单鞘微流控芯片的制作方法

单鞘微流控芯片
1.本技术的背景
技术领域
2.本技术涉及一种微流控芯片设计，尤其涉及一种微流控芯片，其使用从单鞘和几何聚焦的的层流来分离粒子或细胞材料。


背景技术：

3.微流控能够使用小体积来制备和处理样品，例如多种粒子或细胞材料。在分离样本时，例如将精子从无活力或不能动的精子中分离有活力和能动的精子，或按性别进行分离，该过程通常耗时且有严格的体积限制。当前的分离技术，例如，无法产生期望的产出或不能及时处理大量的细胞材料。此外，现有的微流控设备不能有效地对精子细胞进行聚焦或定向。
4.因此，这就需要一种微流控设备和利用所述设备的分离方法，该设备是连续的、具有高通量、节省时间且对分离的各种组分造成的损害可忽略或最小。此外，这种设备和方法可以进一步适用于生物和医学领域，不仅在精子分选，而且在血液和其他细胞材料的分离，包括病毒、细胞器官、球状组织、胶态悬浮液和其他生物材料。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种微流控设备和方法，其可以对粒子或细胞材料进行聚焦和定向，如独立权利要求所述。从属权利要求中给出了本发明的实施例。如果本发明的实施例不是互相排斥，则可以彼此自由组合。
6.在一些方面，本发明的特征在于一种微流控装置，其用于精子细胞性别鉴定和特征富集。所述微流控装置可以包括至少一个流动聚焦区，在该流动聚焦区通过区域的几何结构对组分进行聚焦或重新定向。从所述流动聚焦区的上游端到下游端，所述流动聚焦区的至少一部分高度降低，并且至少一部分宽度变窄，从而几何上地缩窄所述流动聚焦区。
7.根据一些实施例，本发明的特征在于一种微流控芯片，其包括微通道，该微通道具有宽度变窄的缩窄部分；所述微通道下游的流动聚焦区，该流动聚焦区包括正倾斜底面，该底面降低所述流动聚焦区的高度；以及侧壁，该侧壁逐渐变窄以减小所述流动聚焦区的宽度，从而几何地缩窄所述流动聚焦区。
8.在另一个实施例中，所述微流控芯片可以包括：样品微通道；两个鞘流体微通道，其与样品微通道交叉以形成交叉区域；下游的微通道，其流体地连接至所述交叉区域；以及下游的流动聚焦区，其流体地连接至所述下游的微通道。所述下游的微通道可以具有宽度变窄的缩窄部分。所述流动聚焦区可以包括：正倾斜底面，其降低所述流动聚焦区的高度；侧壁，其逐渐变窄以减小所述流动聚焦区的宽度，从而几何地缩窄所述流动聚焦区。所述样品微通道配置为使样品流体混合物流动，所述两个鞘流体微通道各自配置为使鞘流体流入所述交叉区域以引起层流，并且从至少两侧至少水平地对从所述样品微通道流动的所述样
品液混合物进行压缩，使得所述样品流体混合物被鞘流包围并且被压缩成细流。所述交叉区域和所述下游的流动聚焦区配置为聚焦所述样品流体混合物中的材料。对所述样品流体混合物的压缩使样品流体混合物中的材料聚集，从而使所述材料聚焦在所述下游的微通道的中央或附近。
9.在一些实施例中，所述微通道的所述缩窄部分包括逐渐变窄的侧壁。在别的实施例中，所述正倾斜底面和所述逐渐变窄的侧壁同时出现在从所述流动聚焦区的上游端到下游端。所述正倾斜底面和所述逐渐变窄的侧壁从平面开始，所述平面垂直横穿所述流动聚焦区。在其他一些实施例中，所述样品微通道包括所述样品微通道的入口下游的缩窄区。所述缩窄区可以包括正倾斜底面，其降低所述缩窄区的高度；以及侧壁，其逐渐变窄以减小所述缩窄区的宽度。所述正倾斜底面和所述逐渐变窄的侧壁可以几何地缩窄所述缩窄区。
10.在一个实施例中，所述样品微通道的出口可以位于或接近所述两个鞘流体微通道的每一个的出口的中间高度。所述下游的微通道的入口可以位于或接近所述两个鞘流体微通道的每一个的所述出口的中间高度。在别的实施例中，所述样品微通道的所述出口位于或接近所述交叉区域的中间高度。所述下游的微通道的所述入口位于或接近所述交叉区域的中间高度。在又一实施例中，所述样品微通道的所述出口和所述下游的微通道的所述入口可以对齐或不对齐。
11.在一些实施例中，所述微流控芯片还可以包括所述流动聚焦区下游的询问区。所述微流控芯片还可以包括所述询问区下游的扩展区。所述扩展区可以包括负倾斜底面，其增加所述缩窄区的高度；以及具有侧壁的扩展部分，所述侧壁变宽以增加扩展区的宽度。在其他实施例中，所述微流控芯片还可以包括多个输出微通道，其位于所述扩展区下游且流体地耦合至所述扩展区。
12.根据其他实施例，本发明提供了一种利用所述微流控芯片的方法。在一些实施例中，本发明的主要特征在于一种在流体流动中聚焦粒子的方法，该方法包括提供一种微流控芯片；将包含所述粒子的流体混合物流入样品微通道并流入所述交叉区域；将鞘流体通过所述两个鞘流体微通道流动并流入所述交叉区域，使得所述鞘流体引起层流并从至少两侧至少水平地压缩所述流体混合物，其中所述流体混合物被鞘流体包围并压缩成细流，所述粒子被缩窄至被所述鞘流体包围的所述细流；将所述流体混合物和鞘流体流入所述下游的微通道，其中所述下游的微通道的所述缩窄部分水平地压缩所述流体混合物的细流；将流体混合物和鞘流体流入所述聚焦区，其中所述正倾斜底面和所述逐渐变窄的侧壁进一步缩窄所述流体混合物流且对流体中的粒子进行重新导向，从而使所述粒子聚焦。
