一种血小板抗体特异性流式检测试剂盒的制作方法

[0001]
本实用新型属于生物检测试剂盒技术领域，具体涉及一种血小板抗体特异性流式检测试剂盒。


背景技术：

[0002]
血小板抗体是患者在输血、妊娠或移植等过程中接触外来血小板抗原所产生的致病性抗体，可致敏血小板并使其遭破坏，引起血小板减少，导致血小板输注无效症（plalelet transfusion refractoriness, ptr），胎母同种异体免疫血小板减少症（foetal-maternal alloimmune thromlocyte penia, fmait），输血后紫癜（post transfusion purpura, ptp），以及移植相关同种异体免疫血小板减少症（transplantation-associated alloimmune thrombocytopenia, taat）等多种病症，患者易出现淤点、瘀斑及出血等症状，严重者甚至会发生死亡。免疫性疾病患者在机体免疫系统紊乱的情况下亦可产生针对自身血小板的抗体，导致自身免疫性血小板减少症（idiopathic thrombocytopenia, itp）。血小板抗体包括抗hlaⅰ类抗体及抗血小板糖蛋白或hpa抗体。临床血小板相关免疫性疾病患者体内通常能检出抗hla
ꢀⅰ
类抗体。但血小板更多的是由hlaⅰ类抗体和抗gp或hpa抗体等多种抗体共同作用，包括抗hla
ꢀⅰ
、抗gp
ꢀⅱ
b/ⅲa、抗gp
ꢀⅰ
a/ⅱa、抗gp
ꢀⅰ
b/
ⅸ
、抗cd109抗体。
[0003]
流式细胞术是近些年发展起来的新技术，能够对一个样本进行多参数高通量检测，检测速度快、精度高、准确性好。cba（cytometric bead array）即微量样本多指标流式蛋白定量技术，是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。cba是流式细胞术的进阶版，利用微小、分散的颗粒捕获液体待测物，并利用流式细胞仪检测类似“三明治”的颗粒—“捕获微球-待测物-检测抗体夹心复合物”所散发的荧光，从而测定待测物的数量，这种方法对样本需求量更少，检测更快速、更准确。
[0004]
目前，已有的检测血小板抗体方法和试剂盒主要针对患者体内的自身血小板抗体，即与患者血小板表面抗原结合的抗体。该检测方法主要应用在自身免疫性血小板减少症患者体内的自身血小板抗体检测，而临床血小板较少症患者大多数为同种异体免疫性疾病患者，此类患者也需要检测的是血液中或血浆中游离的血小板抗体（即非自身血小板抗体）。更进一步的，目前针对被检测者体内存在具体某种血小板特异性抗原（hpa）的抗体在临床上的检测方法更是数量稀少。根据上述情况，需要一种方法检测被检测者的血液或血浆中游离的血小板抗体，同时具体到某种hpa的抗体，且该方法需要具有特异性高、灵敏度好、操作简便、检测快速等特点。因此，研发一种快速且特异性高的血小板抗体特异性试剂盒具有很大的必要性。


