1.本发明涉及药物领域，具体涉及一种叶酸及其八种杂质的检测方法。
背景技术：
2.蝶酰谷氨酸又名叶酸，又叫维生素b9，淡黄色晶体，微溶于水、甲醇。叶酸在空气中相对稳定，受紫外光照射后易分解，酸性溶液对热不稳定，在中性和碱性环境中十分稳定。叶酸是一类六元杂环类苯甲酸衍生物，对dna、嘌呤、嘧啶的合成具有重要作用。女性在怀孕初期的3个月叶酸补充不足会导致胎儿的神经管发育缺陷、早产和唇腭裂等先天畸形。
3.叶酸不能在人体合成，只能通过食物或膳食补充剂摄取，叶酸的不稳定性会导致自身降解，故合成产品纯度不高，而杂质的存在可能会引起毒副作用。因此对叶酸产品中的杂质进行分析监测至关重要。
4.为了保证药物的安全有效，需要对药物中的有关杂质进行研究、检测和监控。有关物质主要为工艺副产物及降解产物，药品在放置过程中，杂质谱在发生变化，因此需要根据不同的合成路线和生产工艺、储藏条件建立合适的检测方法，达到叶酸中有关物质准确，有效的检测和监控。叶酸及其八种杂质的结构如下所示：
5.叶酸结构：
[0006][0007]
杂质a：
[0008]
(2s)-2-(4-aminobenzamido)pentanedioic acid and(n-(4-aminobenzoyl)-l-glutamic acid)；
[0009][0010]
杂质b：
[0011]
2,5,6-triaminopyrimidin-4(1h)-one；
[0012][0013]
杂质c：
[0014]
(2s)-2-[4-[[(2-amino-4-oxo-1,4-dihydropteridin-7-yl)]pentanedioic aicd(sofolic acid)；
[0015][0016]
杂质d：
[0017]
4-[[(2-amino-4-oxo-1,4-dihydropteridin-6-yl)methyl]amino]benzocin acid(pteroic acid)；
[0018][0019]
杂质e：
[0020]
(2s)-2-[4-bis[(2-amino-4-oxp-1,4dihydropteridin-6-yl)amino]benzamido]pentanedoic acid(6-pterinyfolic acid)；
[0021][0022]
杂质f：
[0023]
2-amino-7-(chloromethyl)pteridin-4(1h)-one；
[0024][0025]
杂质g：
[0026]
(2s)-[4-[(2-amino-7-methyl-4-oxo-1,4-dihydropterin-6-yl)amino]benzamido]pentanedioic acid；
[0027][0028]
杂质h：
[0029]
(2s)-2-[4-[4-[[(2-amino-4-oxo-1,4-dihydropteridin-6-yl)methyl]amino]benzamido]-4-car boxybutanamido]benzamido]pentanedioic acid；
[0030][0031]
现有技术中，《中国药典》2020版、《美国药典》43版和《英国药典》2020版等药典标准均记载有叶酸及其杂质采用高效液相色谱法进行分析测定。但是根据目前现有药典标准记载的方法进行检测分析，存在主成分与杂质分离度不高，尤其是杂质c和杂质e与叶酸主成分无法基线分离的问题，甚至在最终检测结果中，部分杂质并未出峰，无法进行含量测定。综上所述，可以看出由于现有技术中的叶酸检测方法专属性不高，导致叶酸产品很难进行杂质定量监测分析。
技术实现要素：
[0032]
为了解决以上技术问题，本发明通过以下技术方案来实现的：
[0033]
一种叶酸及其八种杂质的检测方法，该检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇—乙酸铵溶液(12:88)为流动相，柱温为25℃，检测波长为280nm。
[0034]
所述乙酸铵溶液的为0.1mol/l的乙酸铵水溶液，采用醋酸溶液调节乙酸铵溶液ph值至6.5。
[0035]
优选地，所述色谱柱规格为chromcore120 c8 5um 4.6*250mm。
[0036]
所述色谱条件还包括流速为0.4ml/min。
[0037]
一种叶酸及其八种杂质的检测方法，具体地，包括以下步骤：
[0038]
(1)主成分及各杂质对照品混合溶液的配置：称取叶酸原料药至容量瓶中，精密称定，加入28.6g/l碳酸钠溶液使其完全溶解后，分别加入杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质f、杂质g及杂质h各杂质对照品后，采用流动相进行定量稀释制成叶酸浓度为1mg/ml，各杂质浓度为5μg/ml的混合溶液；
