一种重组角蛋白液体制剂及其纯度检测方法与流程

1.本发明涉及角蛋白技术领域，尤其是涉及一种重组角蛋白液体制剂及其纯度检测方法。


背景技术：

2.角蛋白是一类具有缔结和保护功能的纤维状动物蛋白质，是外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于动物的毛发、羽毛和蹄中；由于角蛋白具有良好的生物活性高和组织相容性，能够起到消炎、止血、神经修复、减少创面渗出和促进创伤组织再生，修复、愈合的作用，可在体内生物降解，因此可以作为良好的生物医学材料。但是现在的角蛋白都是通过复杂的化学工艺从动物中提取角蛋白后进行使用，一方面导致提取过程中容易造成角蛋白的结构进行破坏，并且角蛋白会残留一定的分离试剂，导致角蛋白的安全性和有效性都无法保证。
3.因此，现在市场上为了避免提取工艺对角蛋白造成的各种影响，专利号为201810123711.6提供了一种重组角蛋白，可以获得稳定安全、结构完整和有效的角蛋白；但是重组角蛋白直接保存导致出现结构不稳定，出现降解或者聚集的情况，活性会受到严重影响，并且导致重组角蛋白的纯度受到影响，严重影响重组角蛋白有效性和应用范围。并且现有技术不能对制剂中重组角蛋白的纯度进行检测。


