新冠病毒IgM和IgG抗体胶体金法检测试剂盒的制作方法

本申请属于涉及新冠病毒的抗体检测技术领域，具体来说涉及一种新冠病毒igm和igg抗体胶体金法检测试剂盒。

背景技术：

2019年12月中旬，发现了病因不明的非典型肺炎(atypicalpneumonia)，科学研究表明，其是由一种新型冠状病毒covid-19引发的。新型冠状病毒covid-19感染的肺炎以发热、乏力、干咳等为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。重症病例多在1周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。迄今covid-19还没有针对性的特效药。一些个案报道的治疗药物仍需更多的临床实践证明效果，相关疫苗的研发也在开展中，但距离临床应用尚需时间。当务之急是尽快研究有效的诊断试剂，早诊断、早隔离、切断传播途径，控制疫情蔓延。新型冠状病毒covid-19核酸检测有较高的特异性和灵敏度，但是该检测方法对技术要求高，容易出现假阴性，标本需要特殊处理，要求具备pgr扩增仪及凝胶电泳等专业的仪器设备，对新型冠状病毒的检测用时长，需专业技术人员操作和判断检测结果，无法应用于社区、基层医院、机场、海关甚至家庭等基层的早期初步筛查。因此，如何更早期、更准确、更快捷、更有效的检测新型冠状病毒covid-19，是本领域技术人员需要研究的方向。

技术实现要素：

本申请的目的是提供一种新冠病毒igm和igg抗体胶体金法检测试剂盒。能够实现对新型冠状病毒covid-19更早期、更准确、更快捷、更有效的检测。

其采用的技术方案如下：

一种新冠病毒igm和igg抗体胶体金法检测试剂盒，其包括：盒体和检测试纸；所述检测试纸安装于盒体内、包括：塑料支撑板、上样垫、胶体金垫、硝酸纤维素nc膜、检测线t1、检测线t2、质控c线和吸样垫；所述胶体金垫上有胶体金标记新冠抗原s蛋白rbd；所述塑料支撑板粘贴于所述上样垫一端；所述上样垫另一端紧密压接于胶体金垫一端，所述胶体金垫另一端紧密压接于硝酸纤维素nc膜一端；所述硝酸纤维素nc膜另一端连接吸样垫；所述检测线t1有包被于硝酸纤维素nc膜的抗人igm抗体；所述检测线t2有包被于硝酸纤维素nc膜的抗人igg抗体；所述质控c线有包被于硝酸纤维素nc膜的抗鸡抗体；所述盒体表面设有位置对应于上样垫的加样孔。具体来说：所述抗人igm抗体和抗人igg抗体的浓度为10～15ug/ml；所述样品稀释液为含磷酸钠、磷酸氢钠及氯化钠的混合水溶液。

优选的是，上述新冠病毒igm和igg抗体胶体金法检测试剂盒中：所述上样垫采用玻璃纤维膜或无纺布构成，所述吸样垫采用吸水滤纸组成。

优选的是，上述新冠病毒igm和igg抗体胶体金法检测试剂盒中：所述抗原新冠抗原s蛋白rbd，抗原利用基因工程重组表达纯化。

基于上述检测试剂盒，本申请还公开了一种新冠病毒igm和igg抗体胶体金法检测试剂盒的使用方法，其包括如下步骤：

s1：检测试纸装配方法；

s2：对抗人igm，igg抗体进行包被；

s3：制备含有胶体金标记的新冠抗原s蛋白rbd的胶体金垫；

s4：新冠病毒igm和igg检测。

优选的，所述步骤s2包括：

s21：以0.01mph7.2磷酸盐缓冲液(pbs)将抗人igm抗体配制成1～2mg/ml的溶液；

s22：以0.01mph7.2磷酸盐缓冲液(pbs)将抗人igg抗体配制成1～2mg/ml的溶液；

s23：用喷膜仪在nc膜下部以1～1.5ul/cm的参数进行划线；

s24：包被检测线t1和t2，同时在硝酸纤维素nc膜上部包被抗鸡抗体作为质控c线；

s25：将划线后的nc膜放置于干燥间，保持温度20-25℃，湿度小于30％的环境干燥2-5小时。

优选的，所述步骤s3包括：

s31：以氯金酸一柠檬酸三钠还原法制备直径为30～50nm的胶体金溶液；

s32：将s31制备所得胶体金液取100ml放在烧杯内，以0.2mk2c03调至ph8.5，按100ml胶体金溶液加入0.5～2mg新冠抗原s蛋白rbd，室温搅拌2小时；

