一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒及其制备方法与应用与流程

本发明涉及鱼类免疫检测技术领域，具体涉及一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术：

舒伯特气单胞菌(a.schubertii)气单胞菌科气单胞菌属，为革兰氏阴性、人-畜-鱼共患的条件下致病菌。舒伯特气单胞菌在5％绵羊血琼脂平板上呈灰白色菌落，直径为0.8-2.2mm，近圆形，光滑湿润，中部略微凸起，边缘整齐，β-溶血；lb肉汤培养基中舒伯特气单胞菌生长均匀浑浊，长时间培养后有絮状沉淀产生，可形成一层较厚的一摇即破的菌膜，其对甘露醇、蔗糖、吲哚表现为阴性，氧化酶、接触酶为阳性。

2009年6月到8月，舒伯特气单胞菌在我国湖北咸宁市乌鳢养殖池塘爆发，造成养殖乌鳢死亡，随后在广州、佛山等地患病杂交鳢体内检出舒伯特气单胞菌，通过回归实验发现，该菌株可以引起鳢科鱼类内脏(肝、脾、肾)出现明显的、柔软、平滑、边缘整齐的白色结节，结节呈现白色点状坏死、界限不明显，且形成时间短。取结节涂片镜检发现白点内含有大量革兰氏阴性短杆菌。舒伯特气单胞菌发病急，发病快，造成的随时巨大，是鳢科鱼类的主要病原菌，但是对其研究较少，缺少相应的抗体的检测手段。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，该试剂盒能够实现舒伯特气单胞菌抗体的快速检测，对该病的流行病学调查及防控具有重要意义。

本发明还提出一种上述试剂盒的制备方法。

本发明还提出上述试剂盒的应用。

根据本发明的第一方面实施方式的试剂盒，所述试剂盒包括乳胶凝集颗粒、阳性对照品和阴性对照品；所述乳胶凝集颗粒为破碎舒伯特气单胞菌的菌体蛋白致敏聚苯乙烯乳胶颗粒。

根据本发明实施方式的检测试剂盒，至少具有如下有益效果：该试剂盒可实现快速检测舒伯特气单胞菌抗体，对该病的流行病学调查及防控有重要意义；利用该试剂盒进行检测，反应时间短，操作简便，在临床快速诊断领域具有广阔的应用前景。

根据本发明的一些实施方式，所述阳性对照品为舒伯特气单胞菌免疫的鱼血清。

根据本发明的一些实施方式，所述阴性对照品为未免疫的鱼血清。

根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒还包括多孔板；优选地，所述多孔板为96孔板。

根据本发明的一些实施方式，所述多孔板选自v孔板、u孔板或平底板中的至少一种。

配制多孔板，以便于实现高通量快速检测，可在每个孔中加入不同量的待测样品，然后用排枪向每孔中加入相应体积的致敏乳胶，再将反应板置于振荡器中，震荡混匀，提升检测效率。

根据本发明第二方面实施方式的制备方法，包括乳胶凝集颗粒的制备步骤，具体包括：

s1、制备破碎舒伯特气单胞菌的菌体蛋白：取舒伯特气单胞菌全菌进行破碎处理，得所述菌体蛋白；

s2、制备乳胶凝集颗粒：取聚苯乙烯乳胶溶液与步骤s1制得的所述菌体蛋白发生致敏反应后，用质量浓度大于0.01％的封闭剂封闭，即得所述乳胶凝集颗粒。

根据本发明实施方式的制备方法，至少具有如下有益效果：本发明方案利用封闭剂对致敏后的乳胶颗粒进行封闭，使得制得的乳胶凝集颗粒的检测结果更准确可靠，实现水产养殖领域的临床样品快速检测，进而用于指导临床用药。

