一种鉴别结合突变型抗原的抗体的方法及试剂与流程

1.本发明属于免疫检测领域。更具体地，涉及一种鉴别结合突变型抗原的抗体的方法及试剂。


背景技术：

2.2020年12月14日，英国首次向who通报新冠病毒变异株，并命名为 新冠病毒b.1.1.7突变株。虽然初步评估显示新冠病毒b.1.1.7突变株不会增加 疾病严重性，但其会导致更高的发病率，产生更多住院及死亡病例。2020 年10月中旬首次在南非发现新冠病毒b1.351突变株，该变异株除了与新冠 病毒b.1.1.7突变株在s抗原上有相同的n501y突变外，不同之处在于还包 含了对病毒感染能力有潜在重要影响的s蛋白e484k和k417n两个关键位 点的突变。不同位点突变带来的差异对于指导疾病预防有着重要意义，因 此能快速鉴别不同突变型抗原的诊断产品在目前尤为重要。


技术实现要素：

3.本发明目的是提供一种鉴别结合突变型抗原的抗体的方法及试剂。利用本发明方法即能够快速、准确地鉴别结合突变型抗原的抗体，保证了检测时效性。
4.在一些实施方案中，本发明可以包括下述一项或多项：
5.1、一种方法，其中，利用检测抗体、第一抗原和第二抗原对样品进行免疫检测，所述方法用于鉴别结合突变型抗原的待检抗体；其中，检测抗体对第一抗原的结合力低于检测抗体对第二抗原的结合力；所述第一抗原与所述第二抗原之间存在至少一个位点不同。
6.2、根据项目1所述的方法，其中，检测抗体用可检测标记物进行直接或间接标记，第一抗原和第二抗原分别直接或间接结合至固相；或；
7.检测抗体直接或间接结合至固相，第一抗原和第二抗原分别用可检测标记物进行直接或间接标记。
8.3、根据项目1-2任一项所述方法，其中，所述位点包括sars-cov-2刺突蛋白第455位、第456位、第484位、第485位、第486位、第490位或第494 位氨基酸；
9.可选地，第一抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第484位突变为非谷氨酸的其它氨基酸，第二抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第484位为谷氨酸；
10.可选地，第一抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第484位突变为赖氨酸，第二抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第484位为谷氨酸；
11.可选地，第一抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第456位突变为非苯丙氨酸的其它氨基酸，第二抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第456位为苯丙氨酸；
12.可选地，第一抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第456位突变为丙氨酸，第二抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第456位为苯丙氨酸。
13.4、根据项目1-3所述的方法，其中，所述检测抗体与所述第一抗原和所述第二抗原的结合片段包括sars-cov-2刺突蛋白第455位、第456位、第484位、第485位、第486位、第490
位或第494位氨基酸。
14.5、根据项目1所述的方法，其中，所述抗原为病原体抗原；
15.可选地，所述病原体为病毒；
16.可选地，所述病毒为rna病毒；
17.可选地，所述rna病毒为冠状病毒；
18.可选地，所述冠状病毒为sarsr-cov；
19.可选地，所述sarsr-cov为sars-cov-2或其变体；
20.可选地，所述抗原包括sars-cov-2或其变体的rbd或其片段。
21.6、根据项目1所述的方法，其中，检测抗体对第一抗原的结合力为检测抗体对第二抗原的结合力的至多50％、至多40％、至多30％、至多20％、至多10％、至多5％；
22.可选地，所述结合力以ic50表征；
23.可选地，检测抗体对第一抗原的ic50大于检测抗体对第二抗原的ic50；
24.可选地，检测抗体对第一抗原的ic50为检测抗体对第二抗原的ic50的至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍。
25.7、根据项目1所述的方法，其中，所述免疫检测为免疫层析检测、elisa 检测、免疫比浊法或化学发光法检测。
26.8、一种鉴别结合突变型抗原的抗体的试剂，其中，包括项目1-7任一项所述的检测抗体、第一抗原和第二抗原。
27.9、一种鉴别结合突变型抗原的抗体的层析试剂，其中，包括项目1-7任一项所述的检测抗体、第一抗原和第二抗原、结合垫、第一检测线和第二检测线；其中，检测抗体用可检测标记物进行直接或间接标记，检测抗体设于结合垫上；第一检测线上设有第一抗原，所述第二检测线上设有第二抗原；或；第一检测线上设有第二抗原，所述第二检测线上设有第一抗原；其中，所述第一检测线较所述第二检测线靠近结合垫。
28.10、项目1-7任一项所述的方法、项目8所述的试剂或项目9所述的层析试剂在鉴别结合突变型抗原的抗体中的应用。