13.在其他实施例中，本发明的特征在于一种产生具有性别偏斜的精子细胞流体的方法。所述方法可以包括提供一种微流控芯片；将包括精子细胞的精液流体流入所述样品微通道并流入所述交叉区域；将鞘流体通过所述两个鞘流体微通道流动并进入所述交叉区域，使得所述鞘流体引起层流并从至少两侧至少水平地压缩所述精液流体，其中所述精液流体被鞘流体包围并被压缩成细流；将所述精液流体和鞘流体流入所述下游的微通道，在其中所述缩窄部分水平地压缩精液流体的所述细流；将所述精液流体和鞘流体流入所述聚焦区，在其中所述正倾斜的底面和所述逐渐变窄的侧壁进一步缩窄所述精液流体，以将所述精子细胞聚焦在所述精液流的中央或附近；确定所述精液流中所述精子细胞的染色体类型，在其中每个精子细胞是携带y染色体的精子细胞或携带x染色体的精子细胞；以及从携
带x染色体的精子细胞中将携带y染色体的精子细胞分选出来，从而产生包括主要是携带y-染色体的精子细胞的性别偏斜的精子细胞流体。
14.本发明的独有和创造性的技术特征之一是流动聚焦区的通道几何结构的物理限制。在不希望将本发明限制于任何理论或机制的情况下，认为本发明的技术特征有利于从微流控装置中消除第二鞘流体结构，使得不需要使用第二鞘流体聚焦/定向精子细胞，因此，与具有两个聚焦区使用鞘流体进行流压缩的现有装置相比，减少了使用鞘流体的体积。这为降低设备和用品的运营成本，进一步简化系统复杂性提供了额外的好处。目前已知的现有参考文献或技术均不具有本发明独有的发明技术特征。
15.与具有两个聚焦区使用鞘流体的现有装置相比，本发明的发明技术特征产生了同等纯度、更好性能和更好的功能的y偏斜精子细胞，其结果令人惊讶。例如，本发明的所述微流控装置出乎意料地改善了精子细胞的方向，这被认为提高了合格性，即更多数量的细胞被探测、分选和消融。此外，本发明的所述装置能够提高携带y染色体的精子细胞和携带x染色体的精子细胞之间的分辨率，从而有效区分携带y染色体的精子细胞。
16.此外，现有参考文献对于本发明给出了反向教导。例如，与本发明相反，美国专利第7311476号在其公开的具有至少两个区域的微流体芯片中教导了使用鞘流体流体来聚焦流体流，其中每个区域引入鞘流体以将鞘流体聚焦在周围粒子周围，并且第二个(下游)区域需要引入额外的鞘流体以实现必要的聚焦。
17.在一些实施例中，所述微流控芯片包括多个层，在其中布置有多个通道，包括：样品输入通道，将待分离的组分的样品流体混合物输入其中；以及两个聚焦区，包括聚焦样品流体中粒子的第一聚焦区和聚焦样品流体中粒子的第二聚焦区，在其中一个聚焦区包括通过一个或多个鞘流体通道引入鞘流体，另一个聚焦区包括几何压缩，而不引入额外的鞘流体。几何压缩是指由于样品通道在垂直轴和水平轴上(即从上方和下方以及从左右两侧，相对于样品通道的行进方向)的尺寸变窄而产生的物理缩窄。在一些方面，所述第一聚焦区可以结合几何和鞘流体引入。但是，所述第二聚焦区不利用额外的鞘流体进行流聚焦或粒子定向。在其他方面，所述微流控芯片能够装载至微流控芯片盒，该微流控芯片盒安装在微流控芯片底座。
18.在一些实施例中，所述样品输入通道和所述一个或多个鞘流体通道设置在所述微流体芯片的一个或多个平面。例如，鞘流体通道可以设置在与设置有所述样品输入通道的平面不同的平面。在其他实施例中，所述样品输入通道和所述鞘流体通道设置在一个或多个结构层，或设置在所述微流体芯片的结构层之间。例如，所述一个或多个鞘流体通道可以设置在与设置有所述样品输入通道的结构层不同的结构层。
19.在一个实施例中，所述样品输入通道可以在进入与所述鞘流体通道的交叉区域的入口点逐渐变窄。在另一个实施例中，所述鞘流体通道可以在进入与所述样品输入通道的交叉区域的入口点逐渐变窄。在一些实施例中，所述微流控装置可以包括一个或多个输出通道，其流体地耦合至所述样品通道。所述一个或多个输出通道可以各自具有设置在其末端的输出。在其他实施例中，所述微流控芯片还可以包括一个或多个凹口，其设置在所述微流控芯片的底部边缘以分离所述输出通道的输出。
20.在一些实施例中，所述微流控芯片系统包括询问装置，其在位于流动聚焦区下游的询问腔，询问并识别所述样品输入通道中样品流体混合物的组分。在一个实施例中，所述
询问装置包括辐射源，其配置为发射光束，以照亮和激发所述样品流体混合物中的所述组分。所述光束产生的发射光被物镜接收。在另一实施例中，所述询问设备可以包括探测器，例如光电倍增管(pmt)、雪崩光电二极管(apd)或硅光电倍增管(sipm)。
21.在一些实施例中，所述微流控芯片包括分选机制，其通过选择性作用于所述样品流体混合物中的单个组分，对所述样品流体混合物中的所述组分进行分选。在一个实施例中，所述分选机制可包括激光杀死/消融。可根据本发明使用的分选机制的其他示例包括但不限于粒子偏转/静电操纵、液滴分选/偏转、机械分选、流体切换、压电驱动、光学操纵(光学捕获、全息转向和光子/辐射压力)，表面声波(saw)偏转、电泳/电破坏、微空化(激光诱导、电诱导)。在一些实施例中，所述分离组分被移入其中一个输出通道，未选择的组分通过另一个输出通道流出。
