具有固定的亲和配体和酶的涂层及其在液相色谱测定中的用途的制作方法

具有固定的亲和配体和酶的涂层及其在液相色谱测定中的用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年6月26日提交的名称为“coatings with immobilized affinity ligands and enzymes and use thereof in liquid chromatography assays”的美国临时专利申请号62/866,847的优先权和权益，该专利申请的全部内容据此以引用方式并入。
3.序列表
4.本技术含有序列表，该序列表已经以ascii格式以电子方式提交，并且全文据此以引用方式并入本文。在2020年6月24日创建的所述ascii副本命名为w-4064-us02_(102994_1013_4)_sl.txt，并且大小为102千字节。
技术领域
5.本公开涉及用于富集样品的组分的样品制备装置和方法。更具体地，本技术涉及具有烷基甲硅烷基涂层与共价键合到烷基甲硅烷基涂层的亲和配体或酶的样品制备装置，以及使用本文所述的样品制备装置富集样品的组分(例如，分析物)的方法。


背景技术：

6.液相色谱(lc)系统用于进行化学分离。典型的液相色谱系统由以下主要部件组成：泵、注射器、柱和检测器。泵迫使流动相例如溶液通过包括注射器、柱和检测器的流体路径。注射器允许将样品引入柱上方的流体流中。柱含有介质填充床。介质通常是多孔的并相对惰性的。样品中的化合物将表现出对介质的特征性亲和力。即，一些化合物表现出高亲和力，而一些化合物表现出低亲和力。因此，随着化合物被载送通过介质，化合物分离成在不同的时间洗脱或从柱上脱离的带。这些带由检测器检测。
7.当生物样品与液相色谱(lc)分离并且用质谱(ms)检测时，有时需要在将样品引入lc-ms系统之前增强选择性并改善检测限。例如，可以使用高度疏水性塑料板，通常称为被动吸附免疫测定板。这种类型的板通过非共价相互作用吸附亲和配体。一旦用配体诸如蛋白质活化，它就可用于样品处理或免疫吸附夹心测定诸如elisa。类似地，能够利用可与生物素化的次级配体一起使用的链霉亲和素免疫测定板。这些板包括固定的链霉亲和素。不受理论的束缚，据信，通过聚苯乙烯、聚苯乙烯二乙烯基苯、聚碳酸酯或聚丙烯的活化和基于自由基的聚合进行链霉亲和素固定。在这两种情况下，这些类型的板都具有明显的缺点，即它们需要形成多个分子间复合物才能接近目标分析物，并且许多应用需要使用封闭剂，如聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯。此外，由于表面积、配体覆盖率和结合能力不足，它们常常不会表现出理想的动态范围。
8.glygen corporation已经商业化所谓的nutip装置(可从glysci aglygen corporation company,columbia,md商购获得)，该装置用热和压力制造以具有包埋有树脂的壁表面。能够利用蛋白a和链霉亲和素亲和吸头。参见美国专利号6,416,716作为示例。
9.另外，已经开发了biocoat
tm
实验室器皿(可从corning incorporation,corning,ny商购获得)以促进贴壁细胞集落的培养。示例为被改性为具有聚赖氨酸表面的无菌塑料。在其它情况下，无菌塑料涂覆有胶原或纤连蛋白。
10.kellie和同事发表了代表混合配体结合测定/lc-ms方法的免疫捕获方法。如bioanalysis(2016)8(20),2103-2114，名称为a whole-molecule immunocapture lc-ms approach for the in vivo quantitation of biotherapeutics所发表的，使用称为maxisorp nunc聚苯乙烯板(可从thermo fisher scientific,waltham,ma商购获得)的吸附免疫测定板吸附抗独特型抗体，并且然后沉降(pull down)并通过lc-ms定量生物治疗性mab。这种板是thermo fisher scientific的产品，其具有一系列免疫测定板，包括被动吸附、共价接头活化载体和固定的链霉亲和素、谷胱甘肽和镍螯合剂板。


技术实现要素：

11.所需要的是干扰较低、坚固性得到改善、对强洗涤条件具有回弹性、结合能力得以细致调整且非特异性结合减少的方法和装置，该方法和装置可用于制备将通过lc-ms测定的样品。基于吸附的免疫捕获和酶促样品制备装置受到污染的损害，它们可由解吸配体和封闭剂诸如聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯表现出。本技术的方法和装置提供了易于调整以与感兴趣的分析物具有最小不期望的次级相互作用的材料。
12.本技术的一个益处是方法和装置由于亲和配体或酶与下面的烷基甲硅烷基涂层之间的化学连接(共价键)而非常稳健。这允许装置的再生和重复使用以及防止生物配体干扰或渗入纯化的分析物中。另外，由于键的硅烷性质，装置是高度可调整的。可以调整微环境以确保亲和配体或酶的稳定。
13.本技术涉及用于lc-ms样品制备的涂覆装置，其基于烷基甲硅烷基组合物和共价固定的生物配体。它提供了用于抗人fc结构域捕获的即用型装置，其中除了对应于配体:靶人fc结构域复合物的相互作用之外，不依赖于非共价相互作用。另外，次级树脂层可用于提供增加的表面积和结合能力。
14.在一个方面，本技术的特征在于一种用于富集样品的组分的样品制备装置。该样品制备装置包括与样品流体连通的表面、设置在表面上的烷基甲硅烷基涂层以及共价键合到烷基甲硅烷基涂层的亲和配体或酶。该样品制备装置可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
15.在一些实施方案中，亲和配体键合到烷基甲硅烷基涂层。多于一个亲和配体可以键合到烷基甲硅烷基涂层。在其它实施方案中，酶键合到烷基甲硅烷基涂层。多于一种酶可以键合到烷基甲硅烷基涂层。
16.在一些实施方案中，烷基甲硅烷基涂层具有至少的厚度。
17.表面可以是孔板的内表面、小瓶的内表面或移液管的内表面。
18.在一些实施方案中，样品制备装置用于色谱分析。样品制备装置可用于质谱分析。
19.在一些实施方案中，烷基甲硅烷基是惰性涂层，例如烷基甲硅烷基涂层不与样品中的分析物相互作用。烷基甲硅烷基涂层可具有式i：
[0020][0021]
r1、r2、r3、r4、r5和r6各自独立地选自(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh、ora和卤素。ra表示与表面的附接点。r1、r2、r3、r4、r5和r6中的至少一者为ora。x为(c
1-c
20
)烷基、-o[(ch2)2o]
1-20-、-(c
1-c
10
)[nh(co)nh(c
1-c
10
)]
1-20-或-(c
1-c
10
)[烷基苯基(c
1-c
10
)烷基]
1-20-。
[0022]
在一些实施方案中，x为(c
2-c
10
)烷基。在一些实施方案中，x为乙基。r1、r2、r3、r4、r5和r6可各自为甲氧基或氯。在一些实施方案中，式i的烷基甲硅烷基涂层是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
[0023]
样品制备装置还可包括与式i的烷基甲硅烷基涂层直接接触的第二烷基甲硅烷基涂层。第二烷基甲硅烷基涂层可具有式ii：
[0024][0025]
r7、r8和r9各自独立地选自-nh(c
1-c6)烷基、-n[(c
1-c6)烷基]2、(c
1-c6)烷氧基、(c
1-c6)烷基、(c
1-c6)烯基、oh和卤素。r
10
选自(c
1-c6)烷基、-orb、-[o(c
1-c3)烷基]
1-10
o(c
1-c6)烷基和苯基，其中所述(c
1-c6)烷基任选地被一个或多个卤素取代，并且其中所述苯基任选地被一个或多个选自(c
1-c3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-c(o)nh2和羧基的基团取代。rb为-(c
1-c3)烷基环氧乙烷、-(c
1-c3)烷基-3,4-环氧基环己基或-(c
1-c4)烷基oh。r
10
的切割键表示r
10
与桥联甲硅烷基基团以形成烯烃的碳之间的任选附加共价键，前提条件是y不为0。y为0至20的整数。第二烷基甲硅烷基涂层可以改性式i的烷基甲硅烷基涂层。
[0026]
在一些实施方案中，y为2至9的整数。在一些实施方案中，y为9，r
10
为甲基，并且r7、r8和r9各自为乙氧基或氯。
[0027]