根据本发明的一些实施方式，所述步骤s2还包括对聚苯乙烯乳胶进行预处理的步骤。

根据本发明的一些实施方式，所述预处理包括取含有聚苯乙烯的乳胶溶液与胰蛋白酶溶液混合并用缓冲液i稀释，反应后，收集上清液，重悬，即得。

根据本发明的一些实施方式，上述反应是置于25℃～45℃(优选为37℃)下进行的。

用胰蛋白酶进行预处理，胰蛋白酶的处理是消化杂蛋白，避免出现非特异性凝集。

根据本发明的一些实施方式，所述缓冲液i为甘氨酸盐缓冲液i，所述甘氨酸盐缓冲液i的ph约为8.6，甘氨酸盐的浓度约为0.5mol/l。

根据本发明的一些实施方式，所述甘氨酸盐缓冲液i的制备方法如下：按每升溶液中含甘氨酸约186.7mmol、氢氧化钠约17.5mmol、氯化钠约290.6mmol、防腐剂(优选为叠氮化钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、proclin防腐剂中的至少一种)约15.4mmol的量称取制备原料，调控ph约为8.6，加水定容，即得。

根据本发明的一些实施方式，所述含有聚苯乙烯的乳胶溶液中聚苯乙烯的质量浓度为8％～12％(优选为9％～11％；更优选为10％)。

根据本发明的一些实施方式，所述聚苯乙烯乳胶溶液中聚苯乙烯的质量浓度为1.5～2.5％(优选为1.9％～2.1％；更优选为2％)。

根据本发明的一些实施方式，所述聚苯乙烯与胰蛋白酶的质量比例为(0.9～1.1):(0.9～1.1)；优选为1:1。

根据本发明的一些实施方式，所述胰蛋白酶溶液的制备步骤为取胰蛋白酶，用磷酸盐缓冲液(pbs)溶解得到。

根据本发明的一些实施方式，所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的质量浓度为8％～12％；优选为9％～11％；更优选为10％。

根据本发明的一些实施方式，所述pbs的ph约为7.4。

根据本发明的一些实施方式，所述步骤s2中致敏反应过程中，菌体蛋白浓度为0.001mg/l～1mg/l。

根据本发明的一些实施方式，所述步骤s2中致敏反应的温度为20℃～60℃；优选为25℃～50℃；更优选为25℃～45℃；进一步更优选为30℃～40℃；最优选为37℃。

根据本发明的一些实施方式，所述步骤s2中致敏反应的时间为0.5h～4h；优选为0.75h～2.5h；更优选为1h～2h。

根据本发明的一些实施方式，所述封闭剂选自牛血清白蛋白(bsa)、脱脂奶粉(优选地质量百分数约为5％)、酪蛋白、明胶和tween-20(优选地质量百分数为0.05～0.1％)中的至少一种。

根据本发明的一些实施方式，所述封闭剂的质量浓度为0.1％以上；优选为0.1％～3％；更优选为1％～2％。

根据本发明的一些实施方式，所述步骤s1具体为取舒伯特气单胞菌，用甘氨酸盐缓冲液ii重悬洗涤后，超声破碎后，制得所述菌体蛋白。

根据本发明的一些实施方式，所述甘氨酸盐缓冲液ii的ph约为8.2，甘氨酸盐的浓度约为0.05mol/l。

根据本发明的一些实施方式，所述甘氨酸盐缓冲液ii的制备方法为取甘氨酸盐缓冲液i稀释后得到。

通过优化乳胶凝集颗粒制备过程中致敏时间、温度及封闭剂的浓度、封闭时间、温度等参数显著提升了致敏乳胶试剂的敏感性和稳定性。

根据本发明的一些实施方式，所述制备方法还包括通过常规方法制备阳性及阴性对照品。

根据本发明第三方面实施方式上述试剂盒在检测舒伯特气单胞菌抗体分泌功能的产品中的制备中的应用。

根据本发明实施方式的应用，至少具有如下有益效果：该试剂盒使用操作简便，适合临床样品快速检测，其检测结果对鱼类诺卡氏菌病防治具有重要指导意义。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例二的高通量检测试剂盒的部分检测结果图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明的实施例一为：一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，由如下试剂组成：乳胶凝集颗粒、阳性对照品、阴性对照品和缓冲液。乳胶凝集颗粒为破碎舒伯特气单胞菌的菌体蛋白致敏聚苯乙烯乳胶颗粒。阳性对照品为乌鳢舒伯特气单胞菌阳性血清。阴性对照品为未免疫乌鳢阴性血清。