22.在其他的实施例中，所述微流控芯片可以操作地耦合至计算机，该计算机控制将一种样品流体混合物或鞘流体泵送至所述微流控芯片。在另一实施例中，所述计算机能够在由ccd相机获取的视野中显示组分，所述ccd相机布置在微流控芯片中的询问窗口上方。
23.在一些实施例中，被分离的所述细胞可以包括以下至少一种：从无活力或不能动的精子中分离出的有活力和能动的精子；按性别和其他性别分选变异分离出的精子；从群体中的细胞中分离出的干细胞；从未标记细胞中分离出的一个或多个标记细胞，包括精子细胞，通过理想/不理想的性状进行区分；根据特定特征在核dna中分离出的基因；基于表面标记分离出的细胞；基于膜完整性或活性分离出的细胞；基于潜在或预测的生殖状态分离出的细胞；基于冷冻存活能力分离出的细胞；与污染物或碎片分离出的细胞；从受损细胞中分离出健康细胞；从血浆混合物中的白细胞和血小板中分离出的红细胞；或从任何其他细胞组分中分离成相应级分的任何细胞。
24.本文所述的任何特征或特征组合都包括在本发明的范围内，前提是任何此类组合中包含的特征不会像上下文、本规范和本领域普通技术人员的知识中所显示的那样相互不一致。本发明的其他优点和方面在以下详细描述和权利要求中显而易见。
附图说明
25.以下，结合附图的详细描述进行参照，本发明的特征和优点将变得显而易见。
26.图1a是本发明实施例的微流控装置的顶层的仰视图。
27.图1b是所述微流控装置的底层的俯视图。
28.图1c是堆叠在所述微流控装置的底层的顶层的侧视图。
29.图2a是图1a所示出的顶层的交叉区域的特写视图和横截面侧视图。
30.图2b是图1b所示出的底层的交叉区域的特写视图和横截面侧视图。
31.图2c是图1c所示出的堆叠层的交叉区域的特写视图和横截面侧视图。
32.图3a是图1a所示出的顶层的流动聚焦区的特写视图和横截面侧视图。
33.图3b是图1b所示出的底层的流动聚焦区的特写视图和横截面侧视图。
34.图3c是图1c所示出的堆叠层的流动聚焦区的特写视图和横截面侧视图。
35.图4是图1b所示出的流动聚焦区的特写视图。
36.图5是下游的微通道和流动聚焦区的顶视图和侧视图的非限制性实施例。该实施例示出了下游的微通道的缩窄部分以及流动聚焦区的底面和侧壁的同时几何压缩。
37.图6示出了图1b所示出的底层的输出通道区的特写视图和横截面侧视图。
38.图7是精液流体样品性别倾斜方法的流程图的非限制性实例。
具体实施方式
39.在转向详细示出说明性实施例的附图之前，应当理解，本公开不限于说明书中所阐述或附图中所示出的细节或方法。还应理解，术语仅用于描述的目的，而不应被视为限制性的。在所有附图中，已经努力使用相同或相似的附图标记来表示相同或相似的部分。
40.下面是与本文中所指的特定要素相对应的要素列表：
41.100微流控芯片
42.110样品微通道
43.111样品微通道的入口
44.112缩窄区
45.113样品微通道的出口
46.114缩窄区的底表面
47.115缩窄区的侧壁
48.120下游的微通道
49.122缩窄部分
50.124下游的微通道的入口
51.125缩窄部分的侧壁
52.130流动聚焦区
53.132流动聚焦区的底表面
54.135流动聚焦区的侧壁
55.137流动聚焦区的上游端
56.138流动聚焦区的下游端
57.140鞘流体微通道
58.143鞘流体微通道的出口
59.145交叉区域
60.150询问区
61.160扩展区
62.162扩展区的底表面
63.165扩展区的侧壁
64.170输出微通道
65.一个方面，本公开涉及一种微流控芯片设计和方法，其可以将粒子或细胞材料，例如精子和其他粒子或细胞，分离成各种组分和级分。例如，本发明的各种实施例提供了分离混合物中的组分，例如从无活力或不能动的精子中分离有活力和能动的精子；按性别和其他性别分选变异分离精子；从群体中的细胞中分离干细胞；以区分理想/不理想的性状，从未标记细胞中分离一个或多个标记细胞；根据特定特征分离核dna中的基因；基于表面标记分离细胞；基于膜完整性(活性)、潜在或预测的生殖状态(生育能力)、冷冻存活能力等分离细胞；从污染物或碎片中分离细胞；从受损细胞(即癌细胞)中分离健康细胞(如骨髓提取)；
来自血浆混合物中白细胞和血小板的红细胞；从任何其他细胞组分中将任何细胞分离成相应的级分。
66.另一方面，本发明的各种实施例提供了一种系统和方法，尤其适用于分选精子细胞以产生性精液产品，在该性精液产品中有活力的、前向运动的精子细胞主要是携带y染色体的精子细胞。在一些实施例中，本发明的所述系统和方法能够产生的按性别分选或性别偏斜的精液产品，其包括至少55％的携带y染色体的精子细胞。在别的一些实施例中，所述系统和方法能够产生的性精液产品，其可以包括大约55％至大约90％的携带y染色体的精子细胞。还有一些实施例中，所述系统和方法能够产生的性精液产品，其可以包括至少大约90％或至少大约95％或至少大约99％的携带y染色体的精子细胞。