在一些实施方案中，式ii的烷基甲硅烷基涂层为(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷、正癸基三氯硅烷、三甲基氯硅烷、三甲基二甲基氨基硅烷或甲氧基-聚乙烯氧基(1-10)硅烷。在一些实施方案中，式ii的烷基甲硅烷基涂层为水解之后的(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷。式i的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式ii的烷基甲硅烷基涂层可以是(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷。在一些实施方案中，式i的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式ii的烷基甲硅烷基涂层为水解之后的(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷。式i的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式ii的烷基甲硅烷基涂层可以是正癸基三氯硅烷。在一些实施方案中，式i的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式ii的烷基甲硅烷基涂层为三甲基氯硅烷或三甲基二甲基氨基硅烷。式i的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式ii的烷基甲硅烷基涂层可以是甲氧基-聚乙烯氧基(3)硅烷。
[0028]
在一些实施方案中，样品制备装置还包括与式i的烷基甲硅烷基涂层直接接触的烷基甲硅烷基涂层，该烷基甲硅烷基涂层具有式iii，
[0029][0030]r11
、r
12
、r
13
、r
14
、r
15
和r
16
各自独立地选自(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh和卤素。z为(c
1-c
20
)烷基、-o[(ch2)2o]
1-20-、-(c
1-c
10
)[nh(co)nh(c
1-c
10
)]
1-20-或-(c
1-c
10
)[烷基苯基(c
1-c
10
)烷基]
1-20-。式iii的烷基甲硅烷基涂层可以改性式i的烷基甲硅烷基涂层。
[0031]
在一些实施方案中，式iii的烷基甲硅烷基涂层是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。式i的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式iii的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
[0032]
在一些实施方案中，i和iii的烷基甲硅烷基涂层具有约的总厚度。
[0033]
在一些实施方案中，烷基甲硅烷基涂层是活性涂层，例如该烷基甲硅烷基涂层与样品中的分析物反应。将该烷基甲硅烷基涂层选择成通过(1)排斥力、(2)次级相互作用或(3)不同于与固定相材料的相互作用的保留机制来与该样品中的至少一种分析物相互作用。
[0034]
在一些实施方案中，分析物和活性涂层是带负电的。分析物和活性涂层可以是带正电的。在一些实施方案中，次级相互作用是离子交换分配。
[0035]
在一些实施方案中，烷基甲硅烷基涂层具有式iv：
[0036][0037]
每个x独立地选自(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh、ora、rb、rc、rd和卤素。ra表示与样品制备装置或玻璃料的表面的附接点，并且至少一个x为ora。rb不存在，或表示疏水性改性剂。rc表示电荷改性剂，并且至少一个x为rc。rd为以下三者：不存在、螯合剂或冠醚。y为选自(c
1-c
20
)烷基、-o[(ch2)2o]
1-20-、-(c
1-c
10
)[nh(co)nh(c
1-c
10
)]
1-20-或-(c
1-c
10
)[烷基苯基(c
1-c
10
)烷基]
1-20-的桥联部分。
[0038]
在一些实施方案中，电荷改性剂(rc)为
[0039][0040]
z独立地选自(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh、卤素或与式
iv的附接点。至少一个z为与式iv的附接点。
[0041]
在一些实施方案中，电荷改性剂(rc)为
[0042][0043]
z独立地选自(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh、卤素或与式i的附接点。至少一个z为与式iv的附接点。
[0044]
在一些实施方案中，电荷改性剂(rc)为季胺。
[0045]
在一些实施方案中，存在疏水性改性剂(rb)。疏水性改性剂(rb)可具有净电中性。在一些实施方案中，疏水性改性剂(rb)为
[0046][0047]
z独立地选自(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh、卤素或与式iv的附接点。至少一个z为与式iv的附接点。
[0048]
在一些实施方案中，疏水性改性剂(rb)为
[0049][0050]
z独立地选自(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh、卤素或与式iv的附接点。至少一个z为与式iv的附接点。
[0051]
在一些实施方案中，存在rd。rd可为螯合剂，并且该螯合剂为乙二胺四乙酸。在一些实施方案中，rd为螯合剂，并且该螯合剂为羟乙磷酸。rd可为冠醚，并且该冠醚选自由18-冠-6、12-冠-4、15-冠-5、二苯并-18-冠-6和二氮杂-18-冠-6组成的组。
[0052]
亲和配体可以是抗体、单域抗体、适体、亲和体、链霉亲和素、蛋白a、蛋白g或蛋白l或它们的组合。
[0053]
在一些实施方案中，样品制备装置还包括接头(或间隔分子)以将亲和配体或酶共价键合到该烷基甲硅烷基涂层。接头可以是马来酰亚胺peg硅烷、nhs peg马来酰亚胺或peg二醛，其中peg重复介于3与300之间。在一些实施方案中，接头为戊二醛或丙烯酰氧基硅烷。
[0054]
在一些实施方案中，亲和配体或酶与烷基甲硅烷基涂层之间的共价键通过还原胺化形成。
[0055]
亲和配体可具有约1nmol/m2至约1000nmol/m2的表面覆盖率。在一些实施方案中，亲和配体可具有约2nmol/m2至约500nmol/m2的表面覆盖率。
[0056]
在一些实施方案中，酶选自蛋白酶、糖苷酶、连接酶、转移酶、氧化还原酶、异构酶、水解酶或它们的组合。酶可以是蛋白酶，并且该蛋白酶可以选自ides、idez或它们的组合。在一些实施方案中，酶是β-葡萄糖醛酸酶。酶可具有约1nmol/m2至约1000nmol/m2的表面覆盖率。在一些实施方案中，酶可具有约2nmol/m2至约500nmol/m2的表面覆盖率。
[0057]
在一些实施方案中，亲和配体具有seq id no:1所描绘的序列。亲和配体可以与seq id no:1所描绘的序列至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。
[0058]
在一些实施方案中，亲和配体具有seq idno:2所描绘的序列。亲和配体可以与seq id no:2所描绘的序列至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。
[0059]
在一些实施方案中，酶具有seq id no:3所描绘的序列。酶可以与seq id no:3所描绘的序列至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。
[0060]
在一些实施方案中，酶具有seq idno:4所描绘的序列。酶可以与seq id no:4所描绘的序列至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。
[0061]
在另一方面，本技术的特征在于一种用于富集样品的组分的样品制备装置。该样品制备装置包括与样品流体连通的表面；设置在表面上的烷基甲硅烷基涂层；由二氧化硅、有机二氧化硅或聚合物制成的树脂，该树脂共价键合到烷基甲硅烷基涂层；以及共价键合到树脂的亲和配体或酶。该样品制备装置可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
[0062]
在一些实施方案中，树脂通过硅烷共价键合到烷基甲硅烷基涂层。
[0063]
该样品制备装置可用于色谱分析、质谱分析或它们的组合。
[0064]
在另一方面，本技术的特征在于一种分析生物流体的方法。该方法包括提供样品制备装置。该样品制备装置包括与生物流体流体连通的表面、设置在表面上的烷基甲硅烷基涂层以及共价键合到烷基甲硅烷基涂层的亲和配体。该方法还包括将包含分析物的生物流体抽吸到样品制备装置的表面上以形成亲和复合物，使得该分析物被吸附。所吸附的分析物用中性等渗缓冲液洗涤。所吸附的分析物从样品制备装置的表面洗脱。该方法还包括使用液相色谱、质谱、elisa、毛细管电泳或它们的组合分析所洗脱的样品。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
[0065]