具体实施方式
29.本发明提供了一种方法，利用检测抗体、第一抗原和第二抗原对样品进行免疫检测，所述方法用于鉴别结合突变型抗原的待检抗体；其中，检测抗体对第一抗原的结合力低于检测抗体对第二抗原的结合力；所述第一抗原与所述第二抗原之间存在至少一个位点不同。
30.突变型抗原是指与参考抗原相比某一位点或多个位点发生突变。
31.本领域技术人员应该理解，本发明以待检抗体与检测抗体竞争结合所述抗原的免疫反应进行，通过检测结果鉴别待检样品中是否存在结合突变型抗原的抗体。
[0032]“所述第一抗原与所述第二抗原之间存在至少一个位点不同”是指所述第一抗原与所述第二抗原在至少一个位点上氨基酸不同。本领域技术人员应该理解，第一抗原、第二抗原可以长度不同。在一些实施方案中，其可以是例如第一抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第501位为酪氨酸，第二抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第501位为天冬酰胺。
[0033]
在一些实施方案中，检测抗体用可检测标记物进行直接或间接标记，第一抗原和
第二抗原分别直接或间接结合至固相；在一些实施方案中，检测抗体直接或间接结合至固相，第一抗原和第二抗原分别用可检测标记物进行直接或间接标记。
[0034]
在一些实施方案中，可检测标记物例如金属粒子，荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，电化学标记，放射性标记，核酸标记，或酶标记；在一些实施方案中，可检测标记物例如可以是罗丹明，荧光素，荧光微球，胶体金，吖啶酯，乳胶微球，彩色微球，三联钌，鲁米诺类，eu螯合物，荧光素酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记。
[0035]
在一些实施方案中，固相没有特别限制，其可以是例如磁性颗粒，胶乳粒子，微量滴定板，硝酸纤维素膜，玻璃纤维素膜，尼龙膜或微流控芯片。
[0036]
在一些实施方案中，“所述第一抗原与所述第二抗原之间存在至少一个位点不同”，所述位点包括sars-cov-2刺突蛋白第455位、第456位、第484位、第485位、第486位、第490位或第494位氨基酸。
[0037]
在一些实施方案中，第一抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第484位突变为非谷氨酸的其它氨基酸，第二抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第484位为谷氨酸。在一些实施方案中，第一抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第484位突变为赖氨酸，第二抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第484位为谷氨酸；在一些实施方案中，第一抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第484位突变为谷氨酰胺，第二抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第484位为谷氨酸；在一些实施方案中，第一抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第484位突变为脯氨酸，第二抗原包括 sars-cov-2的刺突蛋白第484位为谷氨酸。
[0038]
在一些实施方案中，第一抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第456位突变为非苯丙氨酸的其它氨基酸，第二抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第456位为苯丙氨酸；在一些实施方案中，第一抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第456位突变为丙氨酸，第二抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第456位为苯丙氨酸。
[0039]
在一些实施方案中，第一抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第485位突变为精氨酸，第二抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第485位为甘氨酸。在一些实施方案中，第一抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第494位突变为脯氨酸，第二抗原包括sars-cov-2的刺突蛋白第494位为丝氨酸。
[0040]
在一些实施方案中，“所述第一抗原与所述第二抗原之间存在至少一个位点不同”，所述位点还可以包括例如sars-cov刺突蛋白第442位、第472位、第479位、第480位或第487位氨基酸。
