使用色谱质谱分析装置的质谱分析方法与流程

1.本发明涉及一种使用色谱质谱分析装置的质谱分析方法(mass spectrometry method using chromatography-mass spectrometer devace)。尤其，本发明涉及一种能够适当地测定蛋白质、肽和核酸的质谱分析方法。


背景技术：

2.在国际公开2016-125271号公报中记载了一种色谱质谱分析装置。该装置存在复杂而且不适合蛋白质、肽和核酸的质谱分析的问题。[现有技术文件][专利文献]
[0003]
专利文献1：国际公开2016-125271号公报


技术实现要素：

[发明所要解决的技术问题]
[0004]
本说明书中记载的一个发明的目的在于，提供一种使用色谱质谱分析装置的质谱分析方法，其能够通过低成本且简单的方法进行质谱分析。尤其，在一个发明中，其目的在于，提供一种使用色谱质谱分析装置的质谱分析方法，其能够实现蛋白质、肽和核酸的定量分析。[用于解决技术问题的技术方案]
[0005]
本说明书中记载的一个发明依据的见解是，通过在色谱仪(chromatograph)的流动相中添加离子对试剂(ion pair agent)和h
ü
nig碱(h
ü
nig
′
s base)进一步对碰撞室(collision cell)施加较高的碰撞能量，从而能够利用低成本且简单的方法来进行质谱分析。
[0006]
本说明书中记载的一个发明涉及一种使用色谱质谱分析装置的对象物的质谱分析方法。在该方法中使用的色谱质谱分析装置1例如依次包含色谱仪3、离子化部5、第1质量分离部7、碰撞室9、第2质量分离部11和离子检测部13。优选第1质量分离部和第2质量分离部分别包含第1四极质谱分析仪和第2四极质谱分析仪。而且，该方法包括在色谱仪的流动相中添加离子对试剂和h
ü
nig碱的工序。并且，该方法包括将碰撞室的施加电压的绝对值设为20v以上且250v以下(优选为，60v以上且120v以下)的工序。碰撞室的施加电压可以调整为使通过碰撞室的质荷比(m/z)的值为94.9的离子强度达到最大值或者达到最大值的90％以上的电压。离子对试剂的例子为六氟-2-丙醇(hexafluoro-2-propanol)(hfipa)。色谱仪优选使用具有带排气阀(vent valve)的盖的色谱仪。对象物的例子为蛋白质、肽或核酸。[发明效果]
[0007]
本说明书记载的一个发明通过在色谱仪的流动相中添加离子对试剂和h
ü
nig碱，进一步对碰撞室施加较高的碰撞能量，从而能够利用低成本且简单的方法来进行质谱分析。附图简易说明
[0008]
图1是表示色谱质谱分析装置的结构例的框图。图2是表示实施例中使用的装置的概要的图。图3是表示实施例中使用的装置的概要的图。图4是代替附图表示产物离子的研究结果的图表。图5是代替附图表示h
ü
nig碱的效果的研究结果的图表。图6是代替附图表示srm色谱图的图表。图7表示实施例中的预处理方法的方案。图8表示使用了pci试剂的预处理方法的方案。图9表示使用了试剂盒(claruty otx)的预处理方法的方案。图10是根据安全瓶盖的有无对hplc色谱柱的压力(背压)与s化寡聚核苷酸的灵敏度进行比较的代替附图的图表。
具体实施方式
[0009]
下面，使用附图来说明用于实施本发明的方式。本发明并不限定于以下说明的方式，还包含在对于本领域技术人员而言显而易见的范围内，根据以下的方式进行适当修改后的方式。
[0010]
本说明书记载的一个发明涉及一种使用色谱质谱分析装置的对象物的质谱分析方法。色谱质谱分析装置为具有色谱仪和与色谱仪连接的质谱分析部的质谱分析装置，质谱分析部具有隔着碰撞室而位于前后侧的质量分离部。质谱分析部具有离子化部、前级质量分离部、碰撞室和后级质量分离部，其中，所述离子化部使从色谱仪洗脱的液体离子化而获得前体离子；所述前级质量分离部用于分选前体离子；所述碰撞室使前体离子裂解成产物离子；所述后级质量分离部用于分选产物离子(对象物)。在对象物的质谱分析方法中，进行对象试样的质谱分析，确认是否存在具有已知质量(或者质荷比)的对象物或是求得对象物的相对存在比，或者进行对象物的定量分析。
