用；减少稀释造成的精子头部带相反电性电荷所引起的头对头凝集。本发明的染色液的精子活率检测结果准确性均显著高于0.4％台盼蓝和0.5％伊红，染色结果的稳定性优于0.67％伊红+10％苯胺黑染色液，可有效减少精子凝聚成团、减缓抹片干燥速度，提高检测的准确性和便利性。

本发明添加tris/bsa有效减少因台盼蓝染色剂对精子质膜的损伤而造成的误差，提高台盼蓝染液检测效果的准确性和稳定性，达到优化作用，效果表现在：(1)未加入缓冲液的台盼蓝配制一段时间后会有溶质析出，这会导致抹片后精子聚集成团，加入tris/bsa的台盼蓝染液溶质析出现象减弱，抹片后精子凝集成团的程度降低，更有利于计数观察；(2)使用伊红染液进行染色时，载玻片上染液干透速度快，干透后的抹片背景上有明显的颗粒物，影响观察计数。用台盼蓝+tris/bsa染液进行染色，载玻片上染液干透速度减慢，为操作人员寻找合适视野提供了更多时间；(3)使用台盼蓝+tris/bsa染液，随着染色时间的延长，精子活率降低的程度较直接使用台盼蓝染液染色时精子活率降低的程度轻。

附图说明

图1为本发明tris/bsa+0.4％台盼蓝溶液与0.4％台盼蓝染色结果。

图2为本发明tris/bsa+0.4％台盼蓝溶液与0.5％伊红染色结果。

图3为本发明tris/bsa+0.4％台盼蓝溶液与0.67％伊红+10％苯胺黑染色结果。

图4为本发明各种染色液的染色效果图(×400)。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实验所用材料，如下：

1、精液样品及其来源

采集的3头公猪精液，来源于巨星集团崇州某种猪场，体质健康、性欲旺盛成年长白公猪(1～1.5岁)。

2、试验试剂

伊红、冰醋酸、hoechst33342、pi、葡萄糖、乙二胺四乙酸(edta)、柠檬酸钠、氯化钠、氯化钾、d-果糖、无水氯化钙、六水氯化镁、牛血清白蛋白(bsa)、三羟甲基氨基甲烷(tris)、台盼蓝、磷酸缓冲盐溶液(pbs)，等。

实验例1精液的采集和处理

采用手握法收集精液，用覆有精液滤纸的集精杯接取富含精子部分的精液，精液样品保存在37℃保温瓶内，30min内带回实验室。使用时将精液分装至已灭菌的1mlep管中，做好标记后用数层毛巾将其包裹，放入17℃恒温箱中使其逐渐降温，保持温度恒定，保存时每天摇动，防止精子因沉淀而死亡。每次采集的精液在3天内进行检测，超过3天不再使用。

实验例2伊红染色

(1)伊红染液成分

称取伊红0.1g，溶于10mlpbs缓冲液，过滤，4℃保存。

表1pbs缓冲液配置表

(2)检测方法

将精液样品充分混匀，吸取20μl样品精子用20μl的伊红染液于37℃恒温箱充分混匀染色，染色1min、3min、5min、10min、15min、20min，染色结束后混匀待测液，吸取15μl涂在载玻片上制作抹片，在显微镜下观察，随机选取多个视野拍照，统计死亡精子数和总精子数，不同染色时间下统计3组数据得出平均值，每组至少观察200个精子，求出精子活率。

(3)鉴定标准

活精子不被染色，成透明状；死精子被染成红色。

实验例3台盼蓝染色

(1)台盼蓝染液成分

称取0.4g台盼蓝，分别溶于50mlpbs，用滤纸过滤，4℃保存。使用时用pbs稀释至对应浓度。

(2)染色方法

将精液样品充分混匀，吸取20μl精子样品用20μl0.4％台盼蓝染液于37℃恒温箱充分混匀染色，分别在1min、3min、5min、10min、15min、20min时间下染色。染色结束后混匀待测液，吸取15μl涂在载玻片上制作抹片，在显微镜下观察，随机选取多个视野拍照，统计死亡精子数和总精子数，每种浓度在不同染色时间下统计3组数据得出平均值，每组至少观察200个精子，求出精子活率。