[0041]
在一些实施方案中，所述检测抗体与所述第一抗原和所述第二抗原的结合片段包括sars-cov-2刺突蛋白第455位、第456位、第484位、第485位、第 486位、第490位或第494位氨基酸；在一些实施方案中，所述检测抗体与所述第一抗原和所述第二抗原的结合片段包括sars-cov刺突蛋白第442位、第472 位、第479位、第480位或第487位氨基酸。在一些实施方案中，结合片段包括的氨基酸位点可以是连续的；在一些实施方案中，结合片段包括的位点可以是不连续的。
[0042]
在一些实施方案中，所述抗原为病原体抗原；在一些实施方式中，所述病原体为病毒；在一些实施方案中，所述病毒为rna病毒；在一些实施方案中，所述rna病毒为冠状病毒；在一些实施方案中，所述冠状病毒为sarsr-cov(严重急性呼吸综合征相关冠状病毒)；在一
些实施方案中，所述sarsr-cov为 sars-cov-2或其变体；在一些实施方案中，所述抗原包括sars-cov-2或其变体的rbd或其片段。在一些实施方案中，所述第一抗原和所述第二抗原均包括 sars-cov-2rbd或其片段。在一些实施方案中，其可以是例如是受体结合基序 (rbm)，例如是rbd全长，例如包括rbd的s1蛋白，例如包括rbd的刺突蛋白全长，例如包括核衣壳蛋白及刺突蛋白优势表位的融合蛋白。
[0043]
在一些实施方案中，检测抗体对第一抗原的结合力低于检测抗体对第二抗原的结合力；在一些实施方案中，检测抗体对第一抗原的结合力为例如检测抗体对第二抗原的结合力的至多50％、例如检测抗体对第二抗原的结合力的至多40％、例如检测抗体对第二抗原的结合力的至多30％、例如检测抗体对第二抗原的结合力的至多20％、例如检测抗体对第二抗原的结合力的至多10％、例如检测抗体对第二抗原的结合力的至多5％，但不限于此。在一些实施方案中，所述结合力以ic50表征。ic50是半抑制浓度，可以通过间接竞争elisa标准曲线等法得出；在本发明中的抗原抗体反应中，ic50数值越小，则抗体的特异性越强。在一些实施方案中，检测抗体对第一抗原的ic50大于检测抗体对第二抗原的ic50；在一些实施方案中，检测抗体对第一抗原的ic50为例如检测抗体对第二抗原的 ic50的至少2倍、例如检测抗体对第二抗原的ic50的至少5倍、例如检测抗体对第二抗原的ic50的至少10倍、例如检测抗体对第二抗原的ic50的至少20倍、例如检测抗体对第二抗原的ic50的至少30倍、例如检测抗体对第二抗原的ic50 的至少50倍，但不限于此。
[0044]
本发明所述免疫检测应做广义理解，其指通过抗原抗体特异性结合而进行的检测方法，包括例如免疫层析检测、例如elisa检测、例如免疫比浊法检测、例如化学发光法检测，但不限于此。
[0045]
本发明还提供了一种鉴别结合突变型抗原的抗体的试剂，包括检测抗体、第一抗原和第二抗原。本发明所述试剂应做广义理解，其主要指承载免疫检测相关试剂的工具。在一些实施方案中，还可以进一步包括一些配套试剂，其可以是例如工作液，但不限于此。
[0046]
在一些实施方案中，所述试剂为免疫层析试剂，包括以上任一实施方案所述的检测抗体、第一抗原和第二抗原、结合垫、第一检测线和第二检测线；其中，检测抗体用可检测标记物进行直接或间接标记，并设于结合垫上；第一检测线上设有第一抗原，所述第二检测线上设有第二抗原；或；第一检测线上设有第二抗原，所述第二检测线上设有第一抗原；其中，所述第一检测线较所述第二检测线靠近结合垫。
[0047]
在一些实施方案中，所述第一检测线为t1线，所述第二检测线为t2线。
[0048]
在一些实施方案中，检测抗体为例如rbd抗体，第一抗原例如包括 sars-cov-2变体(例如其刺突蛋白第484位为谷氨酸突变的其它氨基酸)的rbd 或其片段的蛋白(例如氨基酸序列如seq id no:5所示)，第二抗原例如包括sars-cov-2(例如其刺突蛋白第484位为谷氨酸)的rbd或其片段的蛋白(例如氨基酸序列如seq id no:1所示)，rbd抗体对第一抗原的ic50值为对第二抗原的至少2倍。在一些实施方案中，所述t1线上设有第一抗原、所述t2线上设有第二抗原。在一些实施方案中，当待检样品中无待检抗体时rbd抗体会与第一抗原和第二抗原均发生结合，则t1线显色、t2线显色，二者显色相当。在一些实施方案中，当待检样品中存在不结合某位点突变型抗原(例如刺突蛋白第484位为谷氨酸突变的其它氨基酸)的抗体时，该抗体基本不与rbd抗体竞争结合第一抗原，但会与rbd抗体竞争结合第二抗原；则t1线显色不受影响、 t2线显色减弱，t1线显色强于t2线显色。在一些实施方案中，当待检
样品中存在结合某位点突变型抗原(例如刺突蛋白第484位为谷氨酸突变的其它氨基酸)的抗体时，该抗体会与rbd抗体竞争结合第一抗原，但基本不与rbd抗体竞争结合第二抗原；则t1线显色减弱、t2线显色不受影响，t1线显色弱于t2 线显色。利用本发明两种抗原，设定双重检测线，可以快速简便地鉴定出突变型抗原，在一些实施方案中，可以更加优越地检测灵敏度。
[0049]