在一些实施方案中，该样品制备装置是96孔微洗脱板、锥形底小瓶或移液管吸头。
[0066]
亲和配体可能够捕获人免疫球蛋白fc结构域。在一些实施方案中，亲和配体是核酸适体、免疫球蛋白、单域vhh骆驼科抗体或它们的组合。
[0067]
在另一方面，本技术的特征在于一种分离生物流体的方法。该方法包括提供玻璃料。玻璃料包括与生物流体流体连通的表面、设置在表面上的烷基甲硅烷基涂层以及共价键合到烷基甲硅烷基涂层的亲和配体。玻璃料被定位在色谱柱的入口处。该方法还包括将包含分析物的生物流体装载到玻璃料的表面上，捕获分析物以形成亲和复合物，使得分析物被吸附在玻璃料的表面上，同时生物流体的其余部分通过色谱柱，从玻璃料的表面洗脱所吸附的分析物，使得分析物通过色谱柱，以及用检测器检测分析物。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
[0068]
在一些实施方案中，色谱柱是尺寸排阻色谱柱。检测器可为质谱仪。
[0069]
在一些实施方案中，生物流体包含基于人源化mab的治疗剂。
[0070]
亲和配体可以是抗人fc适体、抗人fc免疫球蛋白抗体、抗人fc单域抗体配体或它
们的组合。
[0071]
在另一方面，本技术的特征在于一种用于定量阿片类葡萄糖苷酸的方法。该方法包括提供样品制备装置。该样品制备装置包括与包含阿片类葡萄糖苷酸的样品流体连通的表面、设置在表面上的烷基甲硅烷基涂层以及共价键合到烷基甲硅烷基涂层的β-葡萄糖醛酸酶。该方法还包括将包含阿片类葡萄糖苷酸的样品抽吸到样品制备装置的表面上，使得阿片类葡萄糖苷酸被水解。从样品制备装置的表面回收经水解的阿片类葡萄糖苷酸。将所回收的经水解的阿片类葡萄糖苷酸注射到液相色谱柱上。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
[0072]
在另一方面，本技术的特征在于制备包含用于肽作图的蛋白质的样品的方法。该方法包括提供样品制备装置。该样品制备装置包括与包含蛋白质的样品流体连通的表面、设置在表面上的烷基甲硅烷基涂层以及共价键合到烷基甲硅烷基涂层的蛋白酶，其中该蛋白酶是胰蛋白酶、lys-c、arg-c、lys-n、glu-c、asp-n、胃蛋白酶或它们的组合。该方法还包括将包含蛋白质的样品抽吸到样品制备装置的表面上，使得蛋白质被消化成肽片段。从样品制备装置回收肽片段，并将肽片段注射到液相色谱柱上。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
[0073]
在一些实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶、lys-c、asp-n或它们的组合。
[0074]
烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷，并且蛋白酶可以是胰蛋白酶，其中胰蛋白酶通过马来酰亚胺peg硅烷接头共价键合到双(三氯甲硅烷基)乙烷。在一些实施方案中，马来酰亚胺peg硅烷接头是：
[0075][0076]
其中n介于3与300之间。
[0077]
在一些实施方案中，烷基甲硅烷基涂层是用三乙氧基甲硅烷基丁醛改性的双(三氯甲硅烷基)乙烷，并且蛋白酶是胰蛋白酶，其中胰蛋白酶通过还原胺化共价键合到三乙氧基甲硅烷基丁醛改性的双(三氯甲硅烷基)乙烷。烷基甲硅烷基涂层可以是用3-氨基丙基三甲氧基硅烷改性的双(三氯甲硅烷基)乙烷，并且蛋白酶可以是胰蛋白酶，其中胰蛋白酶通过用peg二醛还原胺化共价键合到3-氨基丙基三甲氧基硅烷改性的双(三氯甲硅烷基)乙烷。在一些实施方案中，peg二醛是：
[0078][0079]
其中n介于3与300之间。
[0080]
在一些实施方案中，烷基甲硅烷基涂层是用三乙氧基甲硅烷基丁醛和丙烯酸酯peg胺改性的双(三氯甲硅烷基)乙烷，并且蛋白酶是胰蛋白酶，其中胰蛋白酶通过还原胺化和迈克尔加成共价键合到改性的双(三氯甲硅烷基)乙烷。丙烯酸酯peg胺可以是：
[0081][0082]
其中n介于3与300之间。
[0083]
在一些实施方案中，烷基甲硅烷基涂层是用丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷改性的双(三氯甲硅烷基)乙烷，并且蛋白酶是胰蛋白酶，其中胰蛋白酶通过迈克尔加成共价键合到丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷改性的双(三氯甲硅烷基)乙烷。
[0084]
在另一方面，本技术的特征在于一种分析包含单克隆抗体(mab)的样品的方法。该方法包括提供样品制备装置。该样品制备装置包括与包含mab的样品流体连通的表面、设置在表面上的烷基甲硅烷基涂层以及共价键合到烷基甲硅烷基涂层的酶，其中酶为ides、idez、igde、gingipain k或它们的组合。该方法还包括将包含mab的样品抽吸到样品制备装置的表面上，使得mab被片段化成亚基。从样品制备装置回收mab的亚基，并将mab的亚基注射到液相色谱柱上。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
[0085]
在另一方面，本技术的特征在于一种分析包含糖蛋白的样品的方法。该方法包括提供样品制备装置。该样品制备装置包括与包含糖蛋白的样品流体连通的表面、设置在表面上的烷基甲硅烷基涂层以及共价键合到烷基甲硅烷基涂层的pngase f酶。该方法还包括将包含糖蛋白的样品抽吸到样品制备装置的表面上，使得糖蛋白的聚糖被裂解。从样品制备装置回收去糖基化的糖蛋白，并将去糖基化的糖蛋白注射到液相色谱柱上。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个实施方案。
附图说明
[0086]
图1是根据本技术的说明性实施方案的用于富集样品的组分的样品制备装置的示意图。
[0087]
图2是根据本技术的说明性实施方案的用于富集样品的组分的微体积孔的示意图。
[0088]
图3是根据本技术的说明性实施方案的微体积孔的示意图，该微体积孔已经被衍生化以具有含固定生物配体的涂覆表面和次级树脂层。
[0089]
图4是示出根据本技术的说明性实施方案的活性涂层的示例性实施方案的图。
[0090]
图5a是总结根据本技术的说明性实施方案的涂层和固定生物配体的几个示例的表格。
[0091]
图5b是图5a的表格的延续，示出了根据本技术的说明性实施方案的与式ii和式iii相关的附加列。
[0092]
图5c是图5a和图5b的表格的延续，示出了根据本技术的说明性实施方案的与连接和生物配体相关的附加列。
具体实施方式
[0093]
本技术包括装置、组合物和使用装置和lc流动路径部件(例如，玻璃料)的方法，该部件用有机二氧化硅(烷基甲硅烷基)官能团改性并衍生化以承载固定的亲和配体和/或酶。使用这项技术创建有利于用于各种类型的离线和在线液相色谱-质谱(lc-ms)样品制备
的表面，该样品制备范围为从生物流体中的单克隆抗体(mab)的定量到用于辅助定量阿片类葡萄糖苷酸的β-葡萄糖醛酸酶装置的使用。在一个示例性实施方案中，表面被气相沉积涂覆有烷基甲硅烷基涂层，并且随后使用液相反应处理，使得固定对人免疫球蛋白fc结构域具有捕获选择性的亲和配体。
[0094]
装置
[0095]
图1是用于富集样品的组分的样品制备装置100的示意图。装置100包括具有表面110的基底105。表面与样品流体连通。基底105可以是例如孔板、小瓶、移液管或用于样品制备的任何其他基底。表面110可以是孔板(也称为微洗脱板)的内表面(例如，与样品流体连通的表面)、小瓶(例如，锥形底小瓶)的内表面或移液管(例如，移液管吸头)的内表面。表面110可以是与样品流体连通或接触的任何表面，例如色谱柱的入口处的玻璃料。烷基甲硅烷基(有机二氧化硅)涂层115设置在表面110上。烷基甲硅烷基涂层115可以通过多种方式设置在表面110上，例如，烷基甲硅烷基涂层115可以气相沉积在表面110上。生物配体120例如亲和配体和/或酶可共价键合125到烷基甲硅烷基涂层115。样品制备装置100可用于色谱分析和/或质谱分析。
[0096]
图2是用于富集样品的组分的微体积孔200的示意图。微体积孔200可以是孔板例如96孔板的一部分。如上所讨论的，微体积孔200具有与样品流体连通的表面205(例如，内表面)。烷基甲硅烷基涂层210设置在表面205上。在一些实施方案中，存在沉积到烷基甲硅烷基涂层210上的任选的表面改性涂层215。任选的表面改性涂层215可以是例如第二烷基甲硅烷基涂层、电荷改性剂、疏水性改性剂、螯合剂和/或冠醚。生物配体220例如亲和配体和/或酶可共价键合到烷基甲硅烷基涂层210或任选的表面改性涂层215。微体积孔200可用于色谱分析和/或质谱分析。
[0097]