67.虽然下文侧重描述从无活力或不能动的精子中分离有活力和能动的精子，或按性别和其他性别分选变体分离精子，或以区分理想/不理想特征，从未标记细胞中分离一个或多个标记细胞等，但本发明可以延伸到其他类型的微粒、生物或细胞物质，能够在流体中通过荧光技术进行询问，或者能够在不同流体流之间进行操纵至不同输出。
68.所述微流控芯片的各种实施例利用一个或多个具有基本层流的流动通道和用于聚焦和/或定向流体中一个或多个组分的流动聚焦区，允许对所述一个或多个组分进行询问以进行识别，并将其分离成退入一个或多个输出的流。此外，可以使用各种分选技术，例如，粒子偏转/静电操纵；液滴分选/偏转；机械分拣；流体切换；压电驱动；光学操纵(光学捕获、全息转向和光子/辐射压力)；激光杀伤/消融；声表面波(saw)偏转；电泳/电中断；微空化(激光诱导、电诱导)；或通过磁性(即使用磁珠)，使混合物中的各种组分在芯片上经过一个或多个分选过程。因此，本发明的各种实施例由此提供连续的组分的聚焦和分离，而不会对现有技术方法造成潜在的损坏和污染，尤其是在精子分离。本发明的连续工艺在分离流体组分方面还可以节省大量时间。
69.微流控芯片组件
70.参照图1a-6，本发明的特征在于一种微流控芯片(100)。所述微流控芯片(100)的非限制性实施例包括：样品微通道(110)；两个鞘流体微通道(140)、其与所述样品微通道(110)交叉形成交叉区域(145)；下游的微通道(120)，其流体地连接至所述交叉区域(145)，所述下游的微通道(120)具有宽度变窄的缩窄部分(122)；以及下游的流动聚焦区(130)，其流体地连接至所述下游的微通道(120)。所述流动聚焦区(130)可以包括正倾斜底面(132)，其降低所述流动聚焦区的高度；侧壁(135)，其逐渐变窄以减少所述流动聚焦区的宽度，从而几何地缩窄所述流动聚焦区(130)。
71.在不希望将本发明限制于特定理论或机制的情况下，所述样品微通道(110)配置为使样品流体混合物流动，所述两个鞘流体微通道(140)各自配置为使鞘流体流入所述交叉区域(145)。鞘流体的流动引起层流和从至少两侧至少水平地对从所述样品微通道(110)流动的所述样品流体混合物进行的压缩，使得所述样品流体混合物被鞘流体流体包围并且被压缩成细流。在进一步的迭代中，可以合并另外的鞘流体以聚焦和/或调整所述微通道内样品流的位置。这样鞘流体可以从一个或多个方向(例如顶部、底部和/或侧面)引入，并可同时或连续引入。
72.在一些实施例中，所述微通道的所述缩窄部分(122)包括逐渐变窄的侧壁(125)。例如，侧壁(125)可以逐渐变窄，使得所述微通道的宽度从150um减小到125um。
73.在一些实施例中，所述正倾斜底面(132)和所述逐渐变窄的侧壁(135)同时出现在从所述流动聚焦区的上游端(137)到下游端(138)。由此，所述正倾斜底面(132)和逐渐变窄的侧壁(135)具有相同的起点。例如，所述正倾斜底面(132)和所述逐渐变窄的侧壁(135)从平面开始，所述平面垂直横穿所述流动聚焦区(130)。
74.在其他一些实施例中，所述样品微通道(110)包括所述样品微通道的入口(111)下游的缩窄区(112)。所述缩窄区(112)可以包括正倾斜底面(114)，其降低所述缩窄区的高度，以及侧壁(115)，其逐渐变窄以减小所述缩窄区的宽度。所述正倾斜底面(114)和所述逐渐变窄的侧壁(115)可以几何地缩窄所述缩窄区(112)。
75.在一些实施例中，所述样品微通道的出口(113)可以位于或接近所述两个鞘流体微通道的每一个的出口(143)的中间高度。所述下游的微通道的出口(124)可以位于或接近所述两个鞘流体微通道的每一个的所述出口(143)的中间高度。所述样品微通道的所述出口(113)和所述下游的微通道的所述入口(124)对齐。在其他的一些实施例中，所述样品微通道的所述出口(113)可以位于或接近所述交叉区域的中间高度，所述下游的微通道的所述入口(124)可以位于或接近所述交叉区域的中间高度。
76.在不希望将本发明限制于特定理论或机制的情况下，所述交叉区域(145)和所述下游的流动聚焦区(130)配置为聚焦所述样品流体混合物中的材料。例如，对所述样品流体混合物的压缩将所述材料集聚在所述样品流体混合物内，使得所述材料聚焦在所述下游的微通道的中央或附近。
77.在一些实施例中，所述微流控芯片(100)还可以包括多个输出微通道(170)，所述多个输出微通道(170)位于扩展区(160)下游且流体地耦合至所述扩展区(160)。所述输出微通道(170)配置为输出流体，该流体可以具有诸如粒子或细胞材料的组分。所述输出通道可以各自在其端部布置输出。在其他一些实施例中，所述微流控芯片还可以包括布置在所述微流控芯片底部边缘的一个或多个凹口，以分离输出并为外部管道等提供附件。所述芯片的非限制性实施例可以包括三个输出通道，其中包括两个侧输出通道和布置在所述侧通道之间的中央输出通道。
