一种定量检测血清中维生素B12的方法及预处理试剂盒与流程

本发明涉及微量化合物检测
技术领域：
，具体涉及一种定量检测血清中维生素b12的方法及预处理试剂盒。
背景技术：
：公开该
背景技术：
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。维生素b12又叫钴胺素，是唯一一类含有金属元素的维生素，自然界中的维生素b12都是微生物合成的，高等动植物不能制造维生素b12。维生素b12是需要一种肠道分泌物(内源因子)帮助才能被吸收的惟一的一种维生素。有的人由于肠胃异常，缺乏这种内源因子，即使膳食中来源充足也会患恶性贫血。植物性食物中基本上没有维生素b12.它在肠道内停留时间长，大约需要三小时(大多数水溶性维生素只需要几秒钟)才能被吸收。维生素b12的主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血，防止大脑神经受到破坏。维生素b12的家族成员主要包括：氰钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺和甲钴胺。它们在临床应用中，也有不同的意义。(1)氰钴胺氰钴胺需在体内转化为甲钴胺和腺苷钴胺后起效，其稳定性最好，在体内的吸收速度也位居四者之首，虽然它不能被人体直接利用，但它的功效决不亚于直接使用腺苷钴胺。(2)甲钴胺甲钴胺在人体内的吸收速度仅次于氰钴胺，它对神经组织具有良好的传递性，可促进核酸-蛋白-脂肪代谢，修复受损的神经组织，在临床上对有糖尿病引起的神经障碍、多发性神经炎等周围神经病，尤其对麻木、疼痛和麻痹有明显的疗效。在治疗周围神经病变方面，甲钴胺临床应用的安全性及疗效均优于腺苷钴胺和氰钴胺。《2013糖尿病周围神经病变诊断和治疗共识》推荐补充b族维生素可以改善糖尿病神经病变，针对神经营养修复治疗推荐甲钴胺作为辅助治疗。(3)羟钴胺羟钴胺的水溶性较好，在尿中的代谢速度慢，故被称长效钴胺素。虽然其吸收速度不及氰钴胺和甲钴胺，但是它在眼部能达到较高浓度，有利于缓解视觉疲劳并营养视神经，因此它对烟草中毒性弱视有一定的疗效。此外，羟钴胺在水溶液中能够快速与游离的氰根结合生成无毒的氰钴胺，因此它已被多个国家批准用于已知或疑似氰化物中毒的治疗。(4)腺苷钴胺腺苷钴胺在国际上被用作生化试剂和试验试剂，目前只有中国药典把它收载为药品。腺苷钴胺在中国市场上已经应用多年，作用与其它家族成员基本相同。参考书有将腺苷钴胺划分为血液系统用药，它除用于治疗巨幼红细胞性贫血外还可用于营养不良性贫血、妊娠期贫血及放射线和化疗药物引起的白细胞减少症等。腺苷钴胺可以提高体内血红蛋白含量，改善贫血，疗效明显。血清维生素b12的测定是最直接的鉴定方法。目前血清检测方法主要有化学发光法、液相色谱-串联质谱法、液相色谱-电感耦合等离子体法等。其中液相色谱-串联质谱法只单一检测vb12家族中的氰钴胺，并没有同时检测vb12家族的四重物质，目前市面上应用的化学发光法可测定维生素b12家族，其应用原理是酶联免疫。液相色谱-电感耦合等离子体法也可检测维生素b12家族，其原理是检测维生素b12家族所含的钴元素。而应用液相色谱-串联质谱法目前只单一检测vb12家族中的氰钴胺，有一定的片面性，无法真实反映人体内vb12含量。有发明将甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺转化为氰钴胺去检测总vb12，其方法并没有对vb12家族的其他成员进行直接定量，未考虑转化为氰钴胺时转化效率的问题，会导致定量不准确。且转化过程使用的氰化物有剧毒，不适合作为常规的检测方法。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明建立了一种高效液相色谱－质谱联用法(hplc－ms/ms)测定血清中氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺浓度的方法，可用于临床上vb12家族的浓度监测，更真实的反映人血清中维生素b12含量，在药物浓度监测方面，能更清晰准确的辅助指导用药，分别对氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺进行定量可更直观的调节药物用量及评价不同药物的疗效。为了实现上述目的，本发明的技术方案如下所述：在本发明的第一方面，提供一种定量检测血清中维生素b12的方法，所述方法包括：采用甲醇和异丙醇沉淀、氮吹复溶的方法对血清样本进行预处理；配制氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺的对照品溶液；将预处理后的血清样本和配制的对照品溶液进行hplc－ms/ms检测。发明人发现采用hplc－ms/ms检测人体内vb12含量时，只单一检测vb12家族中的氰钴胺有一定的片面性，无法真实反映人体内vb12含量；而将甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺转化为氰钴胺去检测总vb12的方法未考虑转化为氰钴胺时转化效率的问题，还会导致定量不准确。