图3是微体积孔300的示意图，该微体积孔已经被衍生化以具有含固定生物配体的涂覆表面和次级树脂层。微体积孔300可以是孔板例如96孔板的一部分。如上所讨论的，微体积孔300具有与样品流体连通的表面305(例如，内表面)。烷基甲硅烷基涂层310设置在表面305上。在一些实施方案中，存在任选的表面改性涂层(未示出)。由二氧化硅、有机二氧化硅或聚合物制成的树脂315共价键合到烷基甲硅烷基涂层310(或任选的表面改性涂层)。树脂315可以通过硅烷共价键合到烷基甲硅烷基涂层310。生物配体320例如亲和配体和/或酶共价键合到树脂315。微体积孔300可用于色谱分析和/或质谱分析。
[0098]
树脂315可以源自由二氧化硅、有机二氧化硅或聚合物制成的球形或非球形不规则颗粒。树脂315可以在烷基甲硅烷基涂层310上形成层。树脂315增加了其中生物配体320可以键合的表面积，并且因此增加了样品制备装置(图3中的微体积孔300)的容量。无孔树脂可用于对扩散效应敏感的应用。多孔树脂可用于对具有高表面积更关键的场合，因为树脂的孔会增加总表面积。
[0099]
烷基甲硅烷基涂层
[0100]
有机二氧化硅(烷基甲硅烷基)是用于涂覆金属流动路径部件和聚合物流动路径部件两者的通用组合物，该流动路径部件范围可以是从样品制备装置、注射器针和柱前加热器到柱后管材、柱外壳、玻璃料、检测器流通池和电喷雾针。有机二氧化硅(烷基甲硅烷基)涂层可经由气相或溶液相反应并且用大量不同的硅烷化试剂施加。例如，烷基甲硅烷基涂层可经由气相沉积来施加。
[0101]
在一个实施方案中，有利的是首先经由气相沉积施加双-甲硅烷基或三-甲硅烷基桥联硅烷试剂以实现高构建、厚的基层(例如，如本文所述的式i)，这可以使用先前描述的技术(例如，于2018年9月17日提交并于2019年3月21日作为美国专利公布号2019-0086371公开的美国专利申请号16/133,089中描述的那些，该专利的全部内容以引用方式并入本文)实现。一种经证实用于形成该基层的示例性硅烷是双(三氯甲硅烷基)乙烷。任选地，该基层可以用电荷改性或疏水性/亲水性改性硅烷化试剂(包括但不限于本文所述的用于电荷改性剂(rc)和疏水性改性剂(rb)的试剂)改性。这些表面改性剂可由解离常数选定在期望pka范围内的强酸/碱或弱酸/碱构成，并且可包括但不限于三甲氧基甲硅烷基丙基甲基膦酸酯和n,n-(二乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷。也可使用具有固定电荷的表面改性剂，诸如季胺。另选地，可以使用含伯胺和仲胺的硅烷，它们也为随后的固定反应提供亲核物质。此外，含醛的硅烷，诸如三乙氧基甲硅烷基丁醛，可用于提供用于还原胺化连接的位点或用于迈克尔加成的丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。这些表面改性剂可以在气相沉积过程期间或通过次级液相反应原位掺入。在一些情况下，这些液相反应可能有必要包括多个步骤，以便建立改性硅烷的期望厚度和/或覆盖率。待用电荷改性剂改性的表面可具有约0.01μmol/m2至约10μmol/m2、约0.02μmol/m2至约1μmol/m2的覆盖率。在另一个实施方案中，桥联硅烷基层可另选地用净中性电荷疏水性改性剂(本文所述的rb)衍生化。在其他实施方案中，它们不被衍生化。涵盖在这些试剂选择内的是两性离子改性剂，诸如羧基甜菜碱和磺基甜菜碱试剂。两性离子改性剂可提供宏观净中性表面，但也可赋予微观库仑效应，该微观库仑效应可抗结合或排斥广泛范围的分析物，包括具有不同电荷特性的那些分析物。与带电荷的表面改性剂一样，疏水性改性剂可以范围从0.01μmol/m2至10μmol/m2的表面覆盖率沉积。
[0102]
术语“约”表示其后跟随的值不是精确值，而是该值的+/-5％范围的中心点。如果该值是以百分比给出的相对值，则术语“约”还表示其后跟随的值不是精确值，而是该值的+/-5％范围的中心点，由此该范围的上限不能超过100％的值。
[0103]
可以使用的示例性烷基甲硅烷基涂层包括生物惰性涂层，例如于2018年9月17日提交并于2019年3月21日作为美国专利公布号2019-0086371公开的美国专利申请号16/133,089中描述的那些，该专利的全部内容以引用方式并入本文。此外，也可使用活性涂层(与分析物或流动相相互作用的涂层)。
[0104]
惰性涂层
[0105]
在一些方面，烷基甲硅烷基涂层用于改性色谱系统的样品制备装置或流动路径以解决与例如分析物的相互作用。即，烷基甲硅烷基涂层可以是生物惰性的低结合涂层，其最大程度减少与金属相互作用分析物的表面反应，并允许分析物沿流动路径经过而不阻塞、不附接到表面或不改变分析物特性。减少/消除这些相互作用是有利的，因为这允许精确定量和分析包含金属相互作用的分析物的样品，例如生物分子、蛋白质、聚糖、肽、寡核苷酸、杀虫剂、双膦酸、阴离子代谢物以及两性离子比如氨基酸和神经递质。烷基甲硅烷基涂层可具有式i：
[0106][0107]
r1、r2、r3、r4、r5和r6各自独立地选自(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh、ora和卤素。ra表示与样品制备装置的内表面(例如图1的内表面110)或玻璃料的表面的附接点。r1、r2、r3、r4、r5和r6中的至少一者为ora。x为(c
1-c
20
)烷基、-o[(ch2)2o]
1-20-、-(c
1-c
10
)[nh(co)nh(c
1-c
10
)]
1-20-或-(c
1-c
10
)[烷基苯基(c
1-c
10
)烷基]
1-20-。
[0108]
在一些实施方案中，x为(c
2-c
10
)烷基。x可以是乙基。在一些实施方案中，r1、r2、r3、r4、r5和r6各自为甲氧基或氯。式i的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
[0109]
在一些实施方案中，组件还包括与式i的烷基甲硅烷基涂层直接接触的第二烷基甲硅烷基涂层。第二烷基甲硅烷基涂层具有式ii：
[0110][0111]
r7、r8和r9各自独立地选自-nh(c
1-c6)烷基、-n[(c
1-c6)烷基]2、(c
1-c6)烷氧基、(c
1-c6)烷基、(c
1-c6)烯基、oh和卤素。r
10
选自(c
1-c6)烷基、-orb、-[o(c
1-c3)烷基]
1-10
o(c
1-c6)烷基和苯基。(c
1-c6)烷基任选地被一个或多个卤素取代。苯基任选地被一个或多个选自(c
1-c3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-c(o)nh2和羧基的基团取代。rb为-(c
1-c3)烷基环氧乙烷、-(c
1-c3)烷基-3,4-环氧基环己基或-(c
1-c4)烷基oh。r
10
的切割键表示r
10
与桥联甲硅烷基基团以形成烯烃的碳之间的任选附加共价键，前提条件是y不为0。y为0至20的整数。
[0112]
在一些实施方案中，y为2至9的整数。在一些实施方案中，y为9，r
10
为甲基，并且r7、r8和r9各自为甲氧基、乙氧基或氯。式ii的烷基甲硅烷基涂层可以是(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷、正癸基三氯硅烷、三甲基氯硅烷、三甲基二甲基氨基硅烷或甲氧基-聚乙烯氧基(1-10)硅烷。在一些实施方案中，式ii的烷基甲硅烷基涂层为水解之后的(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷。
[0113]
式i的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式ii的烷基甲硅烷基涂层可以是(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷。在一些实施方案中，式i的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式ii的烷基甲硅烷基涂层为水解之后的(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷。式i的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式ii的烷基甲硅烷基涂层可以是正癸基三氯硅烷。在一些实施方案中，式i的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式ii的烷基甲硅烷基涂层为三甲基氯硅烷或三甲基二甲基氨基硅烷。式i的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式ii的烷基甲硅烷基涂层可以是甲氧基-聚乙烯氧基(3)硅烷。
[0114]
在一些实施方案中，组件还包括烷基甲硅烷基涂层，该烷基甲硅烷基涂层具有式
iii，与式i的烷基甲硅烷基涂层直接接触。式iii的烷基甲硅烷基涂层为：
[0115][0116]r11
、r
12
、r
13
、r
14
、r
15
和r
16
各自独立地选自(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh和卤素。z为(c
1-c
20
)烷基、-o[(ch2)2o]
1-20-、-(c
1-c
10