该试剂盒的制备方法如下：

1)试剂的配制及细菌的培养：

0.5mol/l甘氨酸盐缓冲液(ph为8.6)：甘氨酸7g、氢氧化钠0.35g、氯化钠8.5g、叠氮化钠0.5g，溶于400ml水，调整ph为8.6，加水定容至500ml。

0.05mol/l甘氨酸缓冲盐(ph为8.2)：取0.5mol/l甘氨酸缓冲盐20ml，加入150ml去离子水，调整ph为8.2，定容为200ml。

10wt％bsa：bsa10g，溶于100ml(0.05mol/l)甘氨酸缓冲盐，0.22μm过滤除菌，4℃保存。

10wt％胰蛋白酶：胰蛋白酶5g，溶于50mlpbs(ph为7.4)中，0.22μm过滤除菌，4℃保存备用。

将市购所得的舒伯特气单胞菌置于tsa培养基中按照常规方法进行培养。

2)菌体蛋白的制备：取培养后的舒伯特气单胞菌于8000rpm，离心2min，弃上清，用0.05mol/lph8.2甘氨酸缓冲溶液重悬，重复洗涤三次。采用超声破碎仪，300w，10s/10s，将细菌破碎20min。测定蛋白浓度，并将破碎的菌体蛋白稀释成1mg/ml。

3)乳胶凝集颗粒的制备：

a)聚苯乙烯乳胶溶液的制备：

i)稀释：取1ml10％聚苯乙烯乳胶，1ml10％胰蛋白酶加入至8ml0.5mol/l甘氨酸缓冲溶液中。

ii)处理：将混合液置于50℃水浴锅中，水浴20h，期间每隔6h摇匀一次。

iii)收集：孵育结束后，10000rpm，离心30min，去上清。

iv)重悬：将沉淀用0.5mol/l甘氨酸缓冲溶液悬浮配成2％聚苯乙烯乳胶溶液，终体积为5ml。

b)致敏反应：取上述操作制得的聚苯乙烯乳胶溶液与菌体蛋白2mg/l在37℃发生致敏反应(1h)后，用质量浓度为0.1％的封闭剂(bsa)封闭1h，即得乳胶凝集颗粒。

将上述操作制得的试剂盒用于抗体检测以验证其性能可靠性，操作如下：

取阳性血清(乌鳢舒伯特气单胞菌阳性血清)和阴性血清(与上述阳性血清相应种类的未免疫鱼血清)分别用pbs按体积比为1:20稀释后，加入乳胶凝集颗粒，观察溶液状态。

判断标准如下：

++++：100％凝集，全部乳胶凝集，颗粒集于液滴边缘，液体完全透明；

+++：75％凝集，大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊；

++：50％凝集，颗粒较细，液体较混浊；

+：25％凝集，少许凝集，液体混浊；

-：不凝集，液体呈均匀乳状混浊。

加入样品后，5min内出现两个++，判定结果为阳性；反应20min后再观察一次，若出现++，亦判定结果为阳性。

结果显示，溶液显示结果与已知一致。

本发明实施例二为：一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，其与实施例一的区别在于：还包括96孔v孔板。在每个孔中加入10μl、15μl、20μl、25μl待检测血清样品，然后用排枪向每孔中加入相应体积的致敏乳胶，将反应板放在96孔板振荡器上，震荡混匀。部分结果如图1所示。此外，还比对了u孔板和平底板。比对不同体积的反应体系发现，20μl的反应体系的反应情况与传统的平板凝集结果一致。在乳胶加入5min后观察一次凝集情况。在样品加入20min后再观察一次，以免漏检。通过比对发现，96孔v孔板更利于观察实验结果。该试剂盒可一次实现多个样品检测，实现高通量检测。