[0011]
图1是表示色谱质谱分析装置的结构例的框图。如图1所示，色谱质谱分析装置1依次包含色谱仪3、离子化部5、第1质量分离部7、碰撞室9、第2质量分离部11和离子检测部13。
[0012]
色谱仪色谱仪3为具有通常流动相的液相色谱仪。色谱仪3也可以使用高效液相色谱仪(hplc)装置。色谱仪为公知的装置，只要适当采用公知的装置即可。液相色谱仪例如具有流动相容器、泵、注射器和色谱柱，其中，所述流动相容器储存有流动相；所述泵抽吸流动相且以规定的流量进行泵送；所述注射器向流动相中注入规定量的对象试样；所述色谱柱沿时间方向分离试样液中含有的各种化合物。
[0013]
作为流动相，在不会对色谱柱、装置造成不良影响的范围内可以使用各种溶剂。溶剂的例子为水或盐类的水溶液、醇类、乙腈、二氯甲烷和三氟乙酸。
[0014]
在本说明书中的一个发明中，向色谱仪的流动相添加离子对试剂和h
ü
nig碱。离子
对试剂添加于流动相的添加量例如为0.001mol/l以上且1mol/l以下，可以为0.005mol/l以上且0.5mol/l以下，也可以为0.01mol/l以上且0.1mol/l以下，也可以为0.001mol/l以上且0.1mol/l以下，还可以为0.1mol/l以上且1mol/l。被添加于流动相时的离子对试剂的浓度可以为0.01重量％以上且25重量％以下。h
ü
nig碱添加于流动相的添加量例如为0.01mol/l以上且0.25mol/l以下，可以为0.005mol/l以上且0.1.5mol/l以下，也可以为0.01mol/l以上且0.1mol/l以下，也可以为0.001mol/l以上且0.1mol/l以下，还可以为0.1mol/l以上且0.25mol/l以下。被添加于流动相时的h
ü
nig碱的浓度可以为0.1重量％以上且25重量％以下。
[0015]
离子对试剂只要具有溶解性即可。离子对试剂的例子为六氟-2-丙醇(hfipa)、三氟乙酸、五氟丙酸、七氟正丁酸、七氟异丁酸、九氟戊酸、九氟异戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸和全氟低级脂肪酸(十五氟辛酸)。离子化剂的浓度的例子为1mmol/l以上且100mmol/l以下，可以为5mmol/l以上且20mmol/l以下。
[0016]hü
nig碱是指n,n-二异丙基乙胺(dipea)。
[0017]
在向流动相中添加离子对试剂(例如，六氟-2-丙醇：hfipa)的情况下，优选使用氟(使用了氟树脂的)色谱柱作为流动相色谱柱(流动相瓶)。这是由于在使用通常的玻璃色谱柱的情况下，尤其在将hfipa添加于流动相时，hfipa会与玻璃进行反应。氟色谱柱的例子为ptfe(聚四氟乙烯)、pfa(四氟乙烯
·
全氟烷基乙烯基醚共聚物)、fep(四氟乙烯
·
六氟丙烯共聚物)、etfe(四氟乙烯
·
乙烯共聚物)、pvdf(聚偏二氟乙烯)、pctfe(聚三氟氯乙烯)和ectfe(三氟氯乙烯
·
乙烯共聚物)。在这些之中，优选ptfe、pfa。
[0018]
对象物的例子为蛋白质、肽或核酸。于是，优选注入色谱仪装置的样品为含有蛋白质、肽或核酸的液体。这种样品的例子为血液、血浆、血清、培养上清液、组织、体液和基因分析用的样品。
[0019]
优选色谱仪使用具有带排气阀的盖的色谱仪。带排气阀的色谱仪装置在日本发明专利公开公报特开2017-215215号、日本发明专利公开公报特表2006-509214号中有记载。通过使用排气阀，能够有效地防止流动相的蒸发。在将离子对试剂(例如，六氟-2-丙醇：hfipa)添加于流动相的情况下，会产生离子对试剂蒸发而灵敏度下降的问题、对高效液相色谱仪装置的分析色谱柱造成损坏这一特有的问题。针对该问题，通过使用排气阀，能够有效地防止流动相的蒸发。
[0020]
