对真菌毒素进行定量检测的方法与流程

1.本发明涉及分析化学领域，具体地，涉及对真菌毒素进行定量检测的方法。


背景技术：

2.山银花大多生长种植于南方多雨地区，气温偏高，每年六月到七月采收，值南方降雨量高峰期，鲜花干燥不及时或贮藏运输条件不当极易发霉而产生真菌毒素毒素类有毒化合物。
3.由此，对于山银花中真菌毒素检测的方法有待研究和改进。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种简便、快速、准确的对真菌毒素进行定量检测的方法，样品加乙腈水溶液提取，psa净化，过滤后上机检测。可以应用于山银花药材及相关产品的中真菌毒素毒素的检测，为中药材质量控制提供参考。
5.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种对真菌毒素进行定量检测的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将样品进行干燥粉碎处理，以便得到样品粉末；将所述样品粉末与乙腈涡旋混匀，超声提取，加0.2g psa净化，涡旋混匀2min，离心，以便得到净化提取物；将所述净化提取物进行复溶处理，以便得到待测液；以及将所述待测液进行色谱
‑
质谱联用检测，以便获得所述真菌毒素含量。
6.根据本发明实施例的对真菌毒素进行定量检测的方法，具有高选择性、高灵敏度、定性定量分析准确等特点。样品前处理简单、节约时间和成本，可提高工作效率。
7.另外，根据本发明上述实施例的对真菌毒素进行定量检测的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
8.根据本发明的实施例，在所述涡旋混匀前，将所述样品粉末与同位素标记内标物混合。
9.根据本发明的实施例，所述样品粉末与乙腈的质量体积比为1g∶10ml。
10.根据本发明的实施例，所述色谱
‑
质谱联用检测的色谱条件为：色谱柱：安捷伦sb
‑
c18色谱柱，2.1
×
50mm，1.8μm；柱温25℃；流动相流速为0.2ml/min；进样量为5μl。
11.根据本发明的实施例，所述色谱
‑
质谱联用检测的色谱流动相为：a相为0.1％甲酸水溶液，b相为甲醇。
12.根据本发明的实施例，所述色谱
‑
质谱联用检测的色谱梯度洗脱程序如下：0～5min，20％～60％b。
13.根据本发明的实施例，所述色谱
‑
质谱联用检测的质谱条件为：电喷雾电离源(esi)：正离子模式(esi
+
)；多反应监测模式(mrm)；三重四级杆质量分析器；碎裂电压：380v；干燥气温度：250℃，干燥气流量：14l/min；鞘气温度：250℃，鞘气流量：11l/min；喷嘴电压：2000v；驻留时间：65ms。
14.根据本发明的实施例，所述真菌毒素为黄曲霉毒素。
15.根据本发明的实施例，所述样品为山银花药材。
16.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
17.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
18.图1显示了根据本发明一个实施例的4种黄曲霉毒素的mrm色谱示意图；
19.图2显示了根据本发明一个实施例的黄曲霉毒素b1的前体离子扫描示意图；
20.图3显示了根据本发明一个实施例的黄曲霉毒素b1的前体离子扫描示意图；
21.图4显示了根据本发明一个实施例的黄曲霉毒素b2主要碎片的可能裂解途径示意图；
22.图5显示了根据本发明一个实施例的黄曲霉毒素g1主要碎片离子的可能裂解途径示意图；
23.图6显示了根据本发明一个实施例的黄曲霉毒素g2主要碎片的可能裂解途径示意图。
具体实施方式
24.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
25.需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