s33：加入1％牛血清白蛋白bsa，1％聚乙二醇peg20000封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清；

s34：用胶体金工作液复溶至100ml，按1ml溶液铺20cm²的比例均匀地铺在上样垫上；

s35：将上样垫置于干燥间，在温度20～25℃，湿度小于30％的环境下，干燥2～5小时制成胶体金垫。

优选的，所述步骤s1包括：

s11：在干燥室内，温度20～25℃，湿度小于40％，取塑料支撑板板，将已包被的硝酸纤维素nc膜放置在塑料支撑板的中部粘贴；

s12：在硝酸纤维素nc膜检测t线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/5；

s13：在硝酸纤维素nc膜质检c线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10；最后用裁剪机将贴好塑料板切成2～5mm宽的试纸条，切好的试纸条可以再装入盒体内，形成检测试剂盒。

优选的，所述步骤s4包括：

s41：将被检血清或血浆平衡至室温，将试纸条平放，在上样垫上加入5～20ul被检样品，再加入50～100ul的样品稀释液，使胶体金溶解并在硝酸纤维素nc膜上层析；

s42：用肉眼直接观察在15分钟内c、t1、t2线的出现情况，并判定检测结果。

与现有技术相比，本申请提供的利用免疫层析胶体金技术检测新冠病毒igm和igg抗体的新型试剂盒，采用胶体金标记s蛋白rbd，包被抗人igm和igg抗体实现对血液中抗新冠病毒抗体的检测，能够一次检测获得两种检测指标，从而节约了时间和成本，减轻患者的痛苦，具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用的特性。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本申请作进一步详细的说明：

图1为实施例1中检测试剂盒的俯视结构示意图；

图2为实施例1中检测试剂盒的内部结构示意图，本图中省略了盒体。

各附图标记与部件名称对应关系如下：

1、盒体；2、塑料支撑板；3、上样垫；4、胶体金垫；5、硝酸纤维素nc膜；6、检测线t1；7、检测线t2；8、质控c线；9、吸样垫；11、加样孔。

具体实施方式

为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将结合各个实施例作进一步描述。

如图1-2所示为实施例1：

一种新冠病毒igm和igg抗体胶体金法检测试剂盒，其包括：盒体1和检测试纸；所述检测试纸安装于盒体1内、包括：塑料支撑板2、上样垫3、胶体金垫4、硝酸纤维素nc膜5、检测线t16、检测线t27、质控c线8和吸样垫9；

所述胶体金垫4上标记有新冠抗原s蛋白rbd；所述塑料支撑板2粘贴于所述上样垫3一端；所述上样垫3另一端紧密压接于胶体金垫4一端，所述胶体金垫4另一端紧密压接于硝酸纤维素nc膜一端；所述硝酸纤维素nc5膜另一端连接吸样垫；所述检测线t16包被于硝酸纤维素nc膜5的抗人igm抗体上；所述检测线t27包被于硝酸纤维素nc膜5的抗人igg抗体上；所述质控c线8包被于硝酸纤维素nc膜5的抗鸡抗体上；所述盒体1表面设有位置对应于上样垫3的加样孔11。所述抗人igm抗体和抗人igg抗体的浓度为10～15ug/ml；所采用的样品稀释液为含磷酸钠、磷酸氢钠及氯化钠的混合水溶液。

本例中：所述上样垫采用玻璃纤维膜或无纺布构成，所述吸样垫采用吸水滤纸组成。所述抗原新冠抗原s蛋白rbd中，抗原利用基因工程技术重组表达纯化。

实践中：上述检测试剂盒的工作过程如下：

新冠s蛋白rbd抗原：自产，为重组抗原，抗体、抗鸡抗体用于nc膜质控线包被；鼠抗人igm和igg抗体：arista公司产品，用于nc膜包被；氯金酸：sigma公司产品；