在一些实施方案中，检测抗体为例如rbd抗体，第一抗原例如包括 sars-cov-2变体(例如其刺突蛋白第456位为苯丙氨酸突变的其它氨基酸)的 rbd或其片段的蛋白(例如氨基酸序列如seq id no:6所示)，第二抗原例如包括sars-cov-2(例如其刺突蛋白第456位为苯丙氨酸)的rbd或其片段的蛋白(例如氨基酸序列如seq id no:1所示)，rbd抗体对第一抗原的ic50值为对第二抗原的至少2倍。在一些实施方案中，所述t1线上设有第一抗原、所述t2线上设有第二抗原。
[0050]
本发明中，“抗体”可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，可以采用本领域已知的方法制备本发明的检测抗体：例如采用人b细胞体外单克隆培养与高通量抗体筛选技术(huang j et al.nature protocols 2013)从康复者血清中分离人源抗体；例如免疫小鼠得到鼠源抗体，为了增加免疫原性，可以将载体蛋白(包括但不限于bsa、卵清蛋白、klh等)与免疫反应性物质(例如表位肽)偶联。载体蛋白可以包括蛋白质或多肽，其可以起免疫原载体的作用。这些类型的多肽包括白蛋白、血清蛋白、球蛋白、晶状体蛋白、脂蛋白和/或其片段。
[0051]
本发明还提供了以上任一实施方案所述方法、试剂及层析试剂在鉴别结合突变型抗原的抗体中的应用。
[0052]
利用本发明方法同样也能鉴别其它病毒的突变型抗原。
[0053]
本发明中，待测样品包括健康或病理状态的血液(包括血清、血浆或全血) 样本、淋巴样本、唾液样本或关节滑液。
[0054]
本发明方案不限于sars-cov-2突变型的鉴别，根据本发明原理，其它抗原突变型的鉴别也可以采用本发明方案，本发明方案在目前新冠病毒变异迅速的现状下，能发挥更大的优势，本发明方案也为未来一些新型病原体突变型的鉴定提供新的思路。
[0055]
实施例1单克隆抗体的制备
[0056]
从新冠肺炎康复者外周血中分离全人源单克隆抗体，其流程为：采集康复者的外周血淋巴细胞，利用流式细胞分选出记忆性b淋巴细胞；将单个b细胞接种到384孔板中，并加入细胞因子和饲养细胞培养，培养的b细胞在体外扩增分化后分泌抗体到上清中。然后利用体外高通量中和实验检测上清中的抗体对病毒的中和能力，筛选出阳性克隆，利用rt-pcr的方法克隆出抗体的重链和轻链可变区，并构建至抗体重链、轻链表达载体后，转染293t细胞表达纯化出单克隆抗体。
[0057]
实施例2 h-5t抗体、h-9e抗体、h-36y抗体对抗原的结合力评估
[0058]
对实施例1方法筛选获得的h-5t抗体、h-9e抗体、h-36y抗体和其它2 种抗体(h-6g、h-14c)进行与参考抗原、突变型抗原的结合力评估。实验采用竞争法，测定上述抗体阻断抗原与受体蛋白ace2结合的活性。其中，抗原均包括sars-cov-2rbd或其片段。参考抗原氨基酸序列如seq id no:1所示，突变型抗原即在参考抗原的基础上发生单个或多个位点的突变，例如d614g即 sars-cov-2的刺突蛋白第614位由天冬氨酸突变为甘氨酸，氨基酸序
列如seqid no:2所示，n501y氨基酸序列如seq id no:3所示，k417n氨基酸序列如 seq id no:4所示，e484k氨基酸序列如seq id no:5所示；h79抗原对应 sars-cov-2的刺突蛋白第417位由赖氨酸突变为天冬酰胺、第484位由谷氨酸突变为赖氨酸、第501位由天冬酰胺突变为酪氨酸，氨基酸序列如seq id no:6 所示。ace2蛋白可购自菲鹏生物。
[0059]
表1实施例1方法筛选获得的不同抗体结合力评估
[0060][0061]
以e484k为例，h-5t抗体、h-9e抗体、h-36y抗体对该位点突变抗原的 ic50值是抗体对参考抗原的至少2倍；在之后的检测中，即以这三种抗体作为标记抗体，鉴别结合突变型抗原e484k的抗体。
[0062]
实施例3胶体金平台鉴别突变型
[0063]
参考抗原(第二抗原)的氨基酸序列如seq id no:1所示，e484k(第一抗原)氨基酸序列如seq id no:5所示；h-5t抗体、h-9e抗体、h-36y抗体可购自菲鹏生物；其它试剂和材料均为市购。
[0064]
1.标记
[0065]
(1)胶体金制备：采用传统柠檬酸钠还原法，首先将氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入一定比例的柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀，待溶液颜色变为酒红色且不再变化时停止加热，冷却至室温，得到浓度为万分之四的胶体金溶液；
[0066]
(2)标记：向胶体金溶液中加入0.2m k2co3溶液调节ph至6.0-7.5；
[0067]
(3)离心：向调节ph后的胶体金溶液中加入标记抗体(h-5t、h-9e、h-36y) 并混匀，后加入封闭剂，终止标记，离心10000rpm/7min/4℃，去上清；
[0068]
(4)复溶：重悬至100ul，超声2-3次；
[0069]
(5)铺金：将重悬得到的浓缩金稀释并铺于玻璃纤维素膜，然后放入冻干机冻干(1-2h)或者放入37℃干燥房干燥过夜。
[0070]
2.包被
[0071]
(1)将硝酸纤维素膜与底板组装好备用；
[0072]