技术实现要素：

[0005]
本实用新型所要解决的技术问题是提供一种血小板抗体特异性流式检测试剂盒，
检测过程操作简单，可同步分析5种血小板特异性抗体类型的检测，并可以更近一步地确定被检测者的hpa抗体分型，灵敏度高、特异性好、漏诊率低，大大提高检测效率。
[0006]
本实用新型解决上述技术问题的技术方案如下：包括呈方形的试剂盒本体，本体内置有试剂瓶放置板，试剂瓶放置板内设有十七个间隔设置的试剂瓶放置孔，每个试剂瓶放置孔内容置a有一个试剂瓶。
[0007]
优选的，十七个试剂瓶包括两个大瓶、三个中瓶和十二个小瓶，两个大瓶内依次放置有微球缓冲液和清洗液；两个中瓶内依次放置血小板裂解液、校准微球和检测抗体；十二个小瓶依次放置五种由不同的抗血小板特异性糖蛋白抗体包被在不同的荧光微球表面得到的血小板抗原特异性荧光微球以已知hpa分型的血小板对照品。
[0008]
优选的，所述抗原特异性荧光微球包括：以抗血小板特异性糖蛋白gp iv抗体、抗血小板特异性糖蛋白gp
ꢀⅱ
b/ⅲa抗体、抗血小板特异性糖蛋白gp
ꢀⅰ
a/ⅱa抗体、抗血小板特异性糖蛋白gp
ꢀⅰ
b/
ⅸ
抗体以及以抗血小板特异性糖蛋白cd109抗体包被在荧光微球的表面，得到的五种血小板抗原特异性荧光微球。
[0009]
优选的，所述血小板对照品试剂瓶瓶身为聚乙烯软质材料，瓶盖为带0.22μm滤膜的滴管状瓶盖，在样本处理完成后时撕去瓶盖内的防漏膜后作为过滤器使用，可以节省离心的步骤。
[0010]
优选的，所述试剂瓶放置板的材质为海绵。
附图说明
[0011]
图1为试剂盒本体的立方图，包括呈长方体的试剂盒本体1；
[0012]
图2为试剂瓶放置板的平面图，包括试剂瓶放置板2，试剂瓶放置板2内设有十七个间隔设置的试剂瓶放置孔3；
[0013]
图3为血小板标准品试剂瓶的使用示意图，包括0.22μm微孔滤膜4；
[0014]
图4-图9为实施例种被检测者的流式检测结果图，从上至下分别为抗gp
ꢀⅱ
b/ⅲa、抗cd109、抗gp
ꢀⅰ
a/ⅱa、抗gp
ꢀⅰ
b/
ⅸ
、抗gp iv抗体。
具体实施方式
[0015]
以下结合附图和具体实施方式对本实用新型的原理和特征进行描述，所述实例只用于解释本实用新型，并非用于限定本实用新型的范围。
[0016]
如图1所示，本实用新型提供的一种血小板抗体特异性流式检测试剂盒为呈长方体的盒体本体1。
[0017]
如图2所示，本体1内置有试剂瓶放置板2，试剂瓶放置板2为柔性海绵材料制成。试剂瓶放置板2内设有十七个间隔设置的试剂瓶放置孔3，每个试剂瓶放置孔3内置有一个试剂瓶。十七个试剂瓶包括两个大瓶、三个中瓶和十二个小瓶，两个大瓶内依次放置有微球缓冲液和清洗液；两个中瓶内依次放置血小板裂解液、校准微球和检测抗体；十二个小瓶依次放置五种由不同的抗血小板特异性糖蛋白抗体包被在不同的荧光微球表面得到的血小板抗原特异性荧光微球以及已知hpa分型的血小板对照品。
[0018]
如图3所示，血小板对照品试剂瓶瓶身为聚乙烯软质材料，瓶盖为带滤膜4的滴管状瓶盖，使用时可以撕去瓶盖内的防漏膜后作为过滤器使用。
[0019]
实施例一：一种血小板抗体特异性流式检测试剂盒，其检测方法如下：
[0020]
1、混合微球
[0021]
1.1 将每个试剂盒中的抗原特异性荧光微球取出，充分混匀，防止微球沉淀。
[0022]
1.2 根据样本数量吸取每种血小板抗原特异性荧光微球，混入一个离心管中。
[0023]
1.3 将混合后的抗原特异性荧光微球200
×
g离心5分钟。
[0024]
1.4 小心吸去上清。
[0025]
1.5 加入体积为325 μl微球缓冲液。
[0026]
1.6 室温避光孵育30分钟。
[0027]
2、待测样本准备
[0028]
检测样本为血清或血浆。
[0029]
2.1 血清：标准试管或者有分离胶的试管采集静脉血，4000rpm离心20分钟。
[0030]
2.2 血浆：edta抗凝管采集静脉血，4000 rpm离心20分钟。
[0031]
2.3 从6个血小板标准品中分别取1
×
108个血小板，离心弃上清，与检测样本混合于血小板裂解液试剂瓶中，室温避光孵育2h。加入100μl tris-hci血小板裂解液，混匀后震荡裂解30min，使用时撕去瓶盖内的防漏膜，倒置瓶身将样本混合物从滴管中挤出过滤，可以节省离心的步骤。
[0032]
3、加入检测抗体与上机检测。
[0033]
3.1 取检测样本混合物30 μl，加入10 μl微球混合物，37℃、110 rpm震荡孵育30分钟。
[0034]
3.2孵育完成后，0.01m pbs洗涤三次，加入100 μl检测抗体，37℃、110 rpm震荡孵育30分钟。
[0035]
3.3 孵育完成后，0.01m pbs洗涤三次，加入0.01m pbs 100 μl，使用流式细胞仪进行检测。
[0036]
3.4 数据处理：fsc/ssc散点图圈出检测微球门，获取2500-3000个微球，通过流式细胞仪检测待测样本复合物pe通道的荧光强度mfi。
[0037]
3.5 数据分析：根据流式细胞仪分析结果图分析，若被检测者体内存在血小板特异性抗体，则与该抗体结合的微球表现为荧光强度升高，再结合已知hpa分型的血小板对照品作为对照，即可分析出被检测者的hpa特异性抗体分型。该实施例中被检测者样本结果图中与抗cd109抗体结合的微球荧光强度升高，说明该被检测者体内存在抗cd109抗体。同时，由于cd109糖蛋白上存在hpa 15a/b抗原，从6张与不同血小板对照品结合后的结果图综合分析，与hpa分型存在15a的血小板对照品结合后的样本抗cd109抗体呈阳性，与分型为15b的血小板对照品结合后的样本抗cd109抗体呈阴性，说明该被检测者体内的血小板抗体为抗hpa 15a型。
[0038]
以上所述仅为本实用新型的较佳实施例，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。