78.在一些实施例中，所述微流控芯片的所述微通道和各个区可以为标尺寸的，以实现满足本发明目标的所需流速。在一个实施例中，所述微通道可以具有基本相同的尺寸，然而，本领域的技术人员应该明白，只要达到所需的流速，微流控芯片中任何或所有通道的尺寸可以进行不同变化(即，在50到500微米之间)。
79.在一些别的实施例中，所述微流控芯片还可以包括所述流动聚焦区(130)下游的询问区(150)。在一些别的实施例中，所述微流控芯片还可以包括所述询问区(150)下游的扩展区(160)。所述扩展区(160)可以包括负倾斜底面(162)，其增加所述缩窄区的高度，以及具有侧壁(165)的扩展部分，所述侧壁(165)变宽以增加扩展区的宽度。
80.在一个实施例中，询问装置包括具有开口或窗口的腔室，所述开口或窗口切入微流控芯片中。所述开口或窗口可以安装盖子，用来封闭询问腔室。所述盖子可以由具有所需透射要求的任何材料制成，例如塑料、玻璃，甚至可以是透镜。在一个实施例中，所述窗口和盖子允许查看流经询问腔室的流体混合物组分，并由适当的辐射源进行作用，该辐射源配置为发射具有任何波长的高强度光束，其匹配组分的激发。
81.尽管可以使用激光器，但可以理解地是也可以使用其他合适的辐射源，例如发光
二极管(led)、弧光灯等，以发射激发组分的光束。在另一个实施例中，所述光束可以通过光纤传送到组分，所述光纤在开口嵌入微流控芯片。
82.在一些实施例中，需要来自预选波长的适当激光器的高强度激光束，例如355nm连续波(cw)(或准cw)激光器，以激发液体混合物中的组分(即精子细胞)。所述激光器通过窗口发射激光束，以照亮流经芯片询问区的组分。由于所述激光束可以沿所述微通道宽度方向改变强度，其最高强度通常位于所述微通道的中央(例如，通道宽度的中间部分)，并由此降低，所述流动聚焦区必须将所述精子细胞聚焦在流体流的中央或附近，在该中央或附近，照明激光光斑中心或附近出现最佳照明。在不受特定观念约束的情况，这可以提高询问和识别过程的准确性。
83.在一些实施例中，高强度光束与组分相互作用，使得由光束诱导的发射光被物镜接收。所述物镜可布置在相对于所述微流控芯片的任何适当位置。在一个实施例中，所述物镜接收到的发射光通过光学传感器(如光电倍增管(pmt)或光电二极管等)转换为电子信号。所述电子信号可以通过模数转换器(adc)被数字化，并发送到基于数字信号处理器(dsp)控制器。基于dsp控制器监控电子信号，然后可能触发分选机制。
84.在其他一些实施例中，所述询问装置可以包括探测器，例如光电倍增管(pmt)、雪崩光电二极管(apd)或硅光电倍增管(sipm)。例如，所述询问装置的光学传感器可以是apd，其是通过雪崩过程具有实质性内部信号放大的光电二极管。
85.在一些实施例中，当组分在经过询问后离开询问区时，可以使用压电致动器组件对流体混合物中的所需组分进行分选。通过传感器原始信号确定发送至压电致动器的触发信号，从而在探测到所选组分时激活特定压电致动器组件。在一些实施例中，柔性膜片由合适的材料制成，例如不锈钢、黄铜、钛、镍合金、聚合物或具有所需弹性响应的其他合适材料中的一种，与致动器一起使用，将微通道中的目标组分推入输出通道(170)，从而从流体混合物中分离目标组分。所述致动器可以是压电、磁性、静电、液压或气动型致动器。
86.在可替代的实施例中，压电致动器组件或合适的泵送系统可以用于将样品流体泵送至微通道(110)中朝向交叉区域(145)。所述样品压电致动器组件可以布置在样品入口(111)。通过将样品流体混合物泵送至主微通道，可以对其中的组分间距进行控制测量，以便在组分进入微通道(110)时，可以在组分之间建立更受控的关系。
87.根据本发明可使用的分选或分离机制的其他实施例包括但不限于液滴分选、机械分离、流体切换、声聚焦、全息捕获/转向，以及光子压力/转向。在优选实施例中，用于精子细胞性别分选的分选机制包括所选携带x染色体的精子细胞的激光杀死/消融。
88.在激光消融中，当询问过程中探测到携带x染色体的精子细胞时，激光被激活。激光发射出一束高强度光束，射向位于流体中央的携带x染色体的精子细胞。高强度光束配置为对细胞造成dna和/或膜损伤，从而导致不育或杀死携带x染色体的精子细胞。因此，最终产物主要由具有y染色体的活性精子细胞组成。在优选实施例中，所述流动聚焦区横截面积的减小几何地压缩携带精子的流体。流体的几何压缩将精子细胞集聚在流体中，从而使所述精子细胞集焦在微通道的中央或附近。由于激光束的强度沿微通道的宽度变化，其最高强度通常位于微通道的中央并由此降低，因此所述流动聚焦区必须将所述精子细胞聚焦在流体中央或其附近，在该中央或附近激光束的强度最高，对所选精子细胞造成最大伤害。
89.芯片操作
90.在一个实施例中，如以上所述，要分离的组分包括，例如从无活力或不能动的精子中分离有活力和能动的精子；按性别和其他性别分选变异分离精子；从群体中的细胞中分离干细胞；从未标记细胞中分离一个或多个标记细胞，区分理想/不理想的性状，；根据特定特征分离核dna中的基因；基于表面标记分离细胞；基于膜完整性(活性)、潜在或预测的生殖状态(生育能力)、冷冻存活能力等分离细胞；从污染物或碎片中分离细胞；从受损细胞(即癌细胞)中分离健康细胞(如骨髓提取)；来自血浆混合物中白细胞和血小板的红细胞；从任何其他细胞组分中将任何细胞分离成相应的级分；受损细胞、污染物或碎片或任何其他需要分离的生物材料。所述组分可以是经交联剂分子处理或涂覆的细胞或珠子，或嵌入荧光或发光标记分子的细胞或珠子。所述组分可以具有各种物理或化学属性，例如大小、形状、材料、纹理等。