[0039]
(2)取上述主成分及各杂质对照品混合溶液5μl进行进样，采用上述色谱条件进行检测分析。
[0040]
本发明具有如下的有益效果：
[0041]
(1)本发明方法中通过对流动相、柱温、流速等色谱条件的优化改进，以及各个色谱条件的相互协同作用，从而得到对叶酸及其杂质专属性极高的检测分析方法。
[0042]
(2)采用本发明方法进行叶酸杂质检测分析，不仅杂质c和杂质e于叶酸主成分间分离度良好，同时其他各组分分离度均大于1.5，专属性高，可以精确的对叶酸产品中的杂质进行定量检测分析。
附图说明
[0043]
图1是实施例1的高效液相色谱色谱图；
[0044]
图2是实施例2的高效液相色谱色谱图；
[0045]
图3是实施例3的高效液相色谱色谱图；
[0046]
图4是实施例4的高效液相色谱色谱图；
[0047]
图5是对比例1的高效液相色谱色谱图；
[0048]
图6是对比例2的高效液相色谱色谱图；
具体实施方式
[0049]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0050]
下面为具体实施例：
[0051]
实施例1
[0052]
称取叶酸原料药适量置于容量瓶中，精密称定，加适量28.6g/l碳酸钠溶液是样品完全溶解，分别加入杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质g及杂质h各杂质对照品，再用流动相定量稀释至主成分浓度约1mg/ml，各杂质浓度约5μg/ml的混合溶液；取上述主成分及各杂质对照品混合溶液5μl进样分析，检测结果如图1所示。
[0053]
进样分析色谱条件如下所示：
[0054]
色谱柱：chromcore120 c8 5um 4.6*250mm；
[0055]
流动相：甲醇-0.1mol/l乙酸铵溶液(采用醋酸溶液调节至ph6.5)，甲醇-0.1mol/l乙酸铵溶液的比例为12:88；
[0056]
检测波长：280nm；
[0057]
柱温：25℃；
[0058]
流速：0.4ml/min。
[0059]
从附图中的图1可以看出，采用本实施例检测方法进行分析，叶酸主成分与杂质c的分离度为2.3，叶酸主成分与杂质e分离度为2.2，杂质c和杂质e于叶酸主成分间分离度良好，同时其他各组分分离度均大于1.5，相邻峰之间分离度高，该检测分析方法专属性高。
[0060]
实施例2
[0061]
称取叶酸原料药适量置于容量瓶中，精密称定，加适量28.6g/l碳酸钠溶液是样品完全溶解，分别加入杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质g及杂质h各杂质对照品，再用流动相定量稀释至主成分浓度约1mg/ml，各杂质浓度约5μg/ml的混合溶液；取上述主成分及各杂质对照品混合溶液5μl进样分析，检测结果如图1所示。
[0062]
进样分析色谱条件如下所示：
[0063]
色谱柱：chromcore120 c8 5um 4.6*250mm；
[0064]
流动相：甲醇-0.1mol/l乙酸铵溶液(采用醋酸溶液调节至ph6.5)，甲醇-0.1mol/l乙酸铵溶液的比例为10:90；
[0065]
检测波长：280nm；
[0066]
柱温：25℃；
[0067]
流速：0.4ml/min。
[0068]
与实施例1对比，本实施例进行流动性比例调试，从附图中的图2可以看出，采用本实施例检测方法进行分析，杂质d和杂质e的分离度为1.0，无法进行基线分离，其他部分杂
质并未出峰，由此可以看出采用本实施例分析方法，杂质d和杂质e的分离度低，不能精确的进行定量检测分析，且部分杂质并未出峰，未能测出，由此可见，该检测方法专属性不高。
[0069]
实施例3
[0070]
称取叶酸原料药适量置于容量瓶中，精密称定，加适量28.6g/l碳酸钠溶液是样品完全溶解，分别加入杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质g及杂质h各杂质对照品，再用流动相定量稀释至主成分浓度约1mg/ml，各杂质浓度约5μg/ml的混合溶液；取上述主成分及各杂质对照品混合溶液5μl进样分析，检测结果如图1所示。
[0071]
进样分析色谱条件如下所示：
[0072]
色谱柱：chromcore120 c8 5um 4.6*250mm；
[0073]
流动相：甲醇-0.1mol/l乙酸铵溶液(采用醋酸溶液调节至ph6.5)，甲醇-0.1mol/l乙酸铵溶液的比例为10:90；
[0074]
检测波长：280nm；
[0075]
