一种检测酪氨酸酶活性的方法

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种酪氨酸酶活性的荧光检测方法。

背景技术：

酪氨酸酶是一种含铜金属氧化还原酶，在微生物、动物、植物和人体中都有分布，其在黑色素的代谢过程中起到很重要的作用。酪氨酸酶可以催化酪氨酸转变为多巴，然后氧化多巴形成多巴醌，多巴醌在生物体内经过一系列反应后，可以形成黑色素。酪氨酸酶活性过高或缺失，都会影响黑色素的产生，进而可能引起雀斑、褐斑、皮肤癌、白癜风、白化病、黑色素瘤等疾病。因此，开发酪氨酸酶活性检测方法具有重要意义。

由于酪氨酸酶的底物是酪氨酸、多巴等含酚羟基的分子，目前使用的荧光探针多数是酚类衍生物或者含酚类衍生物的材料，大部分需要进行相对复杂的化学合成。本发明中使用的大环分子葫芦[8]脲(cb[8])、荧光分子硫黄素-t(tht)和多肽yla或dopa-la均是可以购买得到的，不需要经过复杂的合成。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用荧光来检测酪氨酸酶活性的方法。该方法不需要标记、不需要合成复杂的荧光分子或材料，且可以对酪氨酸酶的活性进行连续监测，应用前景广阔。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1.cb[8]-tht-yla/dopa-la体系

将多肽yla或dopa-la与tht、cb[8]以不同摩尔比在缓冲液中均匀混合，孵育适当时间后，在激发波长417nm、发射波长450nm-699nm下进行光谱扫描，同时测定激发波长为417nm、发射波长为570nm的荧光信号值。

2.酪氨酸酶活性的检测

将cb[8]、tht和yla/dopa-la以特定摩尔比在缓冲液中均匀混合后恒温孵育一定时间，把不同浓度酪氨酸酶溶液加入上述体系，在激发波长417nm、发射波长570nm下进行持续荧光测量，每隔1min测一次。根据荧光信号随时间变化的曲线，可以算出酶催化反应的速率，经线性拟合发现速率与酶浓度成正比，表明该方法可用于测定酪氨酸酶活性。

3.曲酸抑制酪氨酸酶活性的检测

将酪氨酸酶与不同浓度的抑制剂分子恒温孵育一定时间后，加入特定摩尔比的cb[8]-tht-yla/dopa-la溶液；在激发波长为417nm、发射波长为570nm下进行荧光信号强度测定，同样每隔1min测一次。根据荧光信号随时间变化的曲线，可以算出酶催化反应的速率与抑制剂浓度的关系，进一步的可以计算出抑制剂的ic50值。

本发明的检测原理：tht分子可以与cb[8]结合，且结合后荧光信号会增强；多肽yla或dopa-la也可以结合cb[8]，那么在cb[8]-tht-yla/dopa-la的三元体系中，若多肽浓度较高，则tht与cb[8]结合较少，其荧光信号增强的幅度会降低；在酪氨酸酶的作用下多肽yla/dopa-la会被氧化成复杂产物，这些产物与cb[8]结合力很弱，因此tht与cb[8]的结合会变多，荧光信号会增强。据此，我们根据cb[8]-tht-yla/dopa-la这个三元体系在加入酪氨酸酶后荧光信号增强的快慢，即可测定酪氨酸酶的活性。

本发明的有益效果在于：本发明建立的基于cb[8]-荧光分子-多肽的三元体系，能快速、准确地实现对酪氨酸酶活性进行连续监测；整个操作过程非常简单，无需任何修饰和标记，成本低廉，具有较强的应用性。