质谱分析部质谱分析部也被称为质谱分析仪，为用于分析对象物的质量(或质荷比：m/z)的装置。通常质谱分析装置由多个腔室构成，该腔室被调整为与作为目标的样品、对象物对应的真空度。为了实现所希望的真空度，可以将与其相适的泵连接于各腔室使用。由于质谱分析仪为公知的装置，因此，只要没有特别说明，在本说明书中可以适当采用公知的质谱分析仪的要素。下面，对质谱分析部的例子进行说明，但本发明并不限定于以下的说明。
[0021]
离子化部离子化部为用于使从色谱仪洗脱的液体离子化而获得前体离子的要素。离子化部可以适当采用色谱质谱分析装置中公知的离子化部。这种离子化部的例子为，具有一边对来自色谱仪的液体(试样溶液)赋予电荷一边进行喷雾的电喷雾离子化探针的离子化部。离子化部可以大致为大气压。
[0022]
分析室分析室在进行分析时通常为高真空或者超高真空。为了调整离子化部与分析部的真空度的差异，可以在离子化部与分析部之间具有多级差动排气系统，其具有分级提高真空度的第1中间真空室和第2中间真空室。各室例如由真空泵进行排气，被设置为适当的真空度。离子化室与后级的第1中间真空室之间可以通过细径的加热毛细管连通。第1中间真空室与第2中间真空室之间由分离器隔开，在第1中间真空室和第2中间真空室中分别设置有用于使离子聚集且将其向后级輸送的离子导向器。
[0023]
在分析室中，例如依次存在第1质量分离部7、碰撞室9、第2质量分离部11和离子检测部13。
[0024]
第1质量分离部第1质量分离部7为用于根据质荷比(m/z)来分离离子的要素。第1质量分离部7的例子为tof(飞行时间型)质谱分析仪、多极(四极、六极、八极、十二极、十六极)滤质器和离子透镜。第1质量分离部7例如用于聚集离子，将离子与中性物质分离，且分选出具有所希望的质荷比的离子，并将其导向接下来的碰撞室9。这些结构、施加电压的方法为公知的。例如，四极滤质器叠加施加直流电压和交流电压。而且，能够通过调整该施加电压来调整为具有所希望区域的质荷比(m/z)的离子能通过四极滤质器。
[0025]
碰撞室碰撞室9也被称为反应室。当离子被导入碰撞室内时，例如与室内的离子、惰性气体发生碰撞。此时，有时会发生反应、解离。在碰撞室内，根据体系会发生例如碰撞诱导解离、电荷移动反应、氢原子移动反应、质子移动反应、氧化/卤化反应等各种反应。碰撞室为公知的装置。
[0026]
碰撞室的例子为在内部设置有多极(例如四极)离子导向器的碰撞室。碰撞室例如与氩气、氮气等cid气体的供给机构连接，且使cid气体连续地(或者间歇地)向碰撞室的内部供给。
[0027]
而且，将碰撞室的施加电压的绝对值设为20v以上且250v以下(优选为，60v以上且120v以下)。施加电压是指，对构成碰撞室的离子导向器(电极)施加的电压。通常，对离子导向器施加的电压为离子聚集用的高频电压(交流电压)。当然，也还可以进一步对离子导向器施加直流偏置电压。碰撞室的施加电压可以调整为使通过碰撞室(或由离子检测部检测出)的质荷比(m/z)的值为94.9的离子的离子强度达到最大值或者最大值的90％以上的施加电压。在对离子导向器施加交流电压和直流电压双方的情况下，碰撞室的施加电压的绝对值是指交流电压的绝对值。
[0028]
第2质量分离部第2质量分离部11与第1质谱分析部7相同。一般而言，第2质谱分析部比第1质谱分析部7维持的真空度高。第2质量分离部11的例子为具有根据质荷比来分离离子的多极(四极)滤质器的质量分离部。例如，在使用四极滤质器的情况下，通过调整能从滤质器通过的质荷比的区域，能够使作为目标的离子通过。
[0029]
离子检测部离子检测部13为用于根据质荷比(m/z)来分析离子，从而检测出作为目标的对象物的要素。例如，当存在离子时，由于在检测部中产生电，因此通过对该电流进行测定，能够
检测出存在作为目标的对象。
[0030]
优选第1质量分离部和第2质量分离部分别包含第1四极质谱分析仪和第2四极质谱分析仪。实施例1
[0031]