91.在一个实施例中，可以同时测量组分的异质总体，检查每个组分的不同数量或相似数量的方案(例如，多路测量)，或者可以基于标签(例如，荧光)、图像(由于尺寸、形状、不同吸收、散射、荧光、发光特性、荧光或发光发射曲线、荧光或发光衰减寿命)和/或粒子位置等检查和区分所述组分。
92.在一个实施例中，可以使用聚焦方法，以便将用于询问的组分定位在询问腔室中。本发明的第一缩窄步骤通过样品输入(111)输入含有组分的流体样品，例如精子细胞等，并通过鞘或缓冲微通道(140)输入鞘流体或缓冲流体来完成。在一些实施例中，使用染料(例如，hoechst染料)对所述组分进行预染色，以允许荧光并用于探测成像。首先，样品流体混合物中的组分流过微通道(110)，并具有随机方向和位置。在交叉区域(145)处，从鞘或缓冲微通道(140)流出的鞘流体或缓冲流体在流动的至少两侧(如果不是所有侧)至少水平地对在微通道(110)中流动的样品混合物进行压缩。其结果，所述组分被聚焦并压缩成细流，并且所述组分(例如精子细胞)向通道宽度的中央移动。该步骤的优点在于使用较少的鞘流体，因为鞘流体只被引入芯片中的一个位置。
93.在另一个实施例中，本发明包括第二缩窄步骤，其中通过所述下游的微通道的所述缩窄区(122)对包含组分的样品混合物进行至少水平地进一步压缩。该步骤利用物理或几何压缩，而不是鞘流体的另一个交叉点。因此，通过本发明的第二缩窄步骤，所述样品流体聚焦在通道的中央，并且组分沿着通道的中央流动。在优选实施例中，所述组分以近似单个文件的形式流动。不希望受到特定理论或机制的约束，所述物理/几何压缩具有减少鞘流体体积的优势，因为消除了鞘流体的第二个交叉点。
94.在优选实施例中，本发明包括聚焦步骤，其中使用物理或几何压缩，而不是鞘流体的另一交叉点，在流动聚焦区(130)中进一步压缩含有组分的样品混合物。所述样品混合物还通过向上倾斜的底面更靠近聚焦区(130)的顶面。因此，通过本发明的所述聚焦步骤，所述样品流体聚焦在通道的中央，并且组分以近似单个文件的形式沿着通道的中央流动。不希望受到特定理论或机制的约束，所述物理/几何压缩具有减少鞘流体体积的优势，因为消除了鞘流体的第二个交叉点。
95.因此，本文所述的所述微流控装置可用于上述聚焦方法。在一个实施例中，本发明提供了一种在流体中聚焦粒子的方法。该方法可以包括提供本文所述的任何一种微流控装置，将包含粒子的流体混合物流入样品微通道(110)并流入交叉区域(145)，将鞘流体通过所述两个鞘流体微通道(140)流动并进入所述交叉区域(145)，使得所述鞘流体引起层流并
从至少两侧至少水平地压缩流体混合物，其中所述流体混合物被鞘流体包围并压缩成细流，所述粒子被缩窄至被所述鞘流体包围的所述细流；将所述流体混合物和鞘流体流入所述下游的微通道(120)，其中所述下游的微通道(120)的所述缩窄部分(122)水平地压缩所述流体混合物的细流；将流体混合物和鞘流体流入所述聚焦区(130)，其中所述聚焦区的正倾斜底面(132)和逐渐变窄的侧壁(135)进一步缩窄所述流体混合物流且对流体中的粒子进行重新导向，从而使所述粒子聚焦。
96.通过在缩窄和聚焦区引入鞘流体和/或物理结构对流体混合物进行压缩，将流体混合物的粒子缩窄成由鞘流体限定的相对较小、较窄的流体。例如，通过两个鞘流体通道(130)将鞘流体引入样品微通道(110)可以将流体混合物流从两侧压缩成相对较小、较窄的流，同时保持层流。聚焦区中流体混合物和鞘流体的流动导致流体混合物流的进一步缩窄和流中粒子的重新定向，这是由物理结构引起的，例如聚焦区的上升底面(132)和侧壁(135)的缩窄部分，从而聚焦粒子。
97.在一些实施例中，样品的组分是精子细胞，并且由于其煎饼状或扁平的泪滴状头部，所述精子细胞在经历聚焦步骤时可以在预定方向上重新定向-即，其平面垂直于光束方向。因此，所述精子细胞在通过两步聚焦过程时，会对其身体方向产生偏好。具体来说，所述精子细胞倾向于更稳定，其扁平的身体垂直于压缩方向。通过控制鞘流体或缓冲流体，从随机定向开始的所述精子细胞可以实现统一定向。所述精子细胞不仅在通道的中央形成一个单一的文件，而且它们还实现了一个统一的方向。因此，引入到样本输入中的组分(可以是前面描述的其他类型的细胞或其他材料)经历聚焦步骤，这允许组分以单个文件形式移动，并以更统一的方向(取决于组分的类型)移动，这允许更容易地询问组分。