柱温：30℃；
[0076]
流速：0.4ml/min。
[0077]
与实施例1对比，本实施例中进行柱温调试，从附图中的图3可以看出，采用本实施例检测方法进行分析，溶液中叶酸主成分与相邻杂质c和e无法基线分离，杂质a和杂质b分离度为1.0，其中各组分分离度均大于1.5，由此可见，该检测方法对杂质a、杂质b、杂质c和杂质e的专属性不高。
[0078]
实施例4
[0079]
称取叶酸原料药适量置于容量瓶中，精密称定，加适量28.6g/l碳酸钠溶液是样品完全溶解，分别加入杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质g及杂质h各杂质对照品，再用流动相定量稀释至主成分浓度约1mg/ml，各杂质浓度约5μg/ml的混合溶液；取上述主成分及各杂质对照品混合溶液5μl进样分析，检测结果如图1所示。
[0080]
进样分析色谱条件如下所示：
[0081]
色谱柱：chromcore120 c8 5um 4.6*250mm；
[0082]
流动相：甲醇-0.1mol/l乙酸铵溶液(采用醋酸溶液调节至ph6.5)，甲醇-0.1mol/l乙酸铵溶液的比例为10:90；
[0083]
检测波长：280nm；
[0084]
柱温：30℃；
[0085]
流速：0.5ml/min。
[0086]
与实施例1对比，本实施例中进行流速调试，从附图中的图4可以看出，采用本实施例检测方法进行分析，溶液中叶酸主成分与杂质c的分离度为2.2，溶液中叶酸主成分和杂质e的分离度为2.3，杂质a和杂质b分离度为1.2，其中各组分分离度均大于1.5，由此可见，该检测方法对杂质a、杂质b专属性不高。
[0087]
由上述实施例1、实施例2、实施例3、实施例4的检测结果可以看出，采用实施例1中的检测分析方法，最终检测结果最佳，不仅溶液中杂质c和杂质e于叶酸主成分间分离度良好，同时其他各组分分离度均大于1.5，专属性高，可以精确的对叶酸产品中的杂质进行定量检测分析。
[0088]
对比例1
[0089]
采用《中国药典》2020版和《美国药典》43版记载的方法进行检测分析，具体操作步骤如下：
[0090]
(1)主成分及各杂质对照品混合溶液的配制：称取叶酸、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质f、杂质g及杂质h各对照品适量，用适量氨试液溶解，再用流动相稀释制成各组分浓度约5μg/ml的混合溶液。
[0091]
(2)色谱柱c18(4.6
×
250mm，5μm)，流动相甲醇：以磷酸盐缓冲液(ph5.0)(取1mol/l磷酸溶液7ml与甲醇270ml，磷酸二氢钾2.0g，加水约650ml溶解，加0.5mol/l四丁基氢氧化铵的甲醇溶液15ml、1mol/l磷酸溶液或氨试液调节至ph值至5.0，用水稀释至1000ml)为流动相，流速1.2ml/min，波长280nm，进行杂质分离度情况测试；
[0092]
取上述主成分及各杂质对照品混合溶液5μl进样分析。
[0093]
从附图中的图5可以看出，采用该对比例1中《中国药典》2020版和《美国药典》43版记载的方法进行检测分析，溶液中杂质h并未出峰，其他各组分分离度均大于1.5，由此可以看出，该方法对杂质h的专属性不高。
[0094]
对比例2
[0095]
采用《英国药典》2020版方法；
[0096]
色谱柱：c8(4.6
×
250mm，5μm)
[0097]
流动相：甲醇：水相(11.16g/l磷酸二氢钾和5.50g/l磷酸氢二钾溶液)＝12:88；
[0098]
流速：0.6ml/min；
[0099]
波长：280nm；
[0100]
柱温：25℃；
[0101]
主成分及各杂质对照品混合溶液的配制：称取叶酸原料药适量至是以容量瓶中，精密称定，加适量28.6g/l碳酸钠溶液使样品完全溶解，分别加入杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质f、杂质g及杂质h各对照品储备液，再用流动相定量稀释制成主成分浓度约1mg/ml，各杂质浓度约为5μg/ml的混合溶液。
[0102]
测定法：取上述主成分及各杂质对照品混合溶液5μl进样分析；
[0103]
试验结果：从附图中的图6所示看，可以看出溶液中主成分c无法与基线分离，主成分与杂质c分离度为1.4，主成分与杂质e分离度为1.6，其他各杂质分离度均大于1.5，由此可见现有技术中《英国药典》2020版记载的检测方法对杂质c的专属性不高，同时对杂质e的专属性也欠佳。
[0104]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。