实验材料从国立循环器病研究中心(ncvc)获得测定对象的lna(14mer的寡聚核苷酸、分子量4572.6)。从关东化学株式会社购得1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(hfipa、高效液相色谱法用)，从富士胶片和光纯药株式会社购得n,n-二异丙基乙胺(dipea、h
ü
nig碱、试剂特级)和三乙基胺(tea、试剂特级)。作为其他使用的药品类，选择试剂特级并从富士胶片和光纯药工业购得。使用oasis hlb 96孔板(30mg、沃特世公司制造)来进行固相萃取。作为hplc色谱柱，使用了cadenza cd-c18 3μm的内径2.1mm、长度50mm(imtakt公司制造)的hplc色谱柱。为了防止流动相的蒸发，使用了安捷伦公司制造的a-line安全盖。
[0032]
测定设备在液相色谱质谱分析仪中，将液相色谱仪装置的nexla xr hplc系统(岛津制作所制造)连接于作为高分辨率质谱分析装置的triple tof5600+、作为定量型质谱分析装置的triple quad 5500(均为sciex公司制造)使用。使用的装置的概要在图2和图3中示出。
[0033]
实验方法1)浓度测定样品的制备在100μl的血浆中加入10μl的0.05％tea水溶液并对其进行混和。接着，添加并混和100μl用乙酸调整为ph 8.4的1mol/l乙酸三乙基胺水溶液。
[0034]
2)校准曲线样品的制备将lna用0.05％tea水溶液溶解，制备出作为溶液浓度0.1、0.3、1.0、3.0、10、30、100、300ng/ml的校准曲线用标准液。在使用triple tof 5600+测定对象时(sciex公司制造)，向100μl空白血浆中添加并混和0.1～100ng/ml的校准曲线用标准溶液10μl。在使用triple quad 5500测定对象的情况下，向100μl空白血浆中添加并混和0.3～300ng/ml的校准曲线用标准溶液10μl，制备出校准曲线样品。所有的校准曲线样品均在添加lna标准溶液之后，添加并混和1mol/l tea-a(乙酸三乙基胺)水溶液100μl。
[0035]
3)质量控制样品(qcs)的制备将lna用0.05％tea水溶液溶解，制备出作为溶液浓度1.0、3.0、100、8000、27000ng/ml的lna qcs用标准液。在使用triple tof5600+测定对象时，向99μl空白血浆中添加并混和1.0、3.0、100、8000ng/ml的qcs用标准溶液1μl。在用triple quad 5500测定对象的情况下，向99μl空白血浆中添加并混和3.0、100、8000、27000ng/ml的qcs用标准溶液1μl，制备出qcs。所有的校准曲线样品均在添加lna标准溶液之后，添加并混和1mol/ltea-a水溶液100μl。
[0036]
4)萃取操作用0.5ml的乙腈活化oasis hlb 96孔板(30mg)，且用0.5ml超纯水对其进行平衡化。将校准曲线样品或者浓度测定样品全部添加到活化/平衡化后的固相。用2ml的超纯水清洗固相之后，用0.3ml的50％乙腈水溶液从固相中洗脱出lna。将洗脱液在氮气气流下、在
50℃下完全干燥固化，之后，用0.1ml的0.05％tea水溶液溶解残渣，制成测定样品。
[0037]
5)测定方法5-1)液相色谱仪装置测定条件作为液相色谱仪装置的流动相，将含有10mmol/l dipea的50mmol/l hfipa水溶液作为流动相a，将乙腈作为流动相b。此外，在将流动相a设置于液相色谱仪装置之后，为了抑制流动相a中所含的hfipa的蒸发，而使用了a-line安全盖。将液相色谱仪装置的柱恒温槽设定于50℃，使流动相a与流动相b的比率为95:5，流速为0.4ml/min而使hplc柱平衡化，之后，将10～15μl测定样品注入液相色谱仪装置。注入后，在30秒钟期间将流动相b的比率保持在5％，注入后经过6分钟使流动相b的比率上升至30％。由于在注入后约3分钟洗脱lna，因此使用转向阀仅在从2.5分钟至3.5分钟的1分钟，将流动相导入质谱分析装置。然后，使流动相b上升至99％且用乙腈清洗hplc柱1分钟，之后，使流动相b减少至5％且经1分30秒钟使hplc柱平衡化，准备下一样品测定。
