用于诊断抗AMA-M2抗体阳性与阴性PBC患者的糖链标志物及其用途

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于诊断抗ama-m2抗体阳性pbc患者与抗ama-m2抗体阴性pbc患者的糖链标志物及其用途。

背景技术：

原发性胆汁性胆管炎(primarybiliarycholangitis，pbc)，是一种自身免疫性疾病，其特征在于慢性炎症和肝内胆管破坏。pbc主要在中年女性中观察到。pbc患者通常表现出异常的肝脏检查，包括碱性磷酸酶(alp)升高，γ谷氨酰转肽酶(ggt)以及症状的组合，包括瘙痒，疲劳和门静脉高压症。抗线粒体抗体(ama)是pbc的血清学标志，在将近95％的患者中发现。血清ama，尤其是ama-m2亚型，被认为是pbc最具体，最可接受的诊断指标之一。ama-m2在pbc中的敏感性和特异性很高，可高达84.5/97.8％。无pbc临床症状但ama阳性的人群极有可能发展为pbc。研究表明仍有5％～l0％的pbc患者血清ama阴性，ama阴性和阳性pbc患者临床表现相同，但ama阴性患者预后更差且表现出更严重的胆管损伤、cd4细胞在导管区浸润增加和胆管损伤早期的b细胞浸润增加。

igg是人体内含量最丰富的抗体。它参与多种体液免疫过程：抗原中和、补体激活和补体依赖性细胞毒(cdc)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒(adcc)和超敏反应。多糖是由多达15个单糖残基组成的复杂低聚糖，约占igg重量的15％，是igg不可分割的部分，它组成的变化会影响igg的结构稳定性、构象和半衰期，以及它的效应器功能。事实上，如果多糖完全去除会导致igg促炎活性和抗炎活性的丧失。自从在类风湿性关节炎患者中发现igg糖基化异常改变后，已有越来越多的证据表明igg糖基化在自身免疫性疾病中发挥着重要的作用。

本研究拟通过高通量的糖基化分析技术——凝集素微阵列技术来检测抗ama-m2亚型阳性患者与阴性患者血清igg糖基化修饰差异，以期探讨糖基化两者在pbc中的临床应用价值。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供一种用于诊断抗ama-m2抗体阳性pbc患者与抗ama-m2抗体阴性pbc患者的糖链标志物及其用途。

首先，本发明提供一种用于诊断抗ama-m2抗体阳性pbc患者与抗ama-m2抗体阴性pbc患者的糖链标志物，其为aba凝集素与igg结合所形成的复合物和/或gnl凝集素与igg结合所形成的复合物。

其中，所述的igg含有半乳糖和/或甘露糖。

其次，本发明还提供所述糖链标志物在用于制备诊断抗ama-m2抗体阳性pbc患者与抗ama-m2抗体阴性pbc患者的试剂中的用途。

具体地，所述诊断包括：测定待测的生物样品中aba凝集素与igg结合所形成的复合物和/或gnl凝集素与igg结合所形成的复合物水平；任选地，

与对照数据比较所述生物样品中aba凝集素与igg结合所形成的复合物的水平和/或gnl凝集素与igg结合所形成的复合物的水平，其中，相对于所述对照数据，所述样品中aba凝集素与igg结合所形成的复合物的水平和/或gnl凝集素与igg结合所形成的复合物的水平可检测地降低表明生物样品来自pbc抗ama-m2抗体阳性的可能性，

其中，所述生物样品为血清样品。

优选的，aba凝集素与igg结合所形成的复合物以及gnl凝集素与igg结合所形成的复合物的水平均通过以下步骤来测量，包括：

a.使来自患者的生物样品与aba凝集素或gnl凝集素接触；

b.在生物样品中存在的igg与aba凝集素或gnl凝集素形成凝集素-聚糖复合物；

c.洗涤来除去任何未结合的igg；

d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体；

e.洗涤来除去任何未结合的被标记的所述检测抗体；和

f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号。

其中，所述的aba凝集素和/或gnl凝集素沉积或固定在固相表面载体上，优选地，所述的固相表面载体是乳胶珠子、多孔平板或膜条、纳米管道、带二维码的薄片等的形式，优选地，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标记。

本发明还提供aba凝集素和/或gnl凝集素在制备用于诊断抗ama-m2抗体阳性pbc患者与抗ama-m2抗体阴性pbc患者的试剂中的用途。

所述诊断包括：测定待测的生物样品中aba凝集素与igg结合所形成的复合物和/或gnl凝集素与igg结合所形成的复合物水平；任选地，

与对照数据比较所述生物样品中aba凝集素与igg结合所形成的复合物的水平和/或gnl凝集素与igg结合所形成的复合物的水平，其中，相对于所述对照数据，所述样品中aba凝集素与igg结合所形成的复合物的水平和/或gnl凝集素与igg结合所形成的复合物的水平可检测地降低表明生物样品来自pbc抗ama-m2抗体阳性的可能性。

其中，所述生物样品为血清样品。

其中，所述的aba凝集素和/或gnl凝集素沉积或固定在固相表面载体上。

其中，所述的固相表面载体优选为乳胶珠子、多孔平板或膜条、纳米管道、带二维码的薄片等的形式。

其中，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标记。

本研究通过采用含有56种凝集素的凝集素芯片检测pbc中抗ama-m2抗体阳性患者与阴性患者血清igg与凝集素特异性结合的聚糖差异。结果显示，与阴性患者相比，aba和gnl凝集素结合聚糖的含量在抗ama-m2抗体阳性患者中是降低的。由于aba凝集素是特异性结合半乳糖，gnl凝集素是特异性结合甘露糖，这表明半乳糖和甘露糖水平在抗ama-m2抗体阳性患者中的表达是减少的。为了证实这一结果的可靠性，本研究还采用凝集素免疫印迹验证结果。结果表明，aba和gnl凝集素结合聚糖的含量在抗线粒体抗体ama-m2阳性患者中依然是降低的，与凝集素微芯片的结果相符合。

