草莓镶脉病毒胶体金试纸条及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于胶体金免疫试纸条的制备技术领域，具体涉及一种草莓镶脉病毒胶体金试纸条及其制备方法与应用。


背景技术：

2.草莓产量在世界小浆果中居首位，属于蔷薇科草莓属多年生草本植物。无性繁殖植株一旦受到病毒侵染,病毒会随着无性繁殖材料传播扩散。经过几年的带毒栽培,引进品种的品质变劣、退化现象普遍发生,造成草莓严重减产,1年内可达30％-80％,且危害逐年递增。
3.草莓镶脉病毒是一种对草莓危害较严重的潜隐性病毒,也是危害我国草莓生产的4种主要病毒之一。单独侵染一般不表现明显症状,复合侵染能引起草莓植株叶片扭曲,叶脉皱缩，植株极度矮化,匍匐茎大量减少等,甚至造成部分草莓地块绝产绝收。svbv属花椰菜花叶病毒科花椰菜花叶病毒属病毒成员,目前,蚜虫是svbv唯一的自然传播介体,以半持久性方式传播。可以嫁接传播,种子和花粉不能传播。种苗带毒已是生产中病毒传播的主要因素和草莓生产的限制因素之一。
4.草莓种苗中病毒的快速准确检测是防治草莓病毒病的重要措施。目前的草莓病毒检测方法有利用病毒指示植物的“小叶嫁接法”,酶联免疫吸附法、聚合酶链式反应、实时荧光定量pcr法。但是这种方法周期长、灵敏度较低、费时费工、需要特殊的仪器。


技术实现要素：

5.本发明解决的技术问题是提供一种草莓镶脉病毒胶体金试纸条及其制备方法与应用。
6.本发明提供的草莓镶脉病毒免疫胶体金快速检测试纸条，包括底板和放置在其上的样品垫、包被胶体金标记抗体金标垫、含有检测线t和质控线c的检测垫和吸收垫；
7.所述胶体金标记抗体为胶体金标记由草莓镶脉病毒制备的多抗；
8.所述检测线t由草莓镶脉病毒制备的多抗形成；
9.所述质控线c由鼠抗兔igg或鼠抗兔igg溶液形成。
10.上述草莓镶脉病毒免疫胶体金快速检测试纸条中，构成所述底板的材料为pvc板；
11.所述检测线和质控线之间的距离为5mm；
12.所述样品垫和所述包被胶体金标记抗体金标垫的叠压宽度为2mm；
13.所述包被胶体金标记抗体金标垫和所述检测垫的叠压宽度为2mm；
14.所述检测垫和所述吸收垫的叠压宽度为2mm。
15.所述胶体金标记抗体的包被浓度为10μg/ml；
16.所述检测线t的包被浓度为1.6mg/ml；
17.所述质控线c的包被浓度为1.0mg/ml。
18.上述草莓镶脉病毒免疫胶体金快速检测试纸条课按照下述方法制得：
19.1)制备草莓镶脉病毒的多抗，为将草莓镶脉病毒免疫动物，收集血清得到；
20.2)包被胶体金标记抗体金标垫的制备
21.用0.1mol/l k3co4将胶体金溶液的ph值调整到7.4-7.7(具体可为7.5)，加完后室温静置20min；加入tris-hc1缓冲液配制的5％bsa溶液至终浓度为1％混匀封闭，室温静置15min；将金标抗体复合物低速1500r/min低温4℃离心20min，弃掉底部聚合物杂质，用移液器轻轻吸取上清转移到另一离心管中，再以4℃10000r/min离心20-30min；将得到的金标抗体产物用金标抗体复溶液以二分之一体积重悬；4℃避光保存备用；先将玻璃纤维素膜浸泡在结合垫处理液中10-20min，置于37℃烘箱中过夜干燥，然后将金标抗体溶液均匀喷洒在玻璃纤维上，在37℃烘箱干燥1-2h，得到包被胶体金标记抗体金标垫；
22.3)硝酸纤维素膜的制备
23.包被硝酸纤维素膜制备时检测线(t)草莓镶脉病毒多抗浓度为1.6mg/ml，1ul/cm划膜，并重复一次，质控线(c)鼠抗兔igg浓度为1.0mg/ml，1ul/cm划膜。检测线和质控线相距5mm位于硝酸纤维素膜的中心，室温自然干燥，封装后于4℃保存备用；
24.4)试纸条的组装
25.将胶体金标记多肽p25表位抗体吸附于结合垫上得到金标抗体结合垫，再将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫按次序保持2mm的重叠宽度后粘贴至pvc板构成的支撑层上，然后裁切为宽度为4mm的长条状试纸条，再将试纸条装入试纸卡中，放入烘烤箱中干燥保存备用。