附图说明

图1a.酪氨酸酶氧化酪氨酸形成多巴及后续产物。b.本方法实施例中用到的分子结构式。c.本发明方法的原理示意图。

图2为cb[8]结合tht以及yla/dopa-la竞争cb[8]和tht及之间结合力的荧光发射光谱图。a.随cb[8]浓度增加，左：tht荧光发射光谱的变化；右：417nm激发，570nm发射的荧光强度变化。b.cb[8]-tht体系中，随着yla浓度增加，左：荧光发射光谱的变化；右：417nm激发，570nm发射的荧光强度变化。c.cb[8]-tht体系中，随着dopa-la浓度增加，左：荧光发射光谱的变化；右：417nm激发，570nm发射的荧光强度变化。

图3中左图为cb[8]、tht和yla(a)/dopa-la(b)体系与不同浓度的酪氨酸酶反应的荧光强度随时间的变化图；右图为酶促反应速率与酶浓度的线性拟合。

图4是曲酸浓度与酪氨酸酶活性的关系，a.cb[8]-tht-yla体系；b.cb[8]-tht-dopa-la体系；c.l-dopa体系。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明中的酪氨酸酶活性的荧光检测方法做进一步说明。

实施例1

（1）cb[8]-tht-yla/dopa-la体系：在磷酸盐缓冲液中，用1.5mlep管将3μmtht、10μmcb[8]和不同浓度的yla/dopa-la均匀混合在金属浴37℃下孵育10min后，添加到96孔黑板中。在激发波长为417nm、发射波长为450nm-699nm，37℃恒温下的酶标仪中进行光谱扫描。同时测定激发波长为417nm、发射波长为570nm的荧光信号值。

（2）酪氨酸酶活性检测：将3μmtht、10μmcb[8]和20μmyla/dopa-la在磷酸缓冲液中均匀混合在96孔黑板中，37℃恒温下孵育10min。不同浓度的酪氨酸酶（浓度为0,10,25,50,75,100,125nm）同样添加到96孔黑板中在37℃恒温下孵育10分钟。用排枪将孵育好的酶加入cb[8]-tht-yla/dopa-la混合液,在激发波长和发射波长分别为417nm和570nm，37℃恒温下，在酶标仪中对酪氨酸酶的活性进行连续监测。

（3）曲酸抑制酶活性检测：把100nm酪氨酸酶和不同浓度曲酸（浓度为0,0.1,1,5,10,20,40,80,100,200,400,800,1200,2000μm）添加到96孔黑板中，在37℃下恒温孵育20min。用1.5mlep管将3μmtht、10μmcb[8]和20μmyla/dopa-la在磷酸缓冲液中混合，同样在37℃恒温下孵育20min。用排抢将cb[8]-tht-yla/dopa-la混合液加入到曲酸和酶的混合液中，在激发波长和发射波长分别为417nm和570nm，37℃恒温的酶标仪中连续监测酪氨酸酶的活性。

从图2中可以看出cb[8]与tht结合后会增强tht的荧光强度，同时最大发射波长从480nm附近偏移到570nm（图2a）；yla（图2b）或dopa-la（图2c）竞争结合cb[8]后会使tht荧光信号强度降低，同时最大发射波长从570nm回复到480nm附近。

图3（左）为cb[8]、tht、yla/dopa-la与不同浓度的酪氨酸酶反应的荧光强度随时间的变化图(a:yla,b:dopa-la)。从图中可以看出荧光信号强度增加的速率随着酶浓度升高而升高。根据图3（左）可以拟合出酶促反应速率，进一步对不同酶浓度下的酶促反应速率作图，发现速率与酶浓度之间有着良好的线性关系，见图3（右）。

图4为利用曲酸抑制酶活性的曲线。从图中可以看出随着曲酸浓度的增加，酪氨酸酶的活性不断降低，在yla(a)、dopa-la(b)的浓度相同的情况下，当酶活性的抑制率为50%时，yla-曲酸组的ic50值为30μm，dopa-la-曲酸组的ic50值为31μm。图4c为使用常规的酪氨酸酶活性测试方法测得的曲酸ic50值为31μm，证明了我们的方法的准确性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。