[0038]
5-2)质谱分析装置测定条件在用于定量的lna的监视离子中，将7价的m/z 652设为前体离子，使产物离子为m/z 94.9(pso
2-)，为了使产物离子的强度最大，triple tof5600+将碰撞能量设定为-77v，triple quad5500将碰撞能量设定为-105v。设定离子源为triple tof5600+、triple quad5500并且温度为700℃，辅助气体压力和辅助气体压力为70psi，逆流的压力为30psi。
[0039]
结果重现性实验在表1中示使用了triple tof5600+的校准曲线和批次间重现性的结果(各有三个例子)。表1.triple tof5600+的重现性试验结果
[0040]
[表1]calibrationbetween-run
[0041]
在表1的上方的表中，calibration表示校准，nominal conc.表示标准化浓度，observed data表示观测数据，observed conc.表示观测浓度，accuracy表示准确性(相对误差)，statistical data表示统计数据，mean表示平均，accuracy表示准确性(相对误差)，precision表示准确性(数据的偏差)。在其他的表中，这些表述也表示同样的意思。在表1的上方的表中，表示出针对为了制作校准曲线而进行了制备/预处理/测定的各浓度的校准曲线样品，在根据其结果获得的直线方程(y＝ax+b)中代入测定值(校准曲线样品的面积值)，并进行逆回归而得到的浓度(observed conc.)。用该值减去标示浓度(nominal conc.)，在除以标示浓度而获得的数值表示为相对误差(re％)。在表1中，示出按批求得相对误差(re％)的结果和根据三次的平均值求得的结果。另外，根据三次的测定值求得标准偏差，将其除以平均值并用百分率表示变动系数的值为cv％，相对地评价相对于平均值的数据和偏差的关系。在表1的下方的表中，between-run表示组间。在表1的下方的表中，表示出制备质量控制样品(qc样品)，根据校准曲线求得的其浓度。在该表中，将qc样品作为模拟样品来对待，为了尽可能地接近实际样品，使溶解有生物样品中添加的标准物质的溶液的添加容量为5％。对该表也进行了与上方的表的校准曲线的测定结果相同的评价。这些数值依据bioanalytical method validation(fda，2001)(生物样品分析方法验证指导原则)确定标准，设定re％的定量下限(lloq)为
±
20％，其他为
±
15％，cv％的定量下限为20％，其他为15％。
[0042]
在表2中示出使用了triple quad5500的校准曲线和批次间重现性的结果(各有三个例子)。表2.triple quad5500的重现性试验结果
[0043]
[表2]calibrationbetween-run
[0044]
2.大鼠血浆浓度测定下面示出对大鼠皮下给药10mg/kg的lna而获得的血浆中浓度。虽然定量限度存在差异，但没有发现tripletof 5600+和triplequad5500之间存在定量值的差异。表3.对大鼠皮下给药10mg/kglna而获得的血浆中浓度(单位：μg/ml)
[0045]
[表3]
[0046]
表中animal no.表示大鼠的动物编号。quantitative device表示用于实验的定量分析装置。time after administration(hour)表示给药后时间(小时)。小于定量下限用bloq表示。nd表示无法定量。
[0047]
