本发明涉及的是一种中药检测领域的技术，具体是一种急支糖浆多指标成分定量检测方法。
背景技术：
：急支糖浆的组成药味为四季青、金荞麦、鱼腥草、麻黄、紫菀、前胡、枳壳、甘草，具清热化痰、宣肺止咳之功，用于外感风热所致的咳嗽。现有技术中针对急支糖浆的质量检测技术，仅有2020版《中国药典》中含量测定项以柚皮苷作为测定指标，无法对急支糖浆进行全面质量控制检测。技术实现要素：本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种急支糖浆多指标成分定量检测方法，操作简单、方便高效、专属性强、稳定性、重复性好，能够全面有效地评价急支糖浆的质量，确保临床使用安全有效。本发明是通过以下技术方案实现的：本发明涉及一种急支糖浆多指标成分定量检测方法，通过一标多测法测定急支糖浆中的原儿茶酸、盐酸麻黄碱、新绿原酸、对羟基苯甲酸、柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸、白花前胡甲素的含量，具体为：以急支糖浆样品溶液和柚皮苷对照品溶液，注入hplc中进行检测，通过外标一点法计算急支糖浆中柚皮苷的含量c柚，然后根据已测得的柚皮苷保留时间，通过相对保留时间rtr计算供试品溶液中的盐酸麻黄碱、原儿茶酸、新绿原酸、对羟基苯甲酸、新橙皮苷、甘草酸、白花前胡甲素的保留时间，定位待测指标成分峰，从而记录峰面积；根据已测得的柚皮苷的含量，通过相对校正因子fi/s计算急支糖浆中盐酸麻黄碱、原儿茶酸、新绿原酸、对羟基苯甲酸、新橙皮苷、甘草酸、白花前胡甲素的含量，实现多指标成分含量测定，即：c测＝fi/s测*c柚*a测/a柚，c测为待测指标成分在急支糖浆的含量，fi/s测为待测指标成分的相对校正因子参数，c柚为急支糖浆中柚皮苷的含量，a测为急支糖浆样品中待测指标成分峰面积，a柚为急支糖浆样品中柚皮苷的峰面积。所述的急支糖浆样品溶液是指：将急支糖浆充分振摇混匀，精密量取1ml，用酸水(含0.1％三乙胺、0.095％磷酸)定容到10ml容量瓶中，混匀，10000r/min离心10min，取上清液，滤过，弃去初滤液，以续滤液作为急支糖浆样品溶液。所述的柚皮苷对照品溶液是指：精密称取品柚皮苷制备成1mg/ml的对照品溶液。优选地，所述的急支糖浆样品溶液的制备中所用的酸水中磷酸的比例为0.08％～0.11％，优选为0.095％。优选地，所述的急支糖浆样品溶液的制备中采用0.22μm的水针式过滤器。优选地，所述的hplc色谱条件为：采用c18色谱柱；以0.08％～0.11％磷酸-0.1％三乙胺-水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b；检测波长：210、254、280、320nm；柱温：20℃-35℃；流速：0.8ml·min-1-1.2ml·min-1；进样量：6-12μl；梯度洗脱，洗脱程序为：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0-79557-2095→935→720-2193→827→1821-35821835-4582→8018→2045-5580→4020→6055-6540→560→95优选地，所述的c18色谱柱为agilentzorbaxeclipseplusc18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，shimadzuvp-ods(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，agilentzorbaxsb-c18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，ymc-packods-a(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；优选地，所述的盐酸麻黄碱、原儿茶酸、新绿原酸、对羟基苯甲酸、新橙皮苷、甘草酸、白花前胡甲素相对于内参物柚皮苷的相对保留时间rtr分别优选为0.307、0.340、0.461、0.576、1.154、1.387、1.576。所述的盐酸麻黄碱、原儿茶酸、新绿原酸、对羟基苯甲酸、新橙皮苷、甘草酸、白花前胡甲素相对于内参物柚皮苷的相对校正因子fi/s分别优选为0.857、0.587、0.616、0.295、0.914、2.213、0.416。技术效果本发明整体解决了技术中急支糖浆药典含量测定方法检测成分单一、需要标准品数量繁多，不适合实际工业生产的质量控制环节的问题。