98.结合前述实施例，本发明还提供了一种产生具有性别偏斜的精子细胞的流体的方法。参考图6，该方法可包括提供本文所述的任何一种微流控装置，将包括精子细胞的精液流体流入所述样品微通道(110))并流入交叉区域(145)；将鞘流体通过所述两个鞘流体微通道(140)流动并进入所述交叉区域(145)，使得所述鞘流体引起层流并从至少两侧至少水平地压缩所述精液流体，其中所述精液流体被鞘流体包围并被压缩成细流；将所述精液流体和鞘流体流入所述下游的微通道(120)，其中所述下游的微通道(120)的所述缩窄部分(122)水平地压缩所述精液流体的细流；将所述精液流体和鞘流体流入聚焦区(130)，其中所述正倾斜的底面(132)和逐渐变窄的侧壁(135)进一步缩窄所述精液流体以将所述精子细胞聚焦在所述精液流的中央或附近；确定所述精液流中所述精子细胞的染色体类型，其中每个精子细胞是携带y染色体的精子细胞或携带x染色体的精子细胞；以及从携带x染色体的精子细胞中将携带y染色体的精子细胞分选出来，，从而产生包括主要是携带y-染色体的精子细胞的性别偏斜的精子细胞的流体。
99.在一些实施例中，可以使用本文所述的任何一种询问装置来确定精子细胞的染色体类型。在一个实施例中，微流控芯片(100)还可以包括位于流动聚焦区(130)下游的询问区(150)。询问装置可以耦合至询问区(150)，并用于确定精子细胞的染色体类型，并基于染色体类型对所述精子细胞进行分选。询问装置可以包括照射和激发精子细胞的辐射源，并且精子细胞的反应指示精子细胞中的染色体类型。精子细胞的反应可通过光学传感器探测。在其他实施例中，询问设备还可以包括激光源。携带y染色体的精子细胞通过激光消融从携带x染色体的精子细胞中分选出来，激光消融将细胞暴露于高强度激光源中，从而损坏
或杀死确定携带x染色体的细胞。在一个实施例中，性别倾斜的精子细胞由至少55％的携带y染色体的精子细胞组成。在另一个实施例中，性别倾斜的精子细胞由大约55％-99％的y染色体携带精子细胞组成。在另一个实施例中，性别倾斜的精子细胞由至少99％的携带y染色体的精子细胞组成。
100.在一个实施例中，使用辐射源在询问腔中探测组分。辐射源发射光束(可通过光纤)，光束聚焦在通道宽度的中央。在一个实施例中，诸如精子细胞的组分由聚焦区定向，使得组分的平坦表面朝向光束。此外，所有组分最好在通过辐射源时聚焦，以单个文件的形式对齐。当组分通过辐射源并受到光束的作用时，所述组分发出荧光，指示所需组分。例如，对于精子细胞，x染色体细胞的荧光强度与y染色体细胞不同；或者，携带一种特性的细胞可能会发出不同强度或波长的荧光，而携带一组不同特性的细胞则会发出不同的荧光。此外，可以查看所述组分的形状、大小或任何其他区别指示器。
101.在一个实施例中，通过其他方法对样品含有组分(例如，生物材料)的进行询问。总的来说，用于询问的方法可以包括直接视觉成像，例如使用相机，并且可以利用直接亮光成像或荧光成像；或者，可以使用更复杂的技术，例如光谱学、透射光谱学、光谱成像或散射，例如动态光散射或扩散波光谱学。在某些情况下，光学询问区可以与添加剂一起使用，例如结合或影响样品混合物组分的化学品或在存在某些材料或疾病的情况下被功能化以结合和/或荧光的珠子。这些技术可用于测量细胞浓度、探测疾病或探测表征组分的其他参数。
102.然而，在另一个实施例中，如果不使用荧光，则也可以使用偏振光后向散射方法。使用光谱法，对组分进行询问，并对有阳性结果和荧光的组分(即对标签起反应的组分)的光谱进行识别以进行分离。在一些实施例中，可以基于组分与添加剂或鞘流体或缓冲液的反应或结合，或通过使用组分的天然荧光，或与组分相关的物质的荧光，作为识别标签或背景标签，或满足选定的大小、尺寸或表面特征等，对组分进行识别以进行分离。在一个实施例中，在完成组分析后，可通过计算机和/或操作员选择要丢弃的组分和要收集的组分。
103.继续光束诱导荧光的实施例，发射的光束由物镜收集，随后由光学传感器转换为电子信号。然后，电子信号通过模数转换器(adc)被数字化，并发送到电子控制器进行信号处理。电子控制器可以是具有足够处理能力的任何电子处理器，例如dsp、微控制器单元(mcu)、现场可编程门阵列(fpga)甚至中央处理器(cpu)。在一个实施例中，基于dsp的控制器监控电子信号，然后可以在探测到所需组分时触发分选机制。在另一个实施例中，基于fpga的控制器监控电子信号，然后与dsp控制器通信，或者在探测到所需组分时独立地触发分选机制。在一些其他实施例中，光学传感器可以是光电倍增管(pmt)、雪崩光电二极管(apd)或硅光电倍增管(sipm)。在优选实施例中，光学传感器可以是探测精子细胞对询问的响应的apd。
104.在分选机制的一个实施例中，使用压电致动器将询问腔中选定或期望的组分分离到期望的输出通道。在示例性实施例中，当目标或选定组分到达喷射通道和微通道的横截面点时，电子信号激活驱动器以触发致动器。这会导致致动器接触隔膜并推动隔膜，压缩喷射腔，并将缓冲液或鞘流体的强射流挤压到微通道，从而将所选或所需的组分推到所需的输出通道。
105.在一些实施例中，从各自的输出通道(170)收集分离组分，用于存储、进一步分离或处理，例如低温保存。在一些实施例中，可以对输出的组分进行电子表征，以探测组分的
浓度、ph测量、细胞计数、电解质浓度等。