26.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种对真菌毒素进行定量检测的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将样品进行干燥粉碎处理，以便得到样品粉末；将所述样品粉末与乙腈涡旋混匀，超声提取，加0.2g psa净化，涡旋混匀2min，离心，以便得到净化提取物；将所述净化提取物进行复溶处理，以便得到待测液；以及将所述待测液进行色谱
‑
质谱联用检测，以便获得所述真菌毒素含量。
27.根据本发明实施例的对真菌毒素进行定量检测的方法，具有高选择性、高灵敏度、定性定量分析准确等特点。样品前处理简单、节约时间和成本，可提高工作效率。
28.根据本发明的实施例，在所述涡旋混匀前，将所述样品粉末与同位素标记内标物混合。由此，检测的准确性高。
29.根据本发明的实施例，所述样品粉末与乙腈的质量体积比为1g∶10ml。由此，有利于充分提取化合物。
30.根据本发明的实施例，所述色谱
‑
质谱联用检测的色谱条件为：色谱柱：安捷伦sb
‑
c18色谱柱，2.1
×
50mm，1.8μm；柱温25℃；流动相流速为0.2ml/min；进样量为5μl。由此，检
测的准确度和灵敏度高。
31.根据本发明的实施例，所述色谱
‑
质谱联用检测的色谱流动相为：a相为0.1％甲酸水溶液，b相为甲醇。由此，待测化合物体系中响应高。
32.根据本发明的实施例，所述色谱
‑
质谱联用检测的色谱梯度洗脱程序如下：0～5min，20％～60％b。由此，待测化合物的分离效果好，出峰时间适宜，峰型好。
33.根据本发明的实施例，所述色谱
‑
质谱联用检测的质谱条件为：电喷雾电离源(esi)：正离子模式(esi
+
)；多反应监测模式(mrm)；三重四级杆质量分析器；碎裂电压：380v；干燥气温度：250℃，干燥气流量：14l/min；鞘气温度：250℃，鞘气流量：11l/min；喷嘴电压：2000v；驻留时间：65ms。由此，检测的准确度和灵敏度高。
34.根据本发明的实施例，所述真菌毒素为黄曲霉毒素。
35.根据本发明的实施例，所述样品为山银花药材。
36.下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
37.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自sigma公司。
38.实施例1
39.利用本发明实施例的方法对山银花药材中的黄曲霉毒素进行检测，具体如下：
40.1、实验方法
41.1.1样品前处理
42.将山银花药材干燥、打碎、过筛，精密称取药材粉末0.5g，加入浓度为10μg/kg的黄曲霉毒素g2 13
c
17
内标物，再加入60％乙腈5ml后涡旋混匀，超声提取10min，加0.2g psa净化，涡旋混匀2min，离心(8000rps/min，10min)，取上清液，氮气吹至近干，20％甲醇复溶并定容到2ml，过滤，上机检测。
43.1.2测定方法
44.1.2.1色谱条件
45.色谱柱：安捷伦sb
‑
c18色谱柱(2.1
×
50mm，1.8μm)；柱温25℃；流动相a相为0.1％甲酸，b相为甲醇，流速为0.2ml/min，梯度洗脱程序如下：0～5min，20％～60％b；进样量为5μl。
46.1.2.2质谱条件
47.电喷雾电离源(esi)：正离子模式(esi
+
)；多反应监测模式(mrm)；三重四级杆质量分析器；碎裂电压：380v；干燥气温度：250℃，干燥气流量：14l/min；鞘气温度：250℃，鞘气流量：11l/min；喷嘴电压：2000v。驻留时间：65ms。各化合物质谱分析参数见表1。
48.表1 四种黄曲霉毒素的质谱分析参数
[0049][0050]
*定量离子
[0051]
*quantitative ion
[0052]
1.2.3基质效应
[0053]