26.另外，本发明还要求保护草莓镶脉病毒免疫胶体金快速检测试纸条在检测草莓镶脉病毒中的应用。
27.本发明与现有技术相比具有以下有益效果：采用胶体金标记的草莓镶脉病毒抗体成功制备了快速检测试纸条，该快速检测试纸条显示出较高的灵敏度和特异性，与其它病毒如草莓镶脉病毒和黄瓜花叶病毒无交叉反应性，并能能够在5-10min内检测草莓镶脉病毒，而且不依赖于其它仪器和试剂，因此便于在现场快速检测草莓镶脉病毒。
附图说明
28.图1为本发明草莓镶脉病毒免疫胶体金快速检测试纸条的结构示意图；
29.图2为本发明草莓镶脉病毒免疫胶体金快速检测试纸条的检测示意图；
30.图3为本发明草莓镶脉病毒免疫胶体金快速检测试纸条灵敏性检测图；
31.图4为本发明草莓镶脉病毒免疫胶体金快速检测试纸条特异性检测图。
具体实施方式
32.下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。下述实施例所用草莓镶脉病毒北京分离物(bjjcx2)公开记载在下述网址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/kx249738.1。
33.实施例1
34.如图1所示，草莓镶脉病毒病毒免疫胶体金快速检测试纸条，所述试纸条的底层为pvc板构成的支撑层，该支撑层上依次黏附有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤
维素膜和吸收垫，其中金标抗体结合垫上吸附有胶体金标记的草莓镶脉病毒抗体，硝酸纤维素膜上喷涂有草莓镶脉病毒溶液印制的检测线和鼠抗兔igg溶液印制的质控线，检测线和质控线之间的距离为5mm
35.草莓镶脉病毒免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法为：
36.(1)草莓镶脉病毒高效抗血清的制备
37.采集草莓镶脉病毒感染(rt-pcr检测阳性)的草莓叶片，提取草莓叶片蛋白粗提液(每1g叶片中加入1ml提取液(10mm pb，ph 7.4)，用研钵充分挤压、碾碎，10℃，5000rpm，离心30min，所获得上清即为粗提液)，免疫新西兰大白兔，首次免疫三周后进行第二次免疫，以后每隔两周进行加强免疫，免疫四次之后停止免疫并采血(挑选健康的6周大小的新西兰大白兔(约2kg)。
38.a.第一次免疫：
39.将0.5ml弗氏完全佐剂与0.5ml粗提液充分混匀；分别在兔子背部和大腿根部各免疫2个部位，每个部位注射250ul；
40.b.3周后第二次免疫
41.将0.2ml弗氏完全佐剂与0.2ml粗提液充分混匀；分别在兔子背部和大腿根部各免疫2个部位，每个部位注射100ul；
42.c.2周后第三次免疫
43.将0.2ml弗氏完全佐剂与0.2ml粗提液充分混匀；分别在兔子背部和大腿根部各免疫2个部位，每个部位注射100ul；
44.d.2周后第四次免疫
45.将0.2ml弗氏不完全佐剂与0.2ml粗提液充分混匀；分别在兔子背部和大腿根部各免疫2个部位，每个部位注射100ul；
46.e.10天后，耳缘静脉采血测效价，检测合格后颈动脉采血，并离心(10℃，3000rpm，20min)分离血清。
47.按照下述方法制备得到svbv抗体：
48.a.将抗血清用生理盐水按1:1体积比混合；b.加入等体积的饱和硫酸铵溶液，共沉淀；c.离心(10℃，3000rpm，20min)去掉上清，将沉淀用生理盐水溶解；d.用20mm pb+0.15m nacl，ph 7.0透析处理；e.蛋白a亲和纯化；f.通过胶体碳吸附，进一步纯化，去掉植物自身成分产生的抗体，进而获得svbv特异性抗体；
49.(2)草莓镶脉病毒抗体的纯化