(2)将e484k抗原和参考抗原稀释至0.1-1.0mg/ml，用喷金画膜仪，在硝酸纤维素膜上均匀的画t1和t2线(间距6mm)，然后放入37℃恒温箱中进行干燥，至少干燥45min以上。
[0073]
t1线较t2线靠近结合垫，将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接组装
于底板上，组装切条，加样检测。
[0074]
3.检测
[0075]
(1)待检样品：阴性血清、康复者(抗体阳性)血清等。
[0076]
(2)检测方法：使用试纸条进行检测。
[0077]
4.实验结果
[0078]
表2 h-5t抗体对阴性血清、康复者(抗体阳性)血清等的检测结果
[0079]
包被抗原阴性血清23#25#36#47#t1:e484kc4+c4+c4+c8c8+t2:参考抗原c4c6c7+c4c4
[0080]
表3 h-9e抗体对阴性血清、康复者(抗体阳性)血清等的检测结果
[0081]
包被抗原阴性血清23#25#36#47#t1:参考抗原c4c6c7+c4c4t2:e484kc4+c4c4+c7+c7+
[0082]
表4 h-36y抗体对阴性血清、康复者(抗体阳性)血清等的检测结果
[0083][0084][0085]
表2、3、4中，字母b代表不显色，字母c后的数字代表显色，数字越大，显色越弱。
[0086]
结果显示，检测阴性血清时，t1和t2的显色基本相当，加入23#、25#康复者血清时，参考抗原对应的检测线的显色明显降低，而突变型抗原对应的检测线显色无明显降低，可见此两份样本中的抗体结合包括刺突蛋白第484位谷氨酸的非突变型抗原。检测36#、47#康复者血清时，突变型抗原对应的检测线显色降低，且降低相比23#、25#康复者血清更为明显，参考抗原对应的检测线显色无明显降低，可见，此两份样本中存在结合包括刺突蛋白第484位赖氨酸的突变型抗原的抗体；并且相比检测结合非突变型抗原的抗体，检测结合突变型抗原的抗体具有更高的灵敏度；检测抗体对第一抗原、第二抗原的结合力差异越大，在指示含结合突变型抗原的抗体样本中两检测线对比越明显，检测结果与结合力测定结果相吻合；该检测方法在新冠病毒变异多的现阶段具有提高指示结合突变株抗原的抗体的作用。
[0087]
实施例4彩色微球鉴别突变型
[0088]
通过实施例1中方法还筛选得到一株h-27i抗体，该抗体对f456a位点突变抗原(氨基酸序列如seq id no:7所示)的ic50值是抗体对参考抗原的至少 2倍；故以该抗体为标记抗体，鉴别结合突变型抗原f456a的抗体。
[0089]
参考抗原(第二抗原)的氨基酸序列如seq id no:1所示，f456a(第一抗原)氨基酸序列如seq id no:7所示；h-27i抗体可购自菲鹏生物；其它试剂和材料均为市购。
[0090]
1.标记
[0091]
取彩色微球，300w超声后，取0.1ml乳胶颗粒加入0.9ml 100mm mes中，涡旋混匀；15000rmp 15min离心，后去上清；加入1.0ml 100mm mes超声，加入适量mes和nhs活化微球
10min；15000rmp 15min离心，后去上清；加入 1.0ml 100mm mes超声，加入适量标记抗体(h-27i)，37℃涡旋反应过夜； 15000rmp 15min离心，后去上清，加入bsa封闭，超声，37℃反应4h；15000rmp 15min离心，后去上清并清洗，超声；15000rmp 15min离心，后去上清重悬；将重悬得到的浓缩液稀释并铺于玻璃纤维素膜，然后放入冻干机冻干(1-2h)或者放入37℃干燥房干燥过夜，制得结合垫。
[0092]
2.包被
[0093]
(1)将硝酸纤维素膜与底板组装好备用；
[0094]
(2)将f456a抗原和参考抗原稀释至0.1-1.0mg/ml，用喷金画膜仪，在nc 膜上均匀的画t1和t2线(间距6mm)，然后放入37℃恒温箱中进行干燥，至少干燥45min以上。
[0095]
t1线较t2线靠近结合垫，将样品垫、结合垫、nc膜、吸水垫依次搭接组装于底板上，组装切条，加样检测。
[0096]
3.检测
[0097]
(1)待检样品：阴性血清、康复者(抗体阳性)血清等。
[0098]
(2)检测方法：使用试纸条进行检测。
[0099]
4.实验结果
[0100]
表5 h-27i抗体对阴性血清、康复者(抗体阳性)血清等的检测结果
[0101]
包被抗原阴性血清23#25#44#t1:f456ac4+c4+c4+c9+t2:参考抗原c4c6c7+c4
[0102]
表5中，字母b代表不显色，字母c后的数字代表显色，数字越大，显色越弱。
[0103]
结果显示，检测阴性血清时，t1和t2的显色基本相当，加入23#、25#康复者血清时，参考抗原对应的检测线的显色明显降低，而突变型抗原对应的检测线显色无明显降低，可见此两份样本中的抗体结合包括刺突蛋白第456位苯丙氨酸的非突变型抗原。检测44#康复者血清时，突变型抗原对应的检测线显色降低，且降低相比23#、25#康复者血清更为明显，参考抗原对应的检测线显色无明显降低，可见，此份样本中存在结合包括刺突蛋白第456位丙氨酸的突变型抗原的抗体；并且相比检测结合非突变型抗原的抗体，检测结合突变型抗原的抗体具有更高的灵敏度。
[0104]