硝酸纤维素(nc)膜：millipore公司产品；牛血清白蛋白(bsa)，聚乙二醇peg20000，水解酪蛋白：sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。临床血清由公司在相关医院获得，其中新冠病毒igg抗体阳性样本50份，igm抗体阳性样本15份，其中包括两种抗体均阳性样本8份。两种抗体全为阴性正常人样本60份。新冠病毒igm抗体检测试剂盒(elisa法)。

氯金酸一柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2mk2co3将溶液调到ph7.5、ph8.5和ph9.5。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入0.5mg、1mg、1.5mg将重组抗原将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再滴加入到终浓度为0.1％的peg2000和1％的bsa进行封闭20min，标记结束后以12000r/m离心，弃上清，沉淀按原体积复溶至不同配比的胶体金工作液硼酸盐缓冲液，ph8.5，含bsa、羊血清，蔗糖和表面活性剂中。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm²的比例加样于无纺布上，在温度20～25℃，相对湿度在<30％的干燥间干燥2-4小时，制成胶体金垫。

nc膜包被用0.01mph7.2，pbs将鼠抗人igm分别稀释成0.5mg/ⅲl、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml，鼠抗人igg分别稀释成0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在nc膜下部按1ul/cm进行分别划线包被，同时在nc膜上部包被抗鸡抗体，用于产品的质控，包被完成后，将nc膜在在温度20-25℃，相对湿度在<30％的干燥间干燥2-5小时。

鼠抗人病毒igm和igg抗体检测试纸的组装，在干燥室内(温度20-25℃，相对湿度<30％)取塑料支撑板，将己包被的nc膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在nc膜t线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫(搭胶体金垫的1/5)；在nc膜c线一侧搭接吸样垫(搭吸样垫的1/10)；然后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条。

检测方法：将被检血清或血浆平衡至温室，将制备好的试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入10ul被检样品，若样品中含抗新冠病毒igm或igg抗体，则和样品垫上的标记新冠s蛋白rbd抗原的胶体金结合，形成复合物，并扩散到nc膜上进一步层析，当遇到包被在nc膜上t1线处的鼠抗人igm时，复合物则又和包被抗igm抗体结合，被捕获在包被处；当遇到包被在nc膜上t2线处igg时，复合物则又和包被抗体结合，被捕获在包被线t2处；当被捕获的胶体金复合物达到一定数量时，则形成一条肉眼可见的t1或t2线；若血清中不含特异性抗体，则不能形成免疫复合物，亦不能形成t线，c线作为试剂的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。用肉眼直接观察在5、10、15、20、和30分钟内c、t线的出现情况，并判定检测结果。

试纸工艺参数调试：将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，利用质控血清对试剂进行测试，发现最佳组合，其中最佳组合为鼠抗人igm和igg抗体标记浓度为10～15ug/ml。

临床血清检测用本试剂按检测方法对所有临床血清进行检测，同时用商用检测elisa试剂进行对照检测。

结果：试纸参数确定根据小样的检测结果，确定了试纸的最佳标记ph值为8.5；重组混合抗原的最佳标记量为1mg/100ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为10mm硼酸酸盐缓冲液，ph8.5，含0.5％bsa、10％羊血清，2％蔗糖，0.2％tween20；最佳包鼠抗人igm和igg包被浓度均为1.5mg/ml。检测结果的最佳判定时间为5-15分钟。

临床血清检测：以elisa试剂为对照，对igg抗体进行检测，本试剂盒igg检测出阳性49份，elisa检测出igg阳性50份，灵敏度为98％；本试剂对igg阴性样本检测为阴性样本数58份，相对特异性96.7％。p＞0.05。

以elisa试剂为对照，对igm抗体进行检测，本试剂igm检测出阳性10份，elisa检测出igm阳性10份，灵敏度为100.0％；本试剂对igm阴性样本检测均为阴性，相对特异性100％。p＞0.05。

以上所述，仅为本申请的具体实施例，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。本申请的保护范围以权利要求书的保护范围为准。