(3)鉴定标准

活精子不被染色并保持正常形态，成透明状，有光泽；死精子被染成蓝色并膨大，无光泽。

实验例4伊红-苯胺黑染色

(1)伊红-苯胺黑染液成分

称取1.34g伊红、2g苯胺黑，分别溶于50mlpbs，再将两份溶液混合均匀，用滤纸过滤，4℃保存。

(2)染色方法

将精液样品充分混匀，吸取20μl样品精子用20μl的伊红-苯胺黑染液于37℃恒温箱充分混匀染色，染色1min、3min、5min、10min、15min、20min，染色结束后混匀待测液，吸取15μl涂在载玻片上制作抹片，在显微镜下观察，随机选取多个视野拍照，统计死亡精子数和总精子数，不同染色时间下统计3组数据得出平均值，每组至少观察200个精子，求出精子活率。

(3)鉴定标准

活精子不被染色，成透明状；死精子被染成红色。

实验例5添加tris/bsa溶液优化的台盼蓝染色

(1)tris/bsa溶液成分：

表2三羟甲基氨基甲烷/牛血清白蛋白溶液成分

(2)方法步骤：

称取0.4g台盼蓝，分别溶于50mlpbs，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，用tris/bsa溶液稀释至浓度为0.4％。

取20μl精子样品与20μltris/bsa溶液稀释的台盼蓝染液于37℃恒温箱染色，染色1min、3min、5min、10min、15min、20min，染色结束后吸取15μl悬液涂在载玻片上，制作抹片，在显微镜下观察拍照，统计死亡精子数和总精子数统计3组数据得出平均值，每组至少观察200个精子，求出精子活率，制作精子活率曲线。

(3)鉴定标准

活精子不被染色并保持正常形态，成透明状，有光泽；死精子被染成蓝色并膨大，无光泽。

上述各实验例染色结束后统计样本精子活率，试验数据用“平均值±标准差”表示，使用spss软件进行方差分析，利用duncan单因素方差分析(p<0.05)。

各实验例的染色结果比较，具体如下：

1、tris/bsa+0.4％台盼蓝溶液(实验例5)与0.4％台盼蓝(实验例3)染色结果比较

使用tris/bsa+0.4％台盼蓝以及0.4％台盼蓝对精子进行活率分析(表3)。从表3中可见，与单独使用0.4％台盼蓝相比，使用tris/bsa后，所有时间点活率均下降。

表3tris/bsa+0.4％台盼蓝溶液与0.4％台盼蓝染色结果

注：小写字母代表同一试剂不同时间下的精子活率差异；大写字母代表同一时间下不同试剂的精子活率；溶液1为0.4％台盼蓝；溶液2为0.4％台盼蓝+tris/bsa。

2、tris/bsa+0.4％台盼蓝溶液(实验例5)与0.5％伊红(实验例2)染色结果比较

使用tris/bsa+0.4％台盼蓝以及0.5％伊红对精子进行活率分析(表4)。从表4中可见，与单独使用0.4％台盼蓝相比，使用tris/bsa后，所有时间点的活率均显著上升(p<0.05)。

表4tris/bsa+0.4％台盼蓝溶液与0.5％伊红染色结果

注：小写字母代表同一试剂不同时间下的精子活率差异；大写字母代表同一时间下不同试剂的精子活率。1为0.5％伊红；2为0.4％台盼蓝+tris/bsa。

3、tris/bsa+0.4％台盼蓝溶液(实验例5)与0.67％伊红+10％苯胺黑(实验例4)染色结果比较

使用tris/bsa+0.4％台盼蓝以及0.67％伊红+10％苯胺黑对精子进行活率分析(表5)。从表5中可见，使用tris/bsa后，与单独使用0.67％伊红+10％苯胺黑相比，所有时间点的活率均下降，除了5和15min时差异不显著，其他时间点均显著下降(p<0.05)。但是，从数据结果的稳定性来说，tris/bsa+0.4％台盼蓝要优于0.67％伊红+10％苯胺黑染色液，采用0.67％伊红+10％苯胺黑染色液的精子活率结果变异/误差较大。