附图说明

图1a为整张凝集素芯片；1b为芯片微阵列56种凝集素；1c为cy5标记的igg抗体与凝集素反应荧光强度。

图2所示为凝集素芯片检测pbc患者中抗ama-m2抗体阳性和阴性血清igg与凝集素aba和gnl特异性结合信噪比(*p<0.05，**p<0.01)。

图3所示为凝集素aba免疫印迹图。

图4所示为凝集素印迹检测检测pbc患者中抗ama-m2抗体阳性和阴性血清igg与凝集素aba特异性结合强度(*p<0.05)。

图5所示为凝集素gnl免疫印迹图。

图6所示为凝集素印迹检测检测pbc患者中抗ama-m2抗体阳性和阴性血清igg与凝集素gnl特异性结合强度(*p<0.05)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1凝集素微阵列分析血清igg糖基化

实验标本：本次研究pbc患者：抗ama-m2阳性(20例)，抗ama-m2阴性(20例)，见表1。其中pbc患者的诊断均符合相应疾病的诊断标准。入组的人群均采集新鲜血液，并立即分离出血清，-80℃冻存备用。

表1凝集素芯片实验研究对象基本情况

采用含有56个凝集素的凝集素微阵列来检测实验标本中的糖基化状态。凝集素可特异性的结合糖蛋白末端的聚糖分子，形成复合物，通过不同的凝集素与聚糖的特异性结合来研究目的蛋白表面聚糖的种类与含量。凝集素微阵列因其高效的特点，现今已越来越广泛的应用到糖基化的研究。本研究采用的每张凝集素芯片上有14个凝集素微阵列，而凝集素微阵列包含了56种凝集素，每种凝集素一式三份固定到阵列中。然后，将稀释的血清标本加入到凝集素微阵列，与之反应，再加入cy5标记的igg抗体，可获得每个凝集素与igg特异结合聚糖的信号值，信号值与结合亲和力以及结合强度相关，见图1。

将冻存的标本室温平衡后，将每个标本血清进行1:200稀释后加到微阵列中，4℃孵育过夜。然后,将cy5标记的igg抗体在避光环境下与微阵列中凝集素杂交1小时。对所有凝集素的荧光强度进行了独立分析。并将芯片图像转换为数字格式进行分析。利用各凝集素点的信噪比(点的前景值与背景值的差值)计算了各凝集素点的信噪比(s/n)。为了防止凝集素微阵列在阵列间的偏置,我们使用阵列之间的归一化来归一化s/n数据。根据以下规则,通过组间的数据分布来确定凝集素结合力的显著性差异:(1)组间比较>＝1.3或＝<0.767；(2)组间比较检验类型，若符合正态性，选择t检验，否则选择非参数检验，p值<0.05。

结果：s/n数据显示pbc患者抗ama-m2抗体阳性患者与阴性患者血清igg糖基化差异见表2和表3。与阴性患者相比，抗ama-m2抗体阳性血清igg与凝集素aba和gnl的特异性结合减少(p均<0.05)，见图2。

表2pbc芯片结果

*p<0.05,**p<0.01

表3pbc凝集素及相应聚糖结合特异性

结论：相对于阴性患者，pbc患者中抗ama-m2抗体阳性血清igg与凝集素aba和gnl的特异性结合降低，这表明ama-m2抗体阳性患者血清igg半乳糖和甘露糖表达水平降低。

实施例2血清凝集素印记验证实验

实验标本和方法：为了进一步明确上述凝集素微阵列检测结论的可靠性，采用凝集素微印迹对同批次的抗ama-m2抗体阳性和阴性患者(各6例)和新批次抗ama-m2抗体阳性和阴性患者(各10例)进行了凝集素印迹验证，见表4。血清标本1：100稀释后，加上样缓冲液混合，100℃煮沸5分钟后，在10％的预制胶中进行sds-page电泳，再将预制胶中蛋白电转移到pvdf膜中。将转印成功的pvdf膜进行封闭后，与cy3标记的凝集素进行杂交，最后通过荧光呈像仪检测荧光信号。荧光信号的强度与凝集素结合的糖蛋白糖基的结合力呈正比。

表4验证对象基本资料

结果：通过对凝集素芯片同批次和新批次患者标本(共16例)进行aba和gnl凝集素印迹的结果比较。(1)血清igg与aba凝集素的免疫印迹图(图3)，经过imagj软件条带灰度分析，与抗ama-m2抗体阴性相比，阳性患者血清igg与aba凝集素结合降低(p<0.05)(图4)；(2)血清igg与gnl凝集素的免疫印迹图(图5)，经过imagj软件条带灰度分析，与抗ama-m2抗体阴性相比，阳性患者血清igg与gnl凝集素结合降低(p<0.05)(图6)。这表明，抗ama-m2抗体阳性患者血清中aba和gnl凝集素结合的聚糖——半乳糖和甘露糖水平是异常的。

结论：凝集素印迹验证结果与凝集素芯片检测结果相符合，相对于pbc患者中抗ama-m2阴性患者，抗体阳性的血清igg表达半乳糖和甘露糖水平是异常可作为两者之间的生物标志物。