技术实现要素：

4.针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种重组角蛋白液体制剂及其纯度检测方法，解决了现在重组角蛋白直接保存结构不稳定，出现降解或者聚集的情况，重组角蛋白的活性和纯度被严重影响以及无法检测制剂中重组角蛋白的纯度等技术问题。
5.为了实现前述发明目的，本发明提供了一种重组角蛋白液体制剂，按照质量百分比计，包括：重组角蛋白0.1％～0.2％，稳定剂8％～15％，防腐抑菌剂0.01％～0.05％，其余成分为去离子水。
6.优选地，所述稳定剂包括甘油，nacl和蔗糖的一种或者任意几种。本发明中采用甘油和蔗糖作为稳定剂，能够增强重组角蛋白的稳定性，一方面能够阻止重组角蛋白在长时间的储存过程中二级结构的变化；另外一方面还能防止重组角蛋白在反复冻融过程中失活，有效避免重组角蛋白在长时间保存过程中出现降解或者聚集的现象，保证重组角蛋白的活性和纯度。
7.优选地，所述稳定剂包括甘油5％～8％，nacl1％～2％，蔗糖2％～5％。
8.优选地，所述稳定剂包括甘油6％～7％，nacl1.5％，蔗糖3％～4％。
9.优选地，所述防腐抑菌剂为叠氮钠。本发明中采用叠氮钠能够对保存的重组角蛋白进行防腐和抑菌，确保重组角蛋白长时间保存后仍然具有良好的品质。
10.优选地，所述叠氮钠的含量为0.02％～0.04％。
11.优选地，所述重组角蛋白的分子量为47kda。
12.一种重组角蛋白液体制剂的纯度检测方法，包括高效液相色谱法，色谱柱采用适合分离分子量为5～1250kda蛋白质的凝胶为填充剂，流动相采用0.08％tfa
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乙腈(含0.4mltfa和500ml乙腈混合液体)和0.1％tfa
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水(含0.5mltfa和500ml去离子水)；上样量不低于10μl，在波长280nm处检测，以重组角蛋白色谱峰计算的理论塔板数应不低于16000，最后按面积归一化法计算。
13.优选地，所述色谱柱为sec300凝胶色谱柱。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
15.1)本发明中将重组的角蛋白制备成液体制剂进行保存，使得能够保证重组角蛋白结构保持稳定，避免出现角蛋白降解或者聚集的情况，使得重组角蛋白能够长时间保持较好的活性，从而有效的保证了重组角蛋白在保存过程中纯度变化不大，使得保持较好活性和较高纯度的重组角蛋白能够应用到医疗用品中，并且在医疗用品中能够发挥良好的效用；本发明为重组角蛋白提供了一种方便和有效的保存方式。
16.2)本发明中还提供了重组角蛋白液体制剂的纯度检测方法，能够有效对重组角蛋白液体制剂进行纯度检测，从而对重组角蛋白在不同的保存环境下和随着保存时间推移的纯度变化情况，使得能够找到重组角蛋白最合适的保存方法；并且在液体制剂使用之前通过该方法进行抽样检查，确保重组角蛋白的有效性。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
18.图1为本发明中一种重组角蛋白液体制剂中对比实施例1的色谱图。
19.图2为本发明中一种重组角蛋白液体制剂中实施例1的色谱图。
20.图3为本发明中一种重组角蛋白液体制剂中实施例2的色谱图。
21.图4为本发明中一种重组角蛋白液体制剂中实施例3的色谱图。
22.图5为本发明中一种重组角蛋白液体制剂中实施例4的色谱图。
具体实施方式
23.下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
24.需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
25.在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本发明的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
26.本发明提供了一种重组角蛋白液体制剂，按照质量百分比计，包括：重组角蛋白0.1％～0.2％，稳定剂8％～15％，防腐抑菌剂0.01％～0.05％，其余成分为无菌水。
27.具体实施时，所述稳定剂包括甘油，nacl和蔗糖的一种或者任意几种。
28.具体实施时，所述稳定剂包括甘油5％～8％，nacl1％～2％，蔗糖2％～5％。
29.具体实施时，所述稳定剂包括甘油6％～7％，nacl1.5％，蔗糖3％～4％。
30.具体实施时，所述防腐抑菌剂为叠氮钠。
31.具体实施时，所述叠氮钠的含量为0.02％～0.04％。
32.具体实施时，所述重组角蛋白的分子量为47kda。
33.一种重组角蛋白液体制剂的纯度检测方法，包括高效液相色谱法，色谱柱采用适合分离分子量为5～1250kda蛋白质的凝胶为填充剂，流动相采用0.08％tfa
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乙腈(含0.4mltfa和500ml乙腈混合液体)和0.1％tfa
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水(含0.5mltfa和500ml去离子水)；上样量不低于10μl，在波长280nm处检测，以重组角蛋白色谱峰计算的理论塔板数应不低于16000，最后按面积归一化法计算。
34.优选地，所述色谱柱为sec300凝胶色谱柱。
35.对比实施例1
36.将分子量为47kda的重组角蛋白原液用去离子水配制成初始纯度为95％的液体制剂；在室温25
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30℃保存12个月，按照本发明公开的一种重组角蛋白液体制剂的纯度检测方法，采用高效液相色谱法，按照一定速度将液体制剂注入到sec300凝胶色谱柱，流动相采用0.08％tfa
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乙腈(含0.4mltfa和500ml乙腈混合液体)和0.1％tfa
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水(含0.5mltfa和500ml去离子水)；上样量为10μl，在波长280nm处检测得到图1，以重组角蛋白色谱峰计算的理论塔板数应为16000，最后按面积归一化法计算得到重组角蛋白的纯度为75％。
37.实施例1
38.本发明提供了一种重组角蛋白液体制剂，按照质量百分比计，包括：取分子量为47kda的重组角蛋白原液0.1％，用无菌水制备，初始纯度为95.5％；再加入稳定剂包括甘油5％，nacl1％，蔗糖5％，防腐抑菌剂为叠氮钠0.01％。在室温25
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30℃保存12个月，再按照本发明公开的一种重组角蛋白液体制剂的纯度检测方法，采用高效液相色谱法，按照一定速度将液体制剂注入到sec300凝胶色谱柱，流动相采用0.08％tfa
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乙腈(含0.4mltfa和500ml乙腈混合液体)和0.1％tfa
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水(含0.5mltfa和500ml去离子水)；上样量为10μl，在波长280nm处检测得到图2，以重组角蛋白色谱峰计算的理论塔板数应为16000，最后按面积归一化法计算得到重组角蛋白的纯度为94.69％。
39.实施例2
40.本发明提供了一种重组角蛋白液体制剂，按照质量百分比计，包括：取分子量为47kda的重组角蛋白0.15％，用无菌水制备，初始纯度为95.3％；再加入稳定剂包括甘油6％，nacl1.5％，蔗糖4％，防腐抑菌剂为叠氮钠0.02％。再按照本发明公开的一种重组角蛋白液体制剂的纯度检测方法，采用高效液相色谱法，按照一定速度将液体制剂注入到sec300凝胶色谱柱，流动相采用0.08％tfa
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乙腈(含0.4mltfa和500ml乙腈混合液体)和0.1％tfa
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水(含0.5mltfa和500ml去离子水)；上样量为10μl，在波长280nm处检测得到图3，以重组角蛋白色谱峰计算的理论塔板数应为16000，最后按面积归一化法计算得到重组角蛋白的纯度为94.82％。
41.实施例3
42.本发明提供了一种重组角蛋白液体制剂，按照质量百分比计，包括：取分子量为
47kda的重组角蛋白0.15％，用无菌水制备，初始纯度为95.2％；再加入稳定剂包括甘油7％，nacl1.5％，蔗糖3％，防腐抑菌剂为叠氮钠0.03％。再按照本发明公开的一种重组角蛋白液体制剂的纯度检测方法，采用高效液相色谱法，按照一定速度将液体制剂注入到sec300凝胶色谱柱，流动相采用0.08％tfa
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乙腈(含0.4mltfa和500ml乙腈混合液体)和0.1％tfa
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水(含0.5mltfa和500ml去离子水)；上样量为10μl，在波长280nm处检测得到图4，以重组角蛋白色谱峰计算的理论塔板数应为16000，最后按面积归一化法计算得到重组角蛋白的纯度为94.92％。
43.实施例4
44.本发明提供了一种重组角蛋白液体制剂，按照质量百分比计，包括：取分子量为47kda的重组角蛋白0.2％，用无菌水制备，初始纯度为95.8％；再加入稳定剂包括甘油8％，nacl2％，蔗糖2％，防腐抑菌剂为叠氮钠0.05％。再按照本发明公开的一种重组角蛋白液体制剂的纯度检测方法，采用高效液相色谱法，按照一定速度将液体制剂注入到sec300凝胶色谱柱，流动相采用0.08％tfa
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乙腈(含0.4mltfa和500ml乙腈混合液体)和0.1％tfa
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水(含0.5mltfa和500ml去离子水)；上样量为10μl，在波长280nm处检测得到图5，以重组角蛋白色谱峰计算的理论塔板数应为16000，最后按面积归一化法计算得到重组角蛋白的纯度为94.89％。
45.将各实施例中重组角蛋白的初始浓度和液体制剂保存12个月后重组角蛋白的纯度如表1所示。
46.表1各实施例中液体制剂重组角蛋白的纯度表
[0047][0048][0049]
综合表1可以分析得出，与对比实施例相比，重组角蛋白在液体制剂中保存12个月后的纯度变化不到1％，其中实施例3中的液体制剂中重组角蛋白纯度的变化最小；本发明中提出的重组角蛋白液体制剂能够对重组角蛋白进行有效的保存；避免避免出现角蛋白降解或者聚集的情况，使得重组角蛋白能够长时间保持较好的活性，从而有效的保证了重组角蛋白在保存过程中纯度变化不大，使得保持较好活性和较高纯度的重组角蛋白能够应用到医疗用品中，并且在医疗用品中能够发挥良好的效用。
[0050]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。