)[nh(co)nh(c
1-c
10
)]
1-20-或-(c
1-c
10
)[烷基苯基(c
1-c
10
)烷基]
1-20-。
[0117]
在一些实施方案中，式iii的烷基甲硅烷基涂层是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。式i的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式iii的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
[0118]
在本技术中，样品制备装置或玻璃料的表面上的蒸气沉积的烷基甲硅烷基涂层改性该表面并减少次级相互作用。因此，它们是生物惰性的或低结合的(意味着样品的分析物不与烷基甲硅烷基涂层相互作用)。此外，沉积的涂层是高度可调的，以提供一系列期望的接触角(例如，使润湿表面为亲水的或疏水的))、化学性质和特性，以实现对流动路径以及最终通过流动路径的样品的期望效果。
[0119]
烷基甲硅烷基涂层的厚度可为至少约例如，厚度可以在约至约之间。式i的多层烷基甲硅烷基涂层的厚度可为约
[0120][0121]
表1中提供了具有其相应近似厚度和接触角的示例性涂层。
[0122]
表1
[0123][0124][0125]
活性涂层
[0126]
除了惰性涂层之外，还有益的是用表现出对色谱分离有影响的化学特性的有机二氧化硅(烷基甲硅烷基)官能团对包括样品制备装置和玻璃料在内的流动路径部件进行改性。这些所谓的“活性”涂层可引入与分析物的库仑排斥效应，以防止它们以不利地影响色谱分离的方式与流动路径的底物材料(例如，金属、塑料等)相互作用。此外，可产生“活性”涂层，其通过微妙的次级相互作用为分离增加增强的选择性。此外，可制备提供完全正交的
保留机构的“活性”涂层，该“活性”涂层有利于在与用柱的固定相实现的工艺不同的工艺中吸附、分配和解吸分析物。活性涂层还可与流动相相互作用以对色谱分离产生期望的效果，例如以增强选择性。
[0127]
样品制备装置或玻璃料的表面的至少一部分涂覆有具有式iv的烷基甲硅烷基涂层：
[0128][0129]
式iv的每个x独立地选自(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh、ora、rb、rc、rd和卤素。在一些实施方案中，式iv的x独立地选自ora、rb、rc和rd。(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh和卤素是反应性/可水解基团。在一些实施方案中，这些基团提供残余反应性基团，其中当涉及硅烷反应性时氨基》卤素》烷氧基。在一些实施方案中，所用的具体涂层(例如，式iv中x的具体选择)取决于正在进行的色谱分离的类型。目标是在存在于色谱流动路径中的各种材料上形成化学稳定(良好保质期)的涂层。然而，亲水性涂层在反相液相色谱中不具有相互作用，而亲水性涂层可在亲水性相互作用色谱中表现出一些保留。虽然一个涂层可足以进行多种不同的化学分离，但也可将不同的涂层用于不同的液相色谱模式。
[0130]
ra表示与样品制备装置的表面的附接点，并且至少一个x为ora。rb不存在，或表示疏水性改性剂。rc表示电荷改性剂，并且至少一个x为rc。rd为以下三者：不存在、螯合剂或冠醚。y为选自(c
1-c
20
)烷基、-o[(ch2)2o]
1-20-、-(c
1-c
10
)[nh(co)nh(c
1-c
10
)]
1-20-或-(c
1-c
10
)[烷基苯基(c
1-c
10
)烷基]
1-20-的桥联部分。y的选择可由化学方面考虑和物理方面考虑两者来决定。
[0131]
因此，式iv的烷基甲硅烷基涂层具有至少一个为ora的x、与样品制备装置的表面的附接点和至少一个为rc(其表示电荷改性剂)的x。疏水性改性剂rb和螯合剂或冠醚rd可不存在。在一些实施方案中，式iv的烷基甲硅烷基涂层具有电荷改性剂。在一些实施方案中，式iv的烷基甲硅烷基涂层具有电荷改性剂和疏水性改性剂。在一些实施方案中，式iv的烷基甲硅烷基涂层具有电荷改性剂以及螯合剂或冠醚。在一些实施方案中，式iv的烷基甲硅烷基涂层具有电荷改性剂、疏水性改性剂以及螯合剂或冠醚。
[0132]
在其他实施方案中，式iv的烷基甲硅烷基涂层具有至少一个为ora的x、与样品制备装置的表面的附接点和至少一个为rd(其表示螯合剂或冠醚)的x。在一些实施方案中，式iv的烷基甲硅烷基涂层具有螯合剂或冠醚以及疏水性改性剂。
[0133]
当在化学式的上下文中使用时，连字符(
“‑“
)指示附接点。例如，当y为-[(c
1-c
10
)烷基苯基(c
1-c
10
)烷基]
1-20-时，这意味着y经由(c
1-c
10
)烷基连接到一个six3，并且经由另一个(c
1-c
10
)烷基连接到另一个six3。这适用于其余的变量。
[0134]
在一个实施方案中，式iv中的y为(c
1-c
15
)烷基、(c
1-c
12
)烷基或(c
1-c
10
)烷基。在一些实施方案中，式iv中的y为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、壬基或癸基。在另一方面，式iv中的y为乙基或癸基。
[0135]
在一些实施方案中，式iv的x可以是另一个y桥联部分。这样，烷基甲硅烷基涂层可
具有由两个分开的y桥联部分桥联的多于两个si原子。当多个y桥联部分在烷基甲硅烷基涂层中时，y桥联部分可以是相同的y部分或不同的y部分。多个桥联部分可导致烷基甲硅烷基涂层处于直链或支链状态。此外，具有多个y桥联部分的烷基甲硅烷基涂层可利用广泛的桥联进行高度交联。第一桥联烷基甲硅烷基组合物可以是高度交联的，具有一定的表面异质性以及桥联部分与硅烷醇的混合。然后可用本文所述的改性剂(例如，电荷改性剂、疏水性改性剂、螯合剂和/或冠醚、或表面活性剂)中的一种或多种改性剂对该表面进行改性。
[0136]
在一些实施方案中，活性烷基甲硅烷基涂层至少部分地由如本文所述的式iv构成。这样，式iv的烷基甲硅烷基涂层为涂层的至少一部分。所述涂层可具有利用如本文所述的多种改性剂的其他y桥联部分。
[0137]
在一些实施方案中，使用单一改性剂，例如单一电荷改性剂。在其他实施方案中，使用多种改性剂，例如多种电荷改性剂或者电荷改性剂与疏水性改性剂的组合。
[0138]
电荷改性剂(rc)
[0139]
可将电荷改性盐化试剂施加到合适的基底层上。这些带电荷表面改性剂由解离常数选定在期望pka范围内的强酸/碱或弱酸/碱构成，并且可包括但不限于三甲氧基甲硅烷基丙基甲基膦酸酯和n,n-(二乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷。也可使用具有固定电荷的表面改性剂，诸如季胺。例如，对于带负电核酸或磷酸肽的分离，表面电荷可以是负电荷。在此类情况下，分析物被从表面排斥并且未因非特异性吸附而造成损失。
[0140]
电荷改性剂(rc)可与样品中的至少一种分析物具有相同的电荷。当电荷改性剂与样品中的至少一种分析物具有相同的电荷时，电荷改性剂向具有相同电荷的样品引入库仑排斥效应(即，如电荷排斥)。例如，分析物和活性涂层都可带负电。分析物和活性涂层都可带正电。这种排斥效应保护分析物不与流动路径的底物材料相互作用。合适的电荷改性剂的选择也可取决于实际限制，例如合适的硅烷试剂是否有来源，或者如果其需要合成，则其可蒸发或制备成可溶于合适的溶剂体系中以进行反应。此外，应当考虑所得涂层的稳定性。例如，同时作为亲核物质的强碱可能是有问题的，因为其可自催化其水解降解。
[0141]
除了向具有相同电荷的样品引入库仑排斥效应之外，电荷改性剂还可通过经由与所实施液相色谱柱的保留机构正交的保留机构强效保留一类分析物来促进多维色谱。例如，将吸附至具有含电荷改性剂的烷基甲硅烷基涂层的流动路径部件(例如，色谱柱的入口处的玻璃料)的分析物以分散流动相变化梯度或一组分散流动相变化洗脱到下游色谱柱，并因此在色谱柱的填充床上进行次级梯度的洗脱。作为另一示例，分析物吸附到样品制备装置，该样品制备装置具有含电荷改性剂的烷基甲硅烷基涂层。
[0142]
电荷改性剂可以是例如以下电荷改性剂中的任何一种或多种电荷改性剂：季胺、
[0143]
[0144][0145]
z独立地选自(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh、卤素或与式iv的附接点。至少一个z为与式iv的附接点。因此，电荷改性剂通过甲硅烷基醚部分与式iv的烷基甲硅烷基涂层共价键合。相应的电荷改性试剂可用于获得最终涂层产品的电荷改性剂，例如，电荷改性试剂可以是三甲氧基甲硅烷基丙基甲基膦酸酯或n,n-(二乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷或2-(4-吡啶基乙基)三乙氧基硅烷。
[0146]
在一些实施方案中，将单一电荷改性剂施加到气相沉积的烷基甲硅烷基(式iv)涂层。在其他实施方案中，将多种电荷改性剂施加到气相沉积的烷基甲硅烷基(式iv)涂层。多种电荷改性剂可以是在式iv的多个x位置处施加的相同电荷改性剂。另选地，多种电荷改性剂可以是在式iv的不同x位置处施加的不同电荷改性剂。