基础数据1.产物离子的选择在lc-ms/ms测定中，实施了对最影响高灵敏度和选择性的产物离子的研究。在图4中示出其结果。制备浓度为3ng/ml的s化寡聚核苷酸，在各碰撞能量的条件下进行了测定。首先，将s化寡聚核苷酸的7价的离子作为母离子(precursor)，获得ms/ms谱图。找寻使在该ms/ms谱图中观察到的碎片离子、m/z94.90、134.10、193.00、303.80、328.00、346.00、602.30、611.20、632.70为最大灵敏度的碰撞能量。使hplc的条件相同，对其设定使各碎片离子为最大的碰撞能量(测定条件为9个条件)，将3ng/ml s化寡聚核苷酸注入lc-ms/ms，获取各自的srm色谱图。根据这样获得的srm色谱图的峰值高度制成图4所示的图表。图4中，ion intensity表示离子强度，collision energy表示碰撞能量，high表示高，low表示低，production(m/z)from652.06(valent7，m/z)表示源自质荷比(m/z)为652.06的7价的离子化的产物的质荷比(m/z)。由于峰值的高度表示由该时刻的碰撞能量和所选择的碎片离子(product)获得的灵敏度，因此根据图4可以掌握用于获得最高的灵敏度的碰撞能量和离子跃迁(ion transition)。
[0048]
2.h
ü
nig碱的效果以降低在核酸测定中成为问题的残留(carryover)为目的，对流动相的添加物进行了研究。已经公开的技术中所使用的tea(三乙基胺)无法实现残留的降低。因此，使用了亲核性低的h
ü
nig碱的dipea。其结果，残留急剧地降低，作为附加作用，还发现了灵敏度上升。认为其主要原因之一是抑制了残留，即抑制了向装置内的吸附。
[0049]
实验方法设定样品注入的顺序为lloq(10.0pg/ml)
→
uloq(10000pg/ml)
→
0pg/ml，确认了0pg/ml是否有峰值。在图5中示出其结果。
[0050]
准备两种hplc的流动相(添加了tea的流动相和添加了dipea的流动相)，用各个流动相按校准曲线的最小浓度(lower limit of quantitation，lloq：10pg/ml)
→
(upper limit of quantitation，uloq：10000pg/ml)
→
空白(blank：0pg/ml)的顺序进行了注入/测定。添加tea的流动相的测定结果为图5的上方的图。当在uloq测定后注入空白时，获得lloq两倍的离子强度。这表示装置内(lc-ms/ms)残留有测定对象。另一方面，在使用dipea作为添加剂的流动相(图5的中间的图)中，用空白几乎检测不到测定对象。因此，这表示使用dipea作为添加剂，急剧地改善了测定对象在装置中的残留。这表示在测定实际样品时，防止测定值因在装置中的残留而升高的现象，从而能够提供更准确的测定值。另外，在图5的下方的图中，与添加tea相比，添加dipea时lloq的离子强度从150cp上升至约300cps的约两倍。根据该结果，表示出使用dipea作为流动相的添加剂能够抑制装置内的残留并且有助于增感。
[0051]
3.预处理的研究认为通过赋予高碰撞能量，即使些许不精细的萃取方法也能够维持选择制。作为比较对象的预处理方法，已经公开的有下述两个方法，pci(酚/氯仿/异戊醇)、萃取试剂盒(clarity otx)的萃取方法。在上述的两个方法中，由于使用比较低的碰撞能量进行测定，因此需要繁琐的预处理(去除定量妨碍物质)，认为结果会对回收率造成影响。另外，这次所开发出的预处理方法为被称为oasis hlb，低分子也会频繁使用的固相板、在装入固相之前不使用特殊的试剂，因此认为其为优异的方法。
[0052]
萃取效率的比较本实验的目的为使用各个预处理方法(萃取方法)来从相同浓度的大鼠血浆中萃取s化寡聚核苷酸，比较相对于标准溶液的萃取效率。图6是表示由预处理方法的比较实现的回收率的比较的srm色谱图。在图6所示的srm色谱图中比较了测定1ng/ml浓度的标准溶液时的离子强度和通过使用pci的萃取方法、使用clarity otx的方法以及利用本方法萃取时的s化寡聚核苷酸的峰值强度。从各血浆中回收的回收率由峰值强度的高度求得。
[0053]