本发明首次提供了一种通过高效液相色谱-串联质谱法检测维生素b12家族浓度的方法，可对血清中氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺进行药物浓度检测，也可用该指标反映人体内维生素b12的营养状况，解决了质谱法单一检测氰钴胺代表维生素b12的片面性。本发明需要克服的技术难点有两个，其一是由于vb12家族在人体里含量低，难检测，发明人对比了几种蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取等方法，综合四种物质的提取效率，最终选择甲醇和异丙醇混合溶液沉淀、氮吹复溶的方法提取，使其能满足检测要求；其二是由于vb12家族结构相似，断裂后的子离子碎片大小相同，母离子大小也很接近，为了避免在质谱上互相干扰，需要将四种物质在液相上分开，在尝试了几种不同的色谱柱、流动相组成以及调节液相梯度后，最终将四种物质分开。本发明建立的hplc－ms/ms测定血清中氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺浓度的方法，可用于临床上vb12家族的浓度监测，更真实的反映人血清中维生素b12含量，在药物浓度监测方面，能更清晰准确的辅助指导用药。将血清提取后，用质谱扫描氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺的离子对，对其进行浓度定量，检测灵敏度高，检出限低，准确度好。在本发明的第二方面，提供一种检测血清中维生素b12的预处理试剂盒，所述试剂盒包括甲醇和异丙醇混合溶液。本发明的具体实施方式具有以下有益效果：解决了现有技术中应用液相色谱-串联质谱法检测人体内vb12含量时只单一检测vb12家族中的氰钴胺，有一定的片面性，无法真实反映人体内vb12含量的问题，定量更加准确。且检测过程中不使用有剧毒的氰化物，检测方法更加安全；分别对氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺进行定量分析，在监测血液药物浓度来指导用药方面能够更直观的调节药物用量及评价不同药物的疗效；通过对血清样本的预处理解决vb12家族在人体里含量低，难检测的问题，通过甲醇和异丙醇混合溶液沉淀、氮吹复溶的方法对血清样本中的vb12进行提取，使其能满足检测要求；vb12家族结构相似，断裂后的子离子碎片大小相同，母离子大小也很接近，本发明的实施方式通过对色谱柱、流动相组成以及调节液相梯度，将氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺四种物质分开，避免在质谱上互相干扰；本发明实施方式中建立的hplc－ms/ms测定血清中氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺浓度的方法，检测灵敏度高，检出限低，准确度好，可用于临床上vb12家族的浓度监测，更真实的反映人血清中维生素b12含量，在药物浓度监测方面，能更清晰准确的辅助指导用药。附图说明构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。图1为本发明实施例的维生素b12家族中氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺和腺苷钴胺的色谱图；图2为本发明实施例的维生素b12家族中氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺和腺苷钴胺的标准曲线图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。本发明的一种实施方式中，提供了一种定量检测血清中维生素b12的方法，所述方法包括：采用甲醇和异丙醇沉淀、氮吹复溶的方法对血清样本进行预处理；配制氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺的对照品溶液；将预处理后的血清样本和配制的对照品溶液进行hplc－ms/ms检测。在一种具体的实施方式中，血清样本预处理的步骤为：取血清样品加入内标溶液后再加入甲醇和异丙醇混合溶液，上清溶液用氮气吹干，用甲醇溶液复溶，复溶后转入进样板，进行hplc－ms/ms分析，所有操作在避光条件下进行。优选的，所述内标溶液为氰钴胺－d7溶液，进一步优选的，氰钴胺溶液浓度为0.5-1.5μg/ml；临用时，用甲醇稀释至所需浓度；用同位素标记的氰钴胺做内标，可以减小实验过程中带来的误差，提高准确性。该系列实施例中，所述甲醇和异丙醇混合溶液为甲醇：异丙醇体积比为8～10:1的混合溶液；优选的，甲醇：异丙醇体积比为9:1。该系列实施例中，所述甲醇溶液为体积百分数为40-60％的甲醇水溶液；该系列实施例中，血清样本预处理过程的所有操作在避光条件下进行。在一种具体的实施方式中，对照品溶液的配制：氰钴胺标准品用水溶解，配制成终浓度为1mg/ml的储备液；甲钴胺标准品用甲醇溶解，配制成终浓度为1mg/ml的储备液；羟钴胺标准品用水溶解，配制成终浓度为1mg/ml的储备液；腺苷钴胺标准品用甲醇溶