[0147]
在一些实施方案中，气相沉积的烷基甲硅烷基涂层可有意地掺杂有带电表面改性剂(rc)，例如2018年12月25日公布的名称为“high purity chromatographic materials comprising an ionizable modifier”的美国专利号10,159,911的带电表面改性剂，该专利的全部内容据此以引用方式并入。
[0148]
电荷改性剂(rc)可具有介于约0.01μmol/m2至约10μmol/m2之间的表面覆盖率。在一些实施方案中，电荷改性剂(rc)具有介于约0.02μmol/m2至约1μmol/m2之间的表面覆盖率。在一些实施方案中，电荷改性剂(rc)具有介于约0.1μmol/m2至约1μmol/m2之间的表面覆盖率。
[0149]
可由图4的涂层#3得到的具有含电荷改性剂(rc)的式iv的烷基甲硅烷基涂层的活性涂层的示例示于下文中。虽然下文所示的最终烷基甲硅烷基涂层具有用于其他电荷改性剂(rc)的多个点，但这些点也可以是(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh或卤素，如本文所述。此外，虽然下文所示的最终烷基甲硅烷基涂层具有用于其他电荷改性剂(rc)的多个点，但这些点也可以是疏水性改性剂(rb)和/或螯合剂或冠醚。下文所示的电荷改性剂(rc)也可以是与样品制备装置的表面的其他附接点，即ra。
[0150][0151]
疏水性改性剂(rb)
[0152]
在一些实施方案中，将具有电荷改性剂(rc)的烷基甲硅烷基涂层与疏水性改性剂(rb)组合。疏水性改性剂可具有净电中性。涵盖在疏水性改性剂的试剂选择内的是两性离子改性剂，诸如羧基甜菜碱和磺基甜菜碱试剂。两性离子改性剂提供宏观净中性表面，但也赋予微观库仑效应，该微观库仑效应可排斥广泛范围的分析物，包括具有不同电荷特性的那些分析物。
[0153]
疏水性改性剂(rb)可具有介于约0.01μmol/m2至约10μmol/m2之间的表面覆盖率。在一些实施方案中，疏水性改性剂(rb)具有介于约0.03μmol/m2至约0.9μmol/m2之间的表面覆盖率。在一些实施方案中，疏水性改性剂(rb)具有介于约0.5μmol/m2至约3μmol/m2之间的表面覆盖率。
[0154]
疏水性改性剂(rb)通过甲硅烷基醚部分附接到式iv，并且具有选自下列中的一者或多者的组成：
[0155]
[0156][0157]
z独立地选自(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh、卤素或与式iv的附接点。至少一个z为与式iv的附接点。因此，疏水性改性剂通过甲硅烷基醚部分共价键合到式iv的烷基甲硅烷基涂层。可使用对应的疏水性改性试剂来获得最终涂层产品的电荷改性剂，例如，电荷改性试剂可以是(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷、经水解的(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷、正癸基三氯硅烷或n-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)葡糖酰胺。
[0158]
对应于本技术的烷基甲硅烷基涂层的示例性实施方案的若干涂层示于图4中。这些涂层包括仅具有电荷改性剂(rc)的涂层，例如涂层#1和#3，以及具有电荷改性剂(rc)和疏
水性改性剂(rb)两者的涂层，例如涂层#2、#4和#5。
[0159]
疏水性改性剂与电荷改性剂的组合可用于增加微弱但控制良好的次级相互作用。由于具有几乎相同的疏水性而原本可能共洗脱的分子可通过例如涂覆有图4所示的涂层#4的玻璃料，其中当基于水和乙腈之间的梯度的流动相与不同酸性、疏水性和离子配对强度的酸改性剂一起施加时，分子可经历微弱的离子交换分配。甲酸改性的流动相就这一点而言特别有用，因为它不减弱静电效应。当分离例如肽、测定柠檬酸循环代谢物和聚糖时，这可能是特别有用的。疏水性改性剂与电荷改性剂的组合也可用于亲水性相互作用色谱中。
[0160]
可由图4的涂层#4得到的具有含电荷改性剂(rc)和疏水性改性剂(rb)的式iv的烷基甲硅烷基涂层的活性涂层的示例示于下文中。虽然下文所示的所得涂层具有多种电荷改性剂(rc)，但这些点中的任一个或全部点可以是疏水性改性剂(rb)或(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh、或卤素或螯合剂或冠醚，如本文所述。在一些实施方案中，电荷改性剂(rc)和疏水性改性剂(rb)无需直接连接，例如，电荷改性剂(rc)和疏水性改性剂(rb)可通过具有y(如本文所定义)化学组成的一个或多个桥联硅部分连接。
[0161][0162]
螯合剂和冠醚(rd)
[0163]
在一些实施方案中，将具有电荷改性剂(rc)的烷基甲硅烷基涂层与离子清除配体(例如螯合剂或冠醚)(即，rd存在)组合。螯合剂可以是例如乙二胺四乙酸或羟乙磷酸。冠醚可以是例如18-冠-6、12-冠-4、15-冠-5、二苯并-18-冠-6或二氮杂-18-冠-6。
[0164]
螯合剂和冠醚可通过直接共价附接或通过使用次级接头部分而共价附接到硅烷化/烷基甲硅烷基涂层上。螯合剂和冠醚可清除可存在于流动相、流动路径和体系中的离子，例如ca
2+
、fe
3+
和/或k
+
，这些离子导致不期望的气相离子加合物，并且造成质谱仪结垢和停用。例如，螯合剂或冠醚可将金属离子拉出流动相以改善ms谱。通常，甚至ms级流动相也将包含痕量的金属离子，诸如钠和钾，因此质谱的质量通常受影响。50ppb浓度的钾可产生2％至10％相对强度的钾化加合物离子。诸如此类的活性涂层可多价螯合这些金属离子，从而确保它们在电离时不存在于色谱流出物中。继而，即使当采用具有可疑纯度的流动相时，也可用低于2％相对强度的离子加合物信号获得质谱。当本技术与色谱柱的入口处的玻璃料组合使用时，螯合剂和冠醚的使用可能是有用的。虽然不限于理论，但据信，可以将螯合剂改性的烷基硅烷涂层与固定配体组合，以便消耗来自样品的某些离子。可以利用此以消除具有下游检测的某些干扰或促进特定类型的缓冲液交换。
[0165]
在一些实施方案中，螯合剂和冠醚可在不存在电荷改性剂的情况下与式iv的烷基甲硅烷基涂层直接组合。
[0166]
在一些实施方案中，螯合剂和冠醚也可与本文所述的疏水性改性剂结合使用。在一些实施方案中，螯合剂和冠醚可与本文所述的电荷改性剂和疏水性改性剂两者结合使用。
[0167]
因此，当螯合剂和/或冠醚用作活性涂层时，可以涂覆样品制备装置的表面或色谱柱的入口处的玻璃料。样品制备装置或玻璃料的至少一部分涂覆有具有式iv的烷基甲硅烷基涂层：
[0168][0169]
其中每个x独立地选自(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh、ora、rb、rc、rd和卤素。ra表示与样品制备装置或玻璃料的内表面的附接点，并且至少一个x为ora。rb不存在，或表示疏水性改性剂。rc不存在，或表示电荷改性剂。rd表示螯合剂或冠醚，并且至少一个x为rd。y为选自(c
1-c
20
)烷基、-o[(ch2)2o]
1-20-、-(c
1-c
10
)[nh(co)nh(c
1-c
10
)]
1-20-或-(c
1-c
10
)[烷基苯基(c
1-c
10
)烷基]
1-20-的桥联部分。
[0170]
抑菌改性剂
[0171]
样品制备装置或色谱柱的入口处的玻璃料的表面的至少一部分涂覆有具有式iv的烷基甲硅烷基涂层：
[0172][0173]
其中每个x独立地选自(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh、ora、rb、rc、rd、re和卤素。ra表示与样品制备装置或玻璃料的表面的附接点，并且至少一个x为ora。rb不存在，或表示疏水性改性剂。rc不存在，或表示电荷改性剂。rd不存在，或表示螯合剂或冠醚。re为抑菌部分，并且至少一个x为re。y为选自(c
1-c
20
)烷基、-o[(ch2)2o]
1-20-、-(c
1-c
10
)[nh(co)nh(c
1-c
10
)]
1-20-或-(c
1-c
10
)[烷基苯基(c
1-c
10
)烷基]
1-20-的桥联部分。
[0174]
在一些实施方案中，抑菌部分为两性离子。两性离子涂层可通过用双(三氯甲硅烷基)乙烷硅烷化，然后用n,n-(二乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷衍生化，并且随后与氯代或溴代烷基羧酸反应来制备。在一些实施方案中，抑菌部分为季胺。
[0175]
抑菌部分可单独使用，或与电荷改性剂、疏水性改性剂和/或螯合剂或冠醚结合使用。
[0176]
表面活性剂
[0177]
在一些实施方案中，表面活性剂可用作活性涂层以溶解蛋白质(包括疏水性膜蛋白)，并且提供有利于酶反应(诸如蛋白水解和聚糖释放)的变性环境。