与现有技术相比，本发明仅使用柚皮苷一种对照品即可同时检测急支糖浆中的8个指标成分，检测结果稳定性好、精密度高、重复性优异、操作简单快速，同时覆盖全处方药味，含有可归属单一中药的5个特征性指标。可缓解对照品的紧缺和检测费的高昂的问题，节约了耗材，提高了检测效率，节省了人工成本，适用于实际生产过程的质量控制环节。具体实施方式本实施例采用的急支糖浆具体为太极集团重庆涪陵制药厂有限公司生产的产品，其处方配比和制备方法在2020版《中国药典》有明确的限定，本发明定量的指标成分归属及检测波长，如表1所示。表1为8个指标成分归属药味及检测波长说明。基于前期对不同高效液相色谱系统及不同厂家的c18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)进行考察，结果显示该含量测定方法重现性良好。最终选择进样量、流速、柱温的相对校正因子结果的平均值作为急支糖浆的相对校正因子参数：f盐酸麻黄碱/柚皮苷＝0.857，f原儿茶酸/柚皮苷＝0.587，f新绿原酸/柚皮苷＝0.616，f对羟基苯甲酸/柚皮苷＝0.295，f新橙皮苷/柚皮苷＝0.914，f甘草酸/柚皮苷＝2.213，f白花前胡甲素/柚皮苷＝0.416。最终确定相对保留时间参数：r盐酸麻黄碱/柚皮苷＝0.307，r原儿茶酸/柚皮苷＝0.340，r新绿原酸/柚皮苷＝0.461，r对羟基苯甲酸/柚皮苷＝0.576，r新橙皮苷/柚皮苷＝1.154，r甘草酸/柚皮苷＝1.387，r白花前胡甲素/柚皮苷＝1.576。实施例1取19040073、19040074、19040075、19040077、19040079共5批次样品。1)急支糖浆样品制备：将急支糖浆充分振摇混匀，精密量取1ml，用酸水(含0.1％三乙胺、0.095％磷酸)定容到10ml容量瓶中，混匀，10000r/min离心10min，取上清液，过滤，弃去初滤液，以续滤液作为急支糖浆样品溶液。2)对照品溶液制备：精密称取品柚皮苷制备成1mg/ml的对照品溶液。3)色谱条件：色谱柱：agilentzorbaxeclipseplusc18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；流动相：0.095％磷酸-0.1％三乙胺-水溶液(a)-乙腈(b)；检测波长：210、254、280、320nm；柱温：30℃；流速：1ml/min；进样量：10μl；洗脱梯度表见表2。表2急支糖浆一标多测含量测定梯度洗脱表4)样品测定：通过对柚皮苷对照品进行含量测定，通过外标一点法计算得急支糖浆中柚皮苷含量；通过“t测＝rt测*t柚”依据相对保留时间比值(rtr)和急支糖浆样品溶液中柚皮苷的保留时间定位各待测组分的色谱峰位置；依据相对校正因子(fi/s)参数和急支糖浆样品溶液中柚皮苷浓度，通过“c测＝fi/s测*c柚*a测/a柚”公式计算得各急支糖浆中盐酸麻黄碱、原儿茶酸、新绿原酸、对羟基苯甲酸、新橙皮苷、甘草酸、白花前胡甲素的含量。5)通过外标一点法和一标多测法测5批次柚皮苷、盐酸麻黄碱、原儿茶酸、新绿原酸、对羟基苯甲酸、新橙皮苷、甘草酸、白花前胡甲素，含量分别为1001.3～1087.3μg/ml、121.0～134.5μg/ml、736.2～866.3μg/ml、156.5～205.5μg/ml、48.6～54.7μg/ml、459.5～500.9μg/ml、83.8～98.9μg/ml、18.8～21.3μg/ml。实施例2取19040081、19040086、19040088、19040089、19040090共5批次样品。1)急支糖浆样品制备：同实施例12)对照品溶液制备：同实施例13)色谱条件：色谱柱：ymc-packods-a(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；流动相：0.095％磷酸-0.1％三乙胺-水溶液(a)-乙腈(b)；检测波长：210、254、280、320nm；柱温：35℃；流速：0.9ml/min；进样量：8μl；洗脱梯度表见表2。4)待测样品一标多测法含量计算：同实施例1。5)通过外标一点法和一标多测法测5批次柚皮苷、盐酸麻黄碱、原儿茶酸、新绿原酸、对羟基苯甲酸、新橙皮苷、甘草酸、白花前胡甲素，含量分别为912.4～1056.8μg/ml、133.1～150.0μg/ml、920.2～992.9μg/ml、325.0～363.6μg/ml、43.1～47.7μg/ml、421.4～489.3μg/ml、92.5～154.0μg/ml、23.0～25.8μg/ml。