取未被黄曲霉毒素污染的山银花药材，按上述提取方法制备空白基质溶液，分别用纯溶剂和空白基质溶液配制相同浓度的黄曲霉毒素溶液，在1、10、100μg/l作为低、中、高3个添加浓度下考察基质效应，按照3.2.3分析方法进行上机检测，按照公式(1)计算基质效应。其中am为基质中目标化合物的响应，as为纯溶剂中目标物的响应。
[0054]
mi(％)＝am/as
×
100％
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
[0055]
2结果与讨论
[0056]
2.1色谱条件优化
[0057]
实验考察了sb
‑
c18柱和苯基柱，四种化合物在苯基柱上保留均较弱，而在sb
‑
c18上有较好的保留和分离效果，且保留时间超过两分钟时可与基质完全分离，降低基质效应，提高定性定量的准确性。故选择agilent sb
‑
c18超高效液相色谱柱。另外，还考察了不同流动相组成对四种黄曲霉毒素分离及响应的影响。分别比较了甲醇、乙腈作为有机相，水、0.1％甲酸作为水相时的分离度和响应，其中目标物在甲醇
‑
0.1％甲酸体系中响应最高。具体原因分析如下：目标物为正离子模式下电离，而甲酸有利于目标物电离形成正离子，可以显著提高离子化效率，而甲醇为质子型溶剂，同样可以促进目标物电离。图1为优化条件下基质加标及相应空白基质溶液中4种黄曲霉毒素的mrm色谱图(右)。
[0058]
2.2质谱条件优化及裂解规律
[0059]
在优化质谱采集参数过程中，分别对比了正离子模式和负离子模式下各目标物的响应，发现正模式下各物质响应均高于负模式。关于母离子的选择，各目标物均可形成[m+h]
+
、[m+na]
+
及[m+k]
+
三种母离子，其中，如图2所示，[m+na]
+
丰度最大，但是形成钠加合物之后离子的稳定性显著提高，在产物离子模式下不易形成稳定的碎片离子，各碎片离子丰度明显低于[m+h]
+
的碎片离子丰度，故选择[m+h]
+
加和形式为前体离子。
[0060]
黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2四种化合物均为二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。化合物中有苯甲醚的结构，键能较低，很容易失去一个甲基([m+h
‑
ch3]
+
，313＞298，m/z，步骤1)。黄曲霉毒素b1结构中有内酯的结构，容易发生中性丢失，失去一个co2([m+h
‑
co2]
+
，313＞269，m/z，步骤3)。另外，脂环酮经过α断裂和i断裂，引起环开裂后发生中性丢失(
‑
co)，此过程在图中2、4、5步均存在，且在第2、5过程中由于产生游离基，可能会发生闭环反应。步骤4反应中由于空间位阻过大，闭环反应较难发生。图3为黄曲霉毒素b1的主要碎片离子的可能裂解途径。
[0061]
黄曲霉毒素b2结构与黄曲霉毒素b1相似，也可以形成中性丢失的产物，失去一个co2([m+h
‑
co2]
+
，315＞271，m/z，步骤4)。但在呋喃环上一侧双键饱和，裂解过程显示出一定差异。四氢呋喃环容易发生断裂，所以开环产物丰度相对较高，并可以形成脱水产物(315＞297，[m+h
‑
h2o]
+
，m/z，步骤3)和脱去亚乙基的产物(315＞287，[m+h
‑
c2h4]
+
，m/z，步骤2)，并形成碳正离子，分别为伯、仲碳正离子，后者相对更稳定，丰度较前者高。图4为黄曲霉毒素b2主要碎片的可能裂解途径。
[0062]
黄曲霉毒素g1主要碎片离子的可能裂解途径见图5。黄曲霉毒素g1、g2与上述两种物质结构类似，但这两种物质结构中存在两个内酯的结构。酯键的键能低，两个酯键均容易断裂。经步骤1脱水可形成三个双键，即稳定的π
‑
π共轭结构。形成的碎片离子经中性丢失([m+h
‑
co]
+
，311＞283，m/z，步骤2)形成丰度较高的离子283(m/z)，或失去一个中性分子co2(311＞267，m/z，步骤3)。另外，杂萘环中的内酯键也容易发生断裂(步骤4)，形成的碎片离子中存在一个活泼α