106.芯片盒和底座
107.在一些实施例中，微流控芯片可以装载至微流控芯片盒，该微流控芯片盒安装在芯片底座。所述芯片底座安装至平移台，以允许底座的精细定位。例如，微流控芯片底座配置为将微流控芯片保持在预定位置，以便询问光束拦截流体组分。在一个实施例中，微流控芯片底座由合适的材料制成，例如铝合金或其他合适的金属/聚合物材料。底座的主体可以是任何合适的形状，但其配置取决于芯片的布局。在进一步的实施例中，底座的主体配置为接收用于将流体/样品传送到微流控芯片的外部管道并与之接合。可提供任何所需形状的垫圈或o形圈，以保持微流控芯片和微流控芯片底座之间的紧密密封。垫片可以是任意配置的单张或多个组件，也可以是所需的材料(即橡胶、硅胶等)。在一个实施例中，垫片与微流控芯片的一层接合或粘结(使用环氧树脂)。垫片配置为有助于密封，以及稳定或平衡微流控芯片底座中的微流控芯片。芯片盒和底座的细节以及将芯片连接到芯片盒和底座的机制没有任何细节描述，因为本领域的普通技术人员都知道，这些设备是周知的，只要满足本发明的目标，可以是任何配置以容纳微流体芯片。
108.在一些实施例中，泵送机制包括具有加压气体的系统，该加压气体提供压力，用于将样品流体混合物从储气罐(即，样品管)泵送至芯片的样品输入端。在其他实施例中，其中具有本文中鞘流体或缓冲液的可折叠容器设置在加压容器中，并且加压气体推动流体，使得流体通过管道输送到芯片的鞘流体或缓冲液输入端。
109.在一个实施例中，压力调节器调节储气罐内的气体压力，另一个压力调节器调节容器内的气体压力。质量流量调节器控制通过管道分别泵入鞘流体或缓冲器输入的流体。因此，管道用于将流体初始加载到芯片中，并可在整个芯片中用于将样本流体加载到样本输入中。
110.根据本发明，在执行存储在计算机可读介质上的指令时，例如通过计算设备或处理器，可以通过存储在计算机可读介质(如存储器、数据库等)上的指令来实现任何操作、步骤、控制选项等，这些指令可使计算设备或处理器执行本文所述的任何操作、步骤、控制选项等。在一些实施例中，本规范中描述的操作可以实现为数据处理设备或处理电路对存储在一个或多个计算机可读存储设备上或从其他源接收的数据执行的操作。计算机程序(也称为程序、软件、软件应用程序、脚本或代码)可以用任何形式的编程语言编写，包括编译或解释语言、声明性或过程性语言，并且可以以任何形式部署，包括作为独立程序或模块、组件、子例程、对象，或其他适合在计算环境中使用的单元。程序可以存储在保存其他程序或数据的文件的一部分、一个专用于该程序的文件或多个协调文件中。程序可以部署在一台计算机上执行，也可以部署在通过通信网络互连的多台计算机上执行。例如，适于执行计算机程序的处理电路包括通用和专用微处理器，以及任何类型的数字计算机的任何一个或多个处理器。适合于执行计算机程序的处理电路包括例如通用和专用微处理器，以及任何种类的数字计算机的任何一个或多个处理器。
111.在一个实施例中，计算机系统的用户界面包括计算机屏幕，该屏幕在微流控芯片上ccd摄像头获取的视野中显示组分。在另一个实施例中，计算机控制任何外部设备，例如泵(如果使用)，以将任何样品流体、鞘流体或缓冲流体泵送至微流控芯片，并且还控制任何加热设备，其设置输入微流控芯片的流体温度。
112.应当注意，各种元件的方位可以根据其他说明性实施例而不同，并且这些变化旨在被本公开所涵盖。如各种说明性实施例中所示的微流体芯片的机制和布置仅是说明性的。尽管在本公开中仅详细描述了几个实施例，但许多修改是可能的(例如，各种元件的大小、尺寸、结构、形状和比例、参数值、安装布置、材料的使用、颜色、方位等)，而不会实质上背离本文所述主题的新颖教导和优点。显示为一体形成的一些元件可以由多个部分或元件构成，元件的位置可以颠倒或以其他方式改变，并且离散元件或位置的性质或数量可以改变或改变。任何过程、逻辑算法或方法步骤的顺序或顺序可以根据替代实施例改变或重新排序。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在各种说明性实施例的设计、操作条件和布置中进行其他替换、修改、改变和省略。
113.如本文所用，术语“大约”指参考数字的正负10％。
114.尽管已经显示和描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是可以对其进行修改而不超出所附权利要求的范围。因此，本发明的范围仅受以下权利要求限制。下面的权利要求中引用的附图标记是示例性的并且仅是为了便于审查本专利申请，并且不旨在以任何方式将权利要求的范围限制为在附图中具有相应附图标记的特定特征。在一些实施例中，本专利申请中呈现的附图是按比例绘制的，包括角度、尺寸比等。在一些实施例中，附图仅是代表性的并且权利要求不受附图的尺寸限制。在一些实施例中，使用短语“包括”对本文描述的发明的描述包括可以描述为“基本上由
……
组成”或“由
……
组成”的实施例，并且因此是要求保护本发明的一个或多个实施例的书面描述要求符合使用短语“基本上由
……
组成”或“由
……
组成”的发明。