本发明实施例三为：一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体试剂盒的制备方法，其与实施例一的区别在于：致敏蛋白浓度不同。致敏蛋白浓度为0.001mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml，反应结束后4℃下10000g，离心30min，用pbs重悬，4℃冰箱过夜稳定。用制得的抗体试剂盒及实施例一制得的试剂盒共同对乌鳢舒伯特气单胞菌阳性血清、未免疫乌鳢阴性血清及pbs进行检测，将检测结果实施例一结果汇总如下表1所示。

表1不同致敏蛋白浓度制备的乳胶凝集效果检测结果表

从上表1中可以看出，当加入的蛋白量为1mg/ml时，结合效率达到最大，此时乳胶检测的灵敏度最高，稳定性最好，故选择该浓度为最佳致敏蛋白浓度。

本发明实施例四为：一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体试剂盒的制备方法，其与实施例一的区别在于：致敏时间和/或致敏温度不同。致敏温度为25℃、37℃或45℃及致敏时间为0.5h、1h、2h或4h，反应结束后4℃下10000g，离心30min，用pbs重悬，4℃冰箱过夜稳定。用制得的抗体试剂盒及实施例一制得的试剂盒共同对乌鳢舒伯特气单胞菌阳性血清、未免疫乌鳢阴性血清及pbs进行检测，将检测结果实施例一结果汇总如下表2所示。

表2不同致敏时间和温度制备的乳胶凝集效果检测结果表

从上表2可以看出，当在37℃结合1h，结合效率达到最大，乳胶敏感性最高，选择37℃作用1h作为最佳致敏温度和时间。

本发明实施例五为：一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体试剂盒的制备方法，其与实施例一的区别在于：封闭条件不同。封闭剂浓度为0％、0.01％、0.1％、1％或2％，封闭时间为0.5h、1h、2h。用制得的抗体试剂盒及实施例一制得的试剂盒共同对乌鳢舒伯特气单胞菌阳性血清、未免疫乌鳢阴性血清及pbs进行检测，将检测结果实施例一结果汇总如下表3所示。

表3不同封闭条件制备的乳胶的凝集效果检测结果表

从表3可以看出，当bsa浓度为1％，37℃封闭1h，封闭效果最好。故选用1％bsa37℃作用1h，作为最佳封闭条件。

本发明实施例六为：一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒的应用，将上述实施例1制得的试剂盒应用于舒伯特气单胞菌抗体检测，在与血清稀释不同倍数下的检测效果如下表4所示。

表4不同稀释倍数下的凝集效果检测结果表

上表中，阳性血清1、阳性血清2、阳性血清3均为乌鳢舒伯特气单胞菌阳性血清，来自于不同的乌鳢个体，阴性为未免疫的乌鳢血清。

从表4中可以看出，血清稀释1:640倍时仍能检测到舒伯特气单胞菌特异性抗体，表明本发明实施例制得的试剂盒敏感性较好；对于乌鳢血清稀释1280倍时仍能检测，表明该方法尤其对乌鳢具有较高的灵敏度。

本发明实施例七为：一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒的应用，将上述实施例一制得的试剂盒应用于抗体检测，为验证其对舒伯特气单胞菌抗体的特异性，还将上述乳胶与含有舒伯特气单胞菌抗体的阳性血清(乌鳢舒伯特气单胞菌阳性血清)、其他抗体的血清(加州鲈魳鱼诺卡氏菌阳性血清、乌鳢魳鱼诺卡氏菌阳性血清、海鲈魳鱼诺卡氏菌阳性血清、罗非鱼链球菌阳性血清、草鱼嗜水气单胞菌阳性血清)及阴性血清(未免疫的乌鳢血清)混合，观察凝集效果如下表5所示。