实施例3取19040097、19040098、190400101、190400114、190400116共5批次样品。1)急支糖浆样品制备：同实施例12)对照品溶液制备：同实施例13)色谱条件：色谱柱：shimadzuvp-ods(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；流动相：0.095％磷酸-0.1％三乙胺-水溶液(a)-乙腈(b)；检测波长：210、25、280、320nm；柱温：25℃；流速：1.1ml/min；进样量：12μl；洗脱梯度表见表2。4)待测样品一标多测法含量计算：同实施例1。5)通过外标一点法和一标多测法测5批次柚皮苷、盐酸麻黄碱、原儿茶酸、新绿原酸、对羟基苯甲酸、新橙皮苷、甘草酸、白花前胡甲素，含量分别为1004.2～1069.3μg/ml、119.1～144.8μg/ml、678.7～852.7μg/ml、141.6～189.3μg/ml、48.2～56.4μg/ml、456.8～483.9μg/ml、101.6～124.7μg/ml、16.7～18.9μg/ml。表3一标多测法与外标法测定结果对比(n＝15)，单位(μg/ml)；相对误差＝(一标多测法值-外标法值)/外标法值。综上所述的，本方法采用高效液相色谱法(hplc)建立了急支糖浆一标多测(qams)含量测定方法，此方法通过对提取方法、柱温、色谱条件、洗脱梯度等方面的考察，建立了急支糖浆8个指标成分同时测定的液相色谱方法。以柚皮苷为内参物，通过对进样量、流速、柱温三个参数条件考察确定了相对校正因子，采用一标多测法建立了盐酸麻黄碱、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、新绿原酸、新橙皮苷、甘草酸和白花前胡甲素这7个指标成分的含量测定方法；此7种指标成分的相对校正因子(fi/s)分别为f盐酸麻黄碱/柚皮苷＝0.850，f原儿茶酸/柚皮苷＝0.582，f新绿原酸/柚皮苷＝0.609，f对羟基苯甲酸/柚皮苷＝0.293，f新橙皮苷/柚皮苷＝0.913，f甘草酸/柚皮苷＝2.170，f白花前胡甲素/柚皮苷＝0.417；相对保留时间(rtr)分别为r盐酸麻黄碱/柚皮苷＝0.307，r原儿茶酸/柚皮苷＝0.340，r新绿原酸/柚皮苷＝0.461，r对羟基苯甲酸/柚皮苷＝0.576，r新橙皮苷/柚皮苷＝1.154，r甘草酸/柚皮苷＝1.387，r白花前胡甲素/柚皮苷＝1.576。三个实施例采用一标多测法共测定15批次的急支糖浆中8个指标成分的含量，比较一标多测法与外标法的含量测定值，相对误差值均小于4.0％，具体结果见表3。三个实施例所测15批急支糖浆中盐酸麻黄碱、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸、白花前胡甲素的含量波动范围在平均值的70％-130％，相对稳定，且含量分别不少于110μg/ml、650μg/ml、40μg/ml、900μg/ml、400μg/ml、80μg/ml、15μg/ml；其中新绿原酸含量波动范围达到平均值的60％-160％，含量不少于135μg/ml。实验结果表明一标多测(qams)方法准确度高、成本低，可更全面地反映急支糖浆的内在品质，为全面提升首急支糖浆质量标准检测提供技术依据。与现有技术相比，本方法含量测定同时覆盖全处方药味，含有可归属单一中药的5个特征性指标；操作简单，仅使用柚皮苷一种对照品即可同时检测急支糖浆中的8个指标成分。本发明中，所建立的一标多测含量测定方法中，所建立的色谱条件和相对校正因子(fi/s)参数对技术效果给出最大贡献，通过校正因子(fi/s)参数可以快速计算出急支糖浆中各指标成分的含量，简单快捷，且与外标法含量测定结果比较，相对误差小于4％，准确性高。同时通过15批急支糖浆的8个指标成分的含量测定，给出了各指标成分的最低含量，盐酸麻黄碱、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸、白花前胡甲素、新绿原酸的含量分别不少于110μg/ml、650μg/ml、40μg/ml、900μg/ml、400μg/ml、80μg/ml、15μg/ml、135μg/ml，为工业化生产急支糖浆的质量控制检测提供了参考依据。上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。当前第1页12