表5tris/bsa+0.4％台盼蓝溶液与0.67％伊红+10％苯胺黑染色结果

注：小写字母代表同一试剂不同时间下的精子活率差异；大写字母代表同一时间下不同试剂的精子活率。1为0.67％伊红+10％苯胺黑；2为0.4％台盼蓝+tris/bsa。

4、tris/bsa+0.4％台盼蓝与0.4％台盼蓝、0.5％伊红和0.67％伊红+10％苯胺黑染色效果比较

使用本发明的精子质膜保护剂tris/bsa稀释染色液后，检测结果都更为稳定。随着染色时间的延长，精子活率虽有下降，但下降幅度不大，表明该精子质膜保护剂能有效保护精子质膜免受台盼蓝的毒害。

添加了精子质膜保护剂tris/bsa的台盼蓝染液组和未添加精子质膜保护剂的台盼蓝染液组的精子活率无显著差异，但是从染色效果(参见图4，a：0.4％台盼蓝+tris/bsa15min；b：0.4％台盼蓝15min；c：0.5％伊红3min；d：0.67％伊红+10％苯胺黑15min)来看，添加了精子质膜保护剂tris/bsa的台盼蓝染色组能够更加清晰地观察到精子头部染色情况。另外，用0.4％台盼蓝+tris/bsa进行检测，在显微镜下观察到精子凝聚成团的程度比直接使用0.4％台盼蓝染色时轻，精子分布更均匀。

利用0.5％伊红进行检测，在显微镜下观察，精子分布均匀，随着染色时间的延长，精子活率下降不明显。然而，有些精子染色后的状态并非典型的活精子或死精子的状态，在统计死精子数时不宜对该精子的死活进行判定，给试验结果带来误差。当伊红染色时间为5min时，检测所得的精子活率和不同染色时间组差异显著(p<0.05)。将台盼蓝+精子质膜保护剂tris/bsa组的染片与伊红组染片进行对比，发现台盼蓝+精子质膜保护剂tris/bsa组的染片效果更佳。

0.67％伊红+10％苯胺黑的染色效果优于伊红组，在显微镜下，精子分布均匀，可以清晰地观察到精子头部的染色情况，能够轻易地判断精子的死活，有利于快速地找到合适的视野。但是，这种染色方法存在抹片易快速干透的问题。抹片干透后，背景上出现明显的黑色颗粒物，影响对精子死活的判断。染色时间为5min和15min时的精子活率和其他组差异显著(p<0.05)。

本发明添加tris/bsa有效减少因台盼蓝染色剂对精子质膜的损伤而造成的误差，提高台盼蓝染液检测效果的准确性和稳定性，达到优化作用，效果表现在：(1)未加入缓冲液的台盼蓝配制一段时间后会有溶质析出，这会导致抹片后精子聚集成团，加入tris/bsa的台盼蓝染液溶质析出现象减弱，抹片后精子凝集成团的程度降低，更有利于计数观察；(2)使用伊红染液进行染色时，载玻片上染液干透速度快，干透后的抹片背景上有明显的颗粒物，影响观察计数。用台盼蓝+tris/bsa染液进行染色，载玻片上染液干透速度减慢，为操作人员寻找合适视野提供了更多时间；(3)使用台盼蓝+tris/bsa染液，随着染色时间的延长，精子活率降低的程度较直接使用台盼蓝染液染色时精子活率降低的程度轻。

综上所述，本发明的0.4％台盼蓝+tris/bsa的染色效果要优于0.4％台盼蓝、0.5％伊红以及0.67％伊红+10％苯胺黑，tris/bsa可以保护精子质膜，减轻台盼蓝对精子的毒害作用，这使得相同染色时间下检测所得的精子活率高于另外三种染液的检测结果。另外，tris/bsa可以改善台盼蓝使精子凝聚成团的现象，以及减慢抹片干透的速度。这样的染色效果更有利于找到合适的视野，并且缓慢干透的抹片可以为寻找视野预留更多的时间。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。