图7表示实施例的预处理方法的方案。图8表示使用了pci试剂的预处理方法的方案。图9表示使用了试剂盒(claruty otx)的预处理方法的方案。各方案表示各萃取方法的顺序。对于mixed sample而言，在固相萃取时，在大鼠的血浆中添加血浆量的1/10量的校准曲线用的标准溶液，制备出校准曲线用样品，在此之后的添加物按照各萃取方法来添加。方案右侧的流程是在清洗和活化用于固相萃取的板之后，在校准曲线样品中根据各萃取方法混合添加物，然后，对各固相板进行加样，接着对固相板分别按照萃取方法进行清洗，最后从固相板按照各个方法用洗脱溶剂从固相进行洗脱。进一步，一边吹送氮气，一边在50℃下蒸馏去除脱离的溶剂，对残渣用50μl的溶剂(这也按照各萃取方法使用)进行再溶解。
[0054]
图7所示的方案如以下所示。1)在200μl的大鼠血浆中添加并混合10ng/ml的s化寡聚核苷酸标准溶液，制备出
校准曲线样品。2)在校准曲线样品中添加并混合200μl的1mol/l teaa(ph8.4)。3)准备oasis hlb30μm(30mg)96孔板(固相)，在孔中加入0.5ml的乙腈并通液。4)加入0.5ml的1mol/l teaa(ph8.4)并通液。5)将由2)制备出的校准曲线样品全部加样到该孔中并通液。6)在该孔中加入2ml milli-q水(超纯水)，通液并对孔进行清洗。7)在孔中加入0.3ml的50％乙腈水溶液并通液，从固相洗脱出s化寡聚核苷酸。8)在氮气气流中，在50℃下干燥孔中的洗脱液。9)在孔中加入0.05％tea水溶液50μl，将残渣完全溶解。
[0055]
4.有关hplc流动相的研究在前临床研究发表会中推测色谱柱的耐久性的原因为hfipa的蒸发。通过抑制hfipa的蒸发，色谱柱的劣化(压力上升)被抑制，灵敏度也稳定。蒸发的防止使用了面向研究室内的抑制有机溶剂蒸发的瓶盖(带排气阀瓶盖)。另外，作为该瓶盖，使用了带排气阀的盖。
[0056]
图10是根据安全瓶盖的有无对hplc色谱柱的压力(背压)与s化寡聚核苷酸的灵敏度进行比较的代替附图的曲线图。图中，relative sensitivity(％vs immediately after preparation)表示相对于刚调整后的相对灵敏度(％)。column pressure(mpa)表示色谱柱的压力(mpa)。sensitivity，normal bottle cap(open type)表示使用了开放式的通常的瓶盖时的灵敏度。sensitivity，safety cap with vent valve(closed plug type)表示使用了具有封闭栓塞式的排气阀的安全盖时的灵敏度。column pressure，normal bottle cap(open type)表示使用了开放式的通常的瓶盖时的色谱柱的压力。column pressure，safety cap with vent valve(closed plug type)表示使用了具有封闭栓塞式的排气阀的安全盖时的色谱柱的压力。lc-ms/ms自不必说，一般的hplc分析中也希望背压和灵敏度恒定。样品(标准溶液)从刚开始后每隔12小时注入。另一方面，流动相持续流动48小时。通常，注入预处理后的样品会引起灵敏度的下降和背压的上升。该现象会在样品的纯化不充分的情况下发生。但是，当在核酸测定中向流动相中加入hfipa时，即使不注入样品也会引起背压上升和灵敏度的下降。如图10所示，可知通过施加安全瓶盖，背压和灵敏度稳定。[产业上的可利用性]
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本发明涉及一种质谱分析方法，因此能够被利用于分析设备的领域。本发明尤其能够利用于核酸、肽的质谱分析，因此能够被利用于医疗领域、分析领域。[附图标记说明]
[0058]
1：色谱质谱分析装置；3：色谱仪；5：离子化部；7：第1质量分离部；9：碰撞室；11：第2质量分离部；13：离子检测部。