[0178]
样品制备装置或玻璃料的表面的至少一部分涂覆有具有式iv的烷基甲硅烷基涂层：
[0179][0180]
其中每个x独立地选自(c
1-c6)烷氧基、-nh(c
1-c6)烷基、-n((c
1-c6)烷基)2、oh、ora、
rb、rc、rd、re、rf和卤素。ra表示与样品制备装置或玻璃料的表面的附接点，并且至少一个x为ora。rb不存在，或表示疏水性改性剂。rc不存在，或表示电荷改性剂。rd不存在，或表示螯合剂或冠醚。re不存在，或表示抑菌部分。rf表示表面活性剂，并且至少一个x为rf。y为选自(c
1-c
20
)烷基、-o[(ch2)2o]
1-20-、-(c
1-c
10
)[nh(co)nh(c
1-c
10
)]
1-20-或-(c
1-c
10
)[烷基苯基(c
1-c
10
)烷基]
1-20-的桥联部分。
[0181]
在一些实施方案中，表面活性剂(rf)为十二烷基硫酸钠、3-10(癸基二甲基铵)丙烷磺酸盐两性洗涤剂、脱氧胆酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、triton、聚山梨酸酯或它们的组合。在一些实施方案中，表面被改性成具有烷基甲硅烷基涂层的这样的覆盖率，其中一个区域被改性以承载固定生物配体，而另一个表现出可促进蛋白质分析物变性的固定表面活性剂。在实践中，然后，此表面可以用于引发蛋白质分析物的变性，同时还引发生物配体诸如蛋白酶作用于其上，该蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶。
[0182]
生物配体
[0183]
如本文所述的烷基甲硅烷基涂层可以用生物配体例如亲和配体或酶改性，从而产生具有显著效用的离线和在线lc样品制备装置。含烷基甲硅烷基涂层和固定生物配体的装置的生物配体(即亲和配体或酶)表面覆盖率范围为从约1nmol/m2至约1000nmol/m2，更具体地约2nmol/m2至约500nmol/m2。具有烷基甲硅烷基涂层和固定生物配体的装置可用于实施用于后续基于lc的测定的样品制备，包括分析物的富集或将其转化为可以更容易或更具选择性地检测的成分。使用本技术协助的分析还可以包括毛细管电泳和质谱。
[0184]
亲和配体
[0185]
如上所述的烷基甲硅烷基涂层可以用生物配体例如亲和配体改性，从而产生具有显著效用的离线和在线lc样品制备装置。
[0186]
使用本技术进一步改性如上所述的沉积的烷基甲硅烷基表面以承载能够促进分析物样品制备步骤以促进lc-ms测定的固定亲和配体。亲和色谱用于无数测定以捕获分析物、提高选择性并改善检测限。亲和捕获是分析由细胞培养产生的生物制剂和分析患者生物流体中循环的生物治疗剂的起点。在各种选择中，该涂层由共价连接的抗体、单域抗体、适体、亲和体、链霉亲和素、蛋白a、蛋白g、蛋白l或它们的组合构成。这些配体可以直接连接到硅烷化/烷基甲硅烷基涂层，这可能经由还原胺化、nhs活化的亲电取代、碳二亚胺脱水或迈克尔加成反应进行。在一些实施方案中，间隔分子(或接头)用于将亲和配体连接到涂层。例如，含有游离硫醇的蛋白质配体可通过硅烷化和与马来酰亚胺peg硅烷的次级反应连接到涂层，其中peg重复的范围可为从3至300(见下文)。另选地，可以将氨基硅烷改性的涂层与nhs活化的马来酰亚胺peg组合以实现相同的结果。同样，氨基硅烷改性的表面可以与双醛试剂(诸如戊二醛或peg二醛)和还原胺化组合，以提供将胺表面桥联到生物配体的胺官能团的固定。此外，涂层可以用丙烯酰氧基硅烷改性，然后可以用于生物配体的迈克尔加成型固定。
[0187]
间隔分子(或接头)的示例如下所示，其中n为从3至300。
[0188][0189][0190]
下面提供了示例性生物配体的选择。一个示例展示了可用于选择性捕获人免疫球蛋白fc结构域的骆驼科单域抗体的单个氨基酸残基序列。对于该配体，存在c端半胱氨酸残基以便促进定向缀合。对于第二个示例，提供了核酸适体的序列。这种适体还显示出对人免疫球蛋白fc结构域的亲和力。它显示为氨基端的5'构建体，通过该构建体可以经由还原胺化实施定点缀合。在又一个示例中，提供了可用于蛋白质消化的猪胰蛋白酶的序列。图5a-图5c总结了可以使用上述成分制备的涂层和固定生物配体的几个示例。
[0191]
用于捕获人免疫球蛋白fc结构域的骆驼科vhh单域抗体的序列(氨基酸)：
[0192]
qvqlqesggglvqpggslrscaasggtsirigsinalawyrqalgnqrelvaavteggstnyadfvkgrftisrdqaqnmmylqmnslkpedtavyycnadkvlysrggyysvandlwgqgtqvtvssqapkvdakfdc(seq id no:1)
[0193]
用于捕获人免疫球蛋白fc结构域的核酸适体的序列(核酸)：
[0194]
5'氨基-ggrargrgfurgcfuccgaaargrgaafcfucc(seq id no:2)其中g代表2'脱氧
鸟苷，ra代表2'羟基腺嘌呤，rg代表2'羟基鸟苷，fu代表2'-氟-2'-脱氧尿苷，c代表2'脱氧胞苷，a代表2'脱氧腺嘌呤，并且5'氨基代表由伯氨基基团组成的5'修饰。
[0195]
在一些实施方案中，亲和配体具有seq id no:1所描绘的序列。亲和配体可以与seq id no:1所描绘的序列至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
[0196]
在一些实施方案中，亲和配体具有seq idno:2所描绘的序列。亲和配体可以与seq id no:2所描绘的序列至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
[0197]
亲和配体方法
[0198]
本技术还包括使用固定在烷基甲硅烷基涂覆的基底(例如样品制备装置)上的亲和配体分析生物流体的方法。该方法包括提供样品制备装置，例如，具有固定在样品制备装置的烷基甲硅烷基涂覆表面上的亲和配体的任何一种样品制备装置。该方法还包括将包含分析物的生物流体抽吸到样品制备装置的表面上以形成亲和复合物，使得该分析物被吸附。所吸附的分析物用中性等渗缓冲液洗涤。所吸附的分析物从样品制备装置的表面洗脱。然后使用液相色谱、质谱、elisa、毛细管电泳或它们的组合分析所洗脱的样品。
[0199]
该方法中使用的亲和配体可以是本文所述的任何亲和配体。亲和配体可能够捕获人免疫球蛋白fc结构域。例如，骆驼科单域抗体的单个酸残基序列可用于选择性捕获人免疫球蛋白fc结构域。核酸适体还显示出对人免疫球蛋白fc结构域的亲和力。
[0200]
在另一个实施方案中，使用固定在烷基甲硅烷基涂覆的基底(例如玻璃料)上的亲和配体提供分离生物流体的方法。该方法包括提供位于色谱柱的入口处的玻璃料。玻璃料具有固定在玻璃料的烷基甲硅烷基涂覆表面上的亲和配体，例如，具有本文所述的固定亲和配体的任何涂层。包含分析物的生物流体被装载到玻璃料的表面上。分析物被捕获以形成亲和复合物，使得分析物被吸附在玻璃料的表面上，而生物流体的其余部分通过色谱柱。所吸附的分析物从玻璃料的表面洗脱，使得分析物通过色谱柱。然后由检测器检测分析物。
[0201]
色谱柱可以是尺寸排阻色谱(sec)柱。检测器可为质谱仪。生物流体可以是基于人源化mab的治疗剂。亲和配体可以是抗人fc适体、抗人fc免疫球蛋白抗体、抗人fc单域抗体配体或它们的组合。
[0202]
在分离生物样品时，烷基甲硅烷基涂层和亲和配体可各自为整体分离提供期望的效果。例如，当分离包含生物流体的样品时，可以使用亲和配体以与样品中的分析物形成亲和复合物，而烷基甲硅烷基涂层可以确保样品中的其他分析物不会被吸附到样品制备装置的表面(例如，由于与金属基底的相互作用)，并且因此不会和与亲和配体形成亲和复合物的分析物一起洗脱。这样，惰性烷基甲硅烷基涂层连同亲和配体有益地减少了分析物在基底上的吸附，而亲和配体选择性地吸附特定分析物，该特定分析物随后可被洗脱和检测。
[0203]
酶
[0204]
如上所述的烷基甲硅烷基涂层可以用有助于样品分析的生物配体例如酶改性。这些酶可以选自蛋白酶、糖苷酶、连接酶、转移酶、氧化还原酶、异构酶、水解酶或它们的组合。对肽作图有重要意义的蛋白酶、用于抗体片段化的ides和idez、可用于o-和n-聚糖剖析的
糖苷酶、羧肽酶和核酸酶都可以用于提供本发明的不同实施方案。在一些情况下，可以固定酶的混合物以实现单锅反应和超过一种的化学转化。另选地，本技术可以包含用于促进阿片类葡萄糖苷酸的分析的β-葡萄糖醛酸酶。这些可以制成离线样品制备装置的一部分，或创建样品制备机器或专用的一体化lc-ms分析仪。在一些方面，这些固定酶涂覆的表面可以被制备并与lc系统一起使用以制造可用于蛋白质治疗剂的肽作图的蛋白质消化设备或分析仪。
[0205]
酶可以是例如胰蛋白酶、lys-c、arg-c、lys-n、glu-c、asp-n、胃蛋白酶、ides、idez、igde、gingipain k、pngase f或它们的组合。
[0206]
下面提供了β-葡萄糖醛酸酶的序列的示例，其可用于水解阿片类代谢物。图5a-图5c总结了可以使用上述成分制备的涂层和固定生物配体的几个示例。