50.用胶体碳吸附(胶体碳浓度：0.1wt％、胶体碳粒径：80～100nm每1ml胶体碳溶液中加入1ml健康草莓叶片处理液，37℃吸附反应1小时)健康草莓叶片处理液，并与蛋白a(金黄色葡萄球菌a蛋白(staphylococcal protein a)，简称：蛋白a(protein a/spa)；源自于大肠杆菌重组表达)亲和纯化(a.用平衡缓冲液(20mm pb+0.15m nacl，ph 7.0)平衡蛋白a层析柱；b.取经硫酸铵沉淀并用平衡缓冲液透析处理过的smyev抗体粗品，缓慢上样；c.上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线；d.用洗脱缓冲液(0.1m甘氨酸，ph 3.0)洗脱，收集流出液；e.立刻用碱性缓冲液(1m tris-hcl，ph9.0)将收集到的抗体溶液中和至ph 7.5，备用)获得的草莓镶脉病毒抗体混合反应，离心(37℃水浴反应1小时；10℃，10000rpm，离心30min)去掉沉淀，重复上述步骤3次，获得高纯度的smyev特异性抗体，纯度为95％。-20℃保
存备用；
51.(3)包被胶体金标记抗体金标垫的制备
52.标记：ph为7.5，标记抗体量为10μg/ml，标记反应时间为20分钟；具体步骤为：用0.1mol/l k3co4将胶体金溶液的ph值调整到7.5，加完后室温静置20min；加入tris-hc1缓冲液配制的5％bsa溶液至终浓度(是指bsa在总溶液体积中的含量为1％；例如：取80ml胶体金，加入20ml、5％浓度的bsa溶液，则bsa在100ml总溶液中的最终浓度为1％)为1％混匀封闭，以防止发生非特异性聚集，室温静置15min；将金标抗体复合物低速1500r/min低温4℃离心20min，弃掉底部聚合物杂质，用移液器轻轻吸取上清转移到另一离心管中，再以4℃10000r/min离心20-30min；将得到的金标抗体产物用金标抗体复溶液以二分之一体积重悬；4℃避光保存备用；先将玻璃纤维素膜浸泡在结合垫处理液中10-20min，置于37℃烘箱中过夜干燥，然后将金标抗体溶液均匀喷洒在玻璃纤维上，在37℃烘箱干燥1-2h，得到包被胶体金标记抗体金标垫；
53.(4)硝酸纤维素膜的制备
54.包被：将svbv抗体用10mmpb，ph7.4配制成1.6mg/ml，用划膜仪按1ul/cm划线在硝酸纤维素膜上，形成检测线，37℃鼓风干燥，封装后于4℃保存备用；制作胶体金试纸条，检测健康叶片处理液上清和患病叶片处理液上清，显色效果显示svbv患病叶片处理液显色强度明显优于健康叶片处理液，说明svbv病毒产生了良好的免疫应答。
55.(5)试纸条的组装
56.将样品垫、包被胶体金标记抗体金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫按次序保持2mm的重叠宽度后粘贴至pvc板构成的支撑层上，然后裁切为宽度为4mm的长条状试纸条，再将试纸条装入试纸卡中，放入烘烤箱中干燥保存备用。
57.免疫层析试纸检测原理如图2所示，用pbs溶液研磨的样品滴至样品垫上后，在毛细作用下，从样品垫一端往吸收垫一端流动，若样品中含有草莓镶脉病毒，金标抗体会与之结合形成抗原-抗体-胶体金复合物，形成的复合物在移动至检测线和质控线处时，样品中的草莓镶脉病毒与检测线上的病毒抗体结合并形成一条红线即为检测线(t线)，质控线上的鼠抗兔igg则将会与金标抗体结合形成另一条红线即为质控线(c线)。由于阴性样品中不含有草莓镶脉病毒，因此检测线上的病毒抗体不能与抗原-抗体-胶体金复合物结合而拦截金标抗体，所以检测线处无条带，但是质控线上的鼠抗兔igg却能始终与金标抗体结合而形成一条红线，因此通过质控线能判断试纸条是否有效。
58.试纸条的灵敏度和特异性检测
59.将健康样品、草莓镶脉病毒侵染的患病样品稀释10倍、50倍、100倍、500倍进行免疫试纸条检测，如图3和图4所示，稀释100倍仍能观测到条带，表明检测样品可以稀释至100倍。同时对侵染草莓的镶脉病毒、皱缩病度和斑驳病毒进行特异性检测，发现该试纸条具有很好的特异性。