实施例5
[0105]
本发明可利用包括rbd或其片段的抗原(seq id no:8)作为免疫原免疫制备得到所述抗体。本实施例通过利用seq id no:8的氨基酸短肽偶联载体蛋白作为免疫原，经过筛选获得的r-15q抗体和r-28n抗体均满足对e484k突变抗原的ic50值是其分别对参考抗原的至少2倍，能够实现对该突变型抗原的鉴别。
[0106]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0107]
序列表
[0108]
seq id no:1：
[0109]
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[0110]
seq id no:2：
[0111]
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[0112]
seq id no:3：
[0113]
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[0114]
seq id no:4：
[0115]
rvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsa sfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgniadynykl pddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagst pcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkst nlvknkcvnf
[0116]
seq id no:5：
[0117]
mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdl flpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgt tldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvy ssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlv rdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyv gylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvq ptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfst fkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddf tgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcng vkgfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlv knkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleildit pcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsn vfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrar
[0118]
seq id no:6：
[0119]
rvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsa sfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgniadynykl pddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagst pcngvkgfncyfplqsygfqptygvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkks tnlvknkcvnf
[0120]
seq id no:7：
[0121]
rvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsa sfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynykl pddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlarksnlkpferdisteiyqagst pcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkst nlvknkcvnf
[0122]
seq id no:8：
[0123]
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