[0207]
作为用于蛋白质消化的蛋白酶的猪胰蛋白酶的序列(氨基酸)：
[0208]
ivggytcaansipyqvslnsgshfcggslinsqwvvsaahcyksriqvrlgehnidvleg
[0209]
neqfinaakiithpnfngntldndimliklsspatlnsrvatvslprscaaagteclisg
[0210]
wgntkssgssypsllqclkapvlsdssckssypgqitgnmicvgfleggkdscqgdsggp
[0211]
vvcngqlqgivswgygcaqknkpgvytkvcnyvnwiqqtiaan(seq id no:3)
[0212]
用于水解阿片类代谢物的β-葡萄糖醛酸酶的序列(氨基酸)：
[0213]
glqggmlypqespsreckeldglwsfradfsdnrrrgfeeqwyrrplwesgptvdmpvpssfndisqdwrlrhfvgwvwyerevilperwtqdlrtrvvlrigsahsyaivwvngvdtleheggylpfeadisnlvqvgplpsrlritiainntltpttlppgtiqyltdtskypkgyfvqntyfdffnyaglqrsvllyttpttyidditvttsveqdsglvnyqisvkgsnlfklevrlldaenkvvangtgtqgqlkvpgvslwwpylmherpaylyslevqltaqtslgpvsdfytlpvgirtvavtksqflingkpfyfhgvnkhedadirgkgfdwpllvkdfnllrwlganafrtshypyaeevmqmcdrygivvidecpgvglalpqffnnvslhhhmqvmeevvrrdknhpavvmwsvanepashlesagyylkmviahtksldpsrpvtfvsnsnyaadkgapyvdviclnsyyswyhdyghleliqlqlatqfenwykkyqkpiiqseygaetiagfhqdpplmfteeyqkslleqyhlgldqkrrkyvvgeliwnfadfmteqsptrvlgnkkgiftrqrqpksaafllrerywkianetryphsvaksqclenslft(seq id no:4)
[0214]
在一些实施方案中，酶具有seq id no:3所描绘的序列。酶可以与seq id no:3所描绘的序列至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
[0215]
在一些实施方案中，酶具有seq idno:4所描绘的序列。酶可以与seq id no:4所描绘的序列至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
[0216]
酶方法
[0217]
本技术还包括使用样品制备装置定量阿片类葡萄糖苷酸的方法，该样品制备装置具有表面，该表面具有含固定β-葡萄糖醛酸酶的烷基甲硅烷基涂层(如本文所述)。将包含阿片类葡萄糖苷酸的样品抽吸到样品制备装置的表面上，使得阿片类葡萄糖苷酸被水解。从样品制备装置的表面回收经水解的阿片类葡萄糖苷酸。将所回收的经水解的阿片类葡萄糖苷酸注射到液相色谱柱上。
[0218]
本技术还包括使用样品制备装置制备包含用于肽作图的蛋白质的样品的方法，该样品制备装置具有表面，该表面具有含固定蛋白酶的烷基甲硅烷基涂层(如本文所述)。蛋
白酶可以是胰蛋白酶、lys-c、arg-c、lys-n、glu-c、asp-n、胃蛋白酶或它们的组合。可以将包含蛋白质的样品抽吸到样品制备装置的表面上，使得蛋白质被消化成肽片段。从样品制备装置回收肽片段，并将肽片段注射到液相色谱柱上。在一些实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶、lys-c、asp-n或它们的组合。
[0219]
在一些实施方案中，烷基甲硅烷基涂层是双(三氯甲硅烷基)乙烷，并且蛋白酶是胰蛋白酶，其中胰蛋白酶通过马来酰亚胺peg硅烷接头(例如，图5a-图5c的#5)共价键合到双(三氯甲硅烷基)乙烷。马来酰亚胺peg硅烷接头可以是：
[0220][0221]
其中n介于3与300之间。
[0222]
烷基甲硅烷基涂层可以是用三乙氧基甲硅烷基丁醛改性的双(三氯甲硅烷基)乙烷，并且蛋白酶可以是胰蛋白酶，其中胰蛋白酶通过还原胺化(例如，图5a-图5c的#6)共价键合到三乙氧基甲硅烷基丁醛改性的双(三氯甲硅烷基)乙烷。
[0223]
在一些实施方案中，烷基甲硅烷基涂层是用3-氨基丙基三甲氧基硅烷改性的双(三氯甲硅烷基)乙烷，并且蛋白酶是胰蛋白酶，其中胰蛋白酶通过用peg二醛还原胺化(例如，图5a-图5c的#7)共价键合到3-氨基丙基三甲氧基硅烷改性的双(三氯甲硅烷基)乙烷。peg二醛可以是：
[0224][0225]
其中n介于3与300之间。
[0226]
在一些实施方案中，烷基甲硅烷基涂层是用三乙氧基甲硅烷基丁醛和丙烯酸酯peg胺改性的双(三氯甲硅烷基)乙烷，并且蛋白酶是胰蛋白酶，其中胰蛋白酶通过还原胺化和迈克尔加成(例如，图5a-图5c的#8)共价键合到改性的双(三氯甲硅烷基)乙烷。丙烯酸酯peg胺可以是：
[0227][0228]
其中n介于3与300之间。
[0229]
在一些实施方案中，烷基甲硅烷基涂层是用丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷改性的双(三氯甲硅烷基)乙烷，并且蛋白酶是胰蛋白酶，其中胰蛋白酶通过迈克尔加成(例如，图5a-图5c的#9)共价键合到丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷改性的双(三氯甲硅烷基)乙烷。
[0230]
本技术还包括使用样品制备装置分析包含单克隆抗体(mab)的样品的方法，该样品制备装置具有表面，该表面具有含固定酶的烷基甲硅烷基涂层(如本文所述)，该固定酶共价键合到该烷基甲硅烷基涂层。酶是ides、idez、igde、gingipain k或它们的组合。将包含mab的样品抽吸到样品制备装置的表面上，使得mab被片段化成亚基。从样品制备装置回收mab的亚基，并将mab的亚基注射到液相色谱柱上。
[0231]
本技术还包括使用样品制备装置分析包含糖蛋白的样品的方法，该样品制备装置具有表面，该表面具有含固定pngase f酶的烷基甲硅烷基涂层(如本文所述)。将包含糖蛋白的样品抽吸到样品制备装置的表面上，使得糖蛋白的聚糖被裂解。从样品制备装置回收去糖基化的糖蛋白，并将去糖基化的糖蛋白注射到液相色谱柱上。
[0232]
在分离生物样品时，烷基甲硅烷基涂层和酶可各自为整体分离提供期望的效果。例如，当分离包含生物流体的样品时，可使用酶来例如水解或消化样品中的分析物，而烷基甲硅烷基涂层可确保所产生的消化产物不会被吸附到样品制备装置的表面(例如，由于与金属基底的相互作用)，并且因此以高产率回收。这样，惰性烷基甲硅烷基涂层连同酶有益地减少了分析物在基底上的吸附，而酶选择性地与特定分析物相互作用，该特定分析物随后可被回收和检测。
[0233]
实施例
[0234]
实施例1
–
使用具有亲和表面的微洗脱板的样品制备
[0235]
在本技术的一个实施例中，96孔微洗脱板、锥形底小瓶或移液管吸头涂覆有双(三氯甲硅烷基)乙烷，并进行次级改性以承载用于捕获人免疫球蛋白fc结构域的亲和配体，该亲和配体包括但不限于核酸适体(seq id no:2)、免疫球蛋白或单域vhh骆驼科抗体(seq id no:1)。将生物流体抽吸到表面上并使其平衡，使得亲和复合物形成。所吸附的分析物用中性等渗缓冲液洗涤，并且然后用洗脱液洗脱。随后将所得分析物注射到液相色谱柱上并通过该液相色谱柱分离。
[0236]
实施例2
–
使用固定亲和表面的在线ms
[0237]
在又一实施例中，本技术可用作lc流动路径的部件。0.2μm孔隙率不锈钢玻璃料可以用双(三氯甲硅烷基)乙烷涂层和与抗人fc适体(seq id no:2)的固定反应改性。该玻璃料可用作尺寸排阻(sec)柱的入口，该柱包括但不限于beh sec1.7μm柱(可从waters technologies corporation,milford,ma商购获得)。在该设备上，可以装载含有基于人源化mab的治疗剂的生物流体样品。入口玻璃料及其涂层因此将选择性地捕获治疗剂，同时样品基质将通过柱设备。随后，所吸附的基于mab的治疗剂将通过注射洗脱液解吸。sec流动相组合物将被选择成由挥发性组分构成。所解吸的治疗剂将以最小的峰体积洗脱并通过sec柱，以能够通过质谱检测。来自注射的非挥发性洗脱液将被分流至废液。任选地，这种固定的亲和配体设备可以在没有次级色谱技术的情况下使用。在一些实施方案中，它可以用抗人fc免疫球蛋白抗体或抗人fc单域抗体配体构建。在这些中后面的情况下，所捕获的分析物的洗脱可以通过低ph的挥发性洗脱液来促进。
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