‑
h，链接两个羰基(吸电子基)，可诱导碎片离子发生i
‑
断裂(步骤5)，经过电子转移及电荷中心诱导的键断裂(步骤6)，形成质荷比为243的碎片离子，为黄曲霉毒素g1质谱图基峰。
[0063]
黄曲霉毒素g2主要碎片的可能裂解途径如图6。其中，碎片离子313和285(m/z)理论上有两种可能的生成途径，分别为四氢呋喃环的断裂脱水、脱亚乙基，以及内酯环的断裂脱水、脱羰基。这两种途径与上述几种物质相似，且理论上均可发生。另外，碎片离子245(m/z)是黄曲霉毒素g2的丰度最高的子离子，且响应较为稳定。形成[m+h]
+
的准分子离子峰，经i断裂使四氢呋喃环开环，再经由仲碳正离子重排为叔碳正离子形成更为稳定的结构，后经i断裂失去一个羟基四氢呋喃，形成质荷比为245(m/z)的碎片离子。
[0064]
黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2四种物质结构相似，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。四种化合物在裂解过程中均易发生中性丢失，失去co、co2、h2o等小分子化合物。另外，在四个化合物的质谱图中，都会出现两个相同的碎片离子，质核比为115、128(m/z)。这两个共有碎片离子对于未知潜在有害物的无目标筛查具有一定的指导意义。
[0065]
2.3基质效应
[0066]
实验选用黄曲霉毒素g2 13
c
17
为
13
c稳定同位素内标，用于校正前处理及检测过程中目标物的损失。内标物各待测物在定性定量离子通道无干扰，因为此化合物为人工合成，自然界中并不存在，所以不会对待测物的检测产生影响。实验中的四个化合物结构类似，故选用一种同位素消除干扰即已足够。由于山银花药材中绿原酸类化合物具有较高的含量，而psa对多酚酸具有显著的吸附性能，可用于降低检测中的基质效应，所以前处理过程中加入0.2g psa对提取液进行净化。
[0067]
2.4方法学验证
[0068]
2.4.1线性关系、检出限(lod)和定量限(loq)
[0069]
基质对于目标物检测具有显著影响，故选用基质加标的方法尽力基质匹配标准曲线用于定量分析。配制质量浓度为100～0.1μg/l的混合溶液，以目标物峰面积为纵坐标(y)，对应的质量浓度为横坐标(x)，得标准曲线。检出限和定量限分别为信噪比为3和10时目标物的含量，结果如表2所示。
[0070]
表2 4种黄曲霉毒素的线性回归方程、线性范围、相关系数、及检出限和定量限
[0071][0072]
2.4.2加标回收率和精密度
[0073]
以各化合物的1倍、2倍、4倍定量限为空白样品加标水平，每个添加水平做五组平行实验，按照3.2.2及3.2.3的提取分析方法进行检测，回收率结果及相对标准偏差如表3所示。
[0074]
表3 4种化合物的加标回收率及相对标准偏差(n＝6)
[0075][0076]
2.5实际样品分析
[0077]
应用所建立的uhplc
‑
ms/ms方法对市场上的11个山银花药材样品进行检测，结果表明，11个山银花药材中有一个样品中检出黄曲霉毒素b2 5.1μg/kg，其余样品均为阴性，均未超出药典要求。
[0078]
综上所述，本发明实施例的方法建立了uhplc
‑
ms/ms法对山银花药材中黄曲霉毒素进行检测，并对四种黄曲霉毒素的质谱裂解途径以及主要质谱碎片进行了探讨和研究。该方法具有高选择性、高灵敏度、定性定量分析准确等特点。样品前处理简单、节约时间和成本，可提高工作效率。同时，可通过对目标物特征碎片监测在无标准品条件下实现药材的黄曲霉毒素污染的分析。实验中检出一个阳性样本，建议加强药材在干燥、运输、贮藏过程中的监管。
[0079]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0080]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。