表5特异性试验结果

从表5可以看出，除乌鳢舒伯特气单胞菌阳性血清呈现阳性反应外，与海鲈魳鱼诺卡氏阳性血清、加州鲈魳鱼诺卡氏阳性血清、生鱼魳鱼诺卡氏阳性血清、罗非鱼链球菌阳性血清、草鱼嗜水气单胞菌阳性血清均不凝集。

本发明实施例八为：一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒的应用，将上述实施例一制得的试剂盒应用于抗体检测，为验证其对舒伯特气单胞菌抗体检测效果的可靠性，乌鳢舒伯特气单胞菌疫苗免疫的血清40份样品以及未免疫的乌鳢血清40份进行检测。

本发明对比例一为：一种舒伯特气单胞菌抗体的检测方法，参照常规技术采用血清中和试验在同等条件下对对舒伯特气单胞菌疫苗免疫的乌鳢血清40份样品以及未免疫的乌鳢血清40份进行检测。

血清中和试验(微量凝集反应)的具体实验过程如下：

1.将舒伯特气单胞菌培养至对数期，并计数。

2.取96孔v型凝集板中，每孔加入50ulpbs缓冲溶液，然后再第一排每孔加入50ul不同免疫条件制备的血清，用移液器吸取混合均匀后，吸取50ul加入下一孔中，以此类推进行2倍梯度稀释，将从第11排每孔中吸取的20ul混合液弃之，然后向96孔凝集板各孔中加入50ul，浓度为4*10⁶cfu/ml的舒伯特气单胞菌，将凝集板用保鲜膜包裹，置于37℃培养箱中孵育18h.

3.实验结果判断标准：肉眼观察，若v型孔底部沉淀的边缘为不规则锯齿状，则判定为阳性反应，若v型孔底部沉淀为轮廓规则清晰光滑的圆形，则判定为阴性反应。

实施例八及对比例一的检测结果汇总如下表6所示。

表6

从表6可以看出，实施例制得的乳胶检测试剂该乳胶检测试剂检测出乌鳢血清阳性样品39份，阳性检出率为97.5％；乌鳢血清阴性样品41份，阴性检出率为100％；与血清中和试验结果相比较，总符合率为98.75％。

上述实施例中，胰蛋白胨大豆琼脂(tsa)和胰蛋白胨大豆肉汤(tsb)培养基均可购自广东环凯微生物科技有限公司；10％聚苯乙烯乳胶购自大鹅(天津)科技有限公司；舒伯特气单胞菌及对照血清(乌鳢舒伯特气单胞菌阳性血清、加州鲈魳鱼诺卡氏菌阳性血清、乌鳢魳鱼诺卡氏菌阳性血清、海鲈魳鱼诺卡氏菌阳性血清、罗非鱼链球菌阳性血清、草鱼嗜水气单胞菌阳性血清和未免疫的乌鳢血清)均为中国水产科学研究院珠江水产研究所赠与(其他人亦可请求其赠与或从其他途径购买或自制，若需自制则参照常规制备抗体的方法即可，具体为：将细菌破碎，弗氏佐剂乳化后免疫鱼，间隔两周后弗氏不完全佐剂乳化后再次免疫后制备的血清，即得)，其他化学试剂均购自天津化学试剂厂。

乳胶凝集试验是凝集抗原(或抗体)与相应抗体(或抗原)结合，在适当电解质存在条件下，形成肉眼可见的凝集现象。乳胶凝集试验是以乳胶作为载体的间接凝集试验，反应时间短，操作简便，在临床快速诊断领域广阔的应用前景。试验发现致敏乳胶试剂的敏感性和稳定性和致敏时间、致敏温度、致敏蛋白浓度以及封闭剂的浓度、封闭时间和封闭温度有较大的关系。通过优化这些条件，建立了一种可快速检测舒伯特气单胞抗体的检测方法。并将乳胶凝集试验反应体系放在96孔v形板中进行，该方法操作简单，适合临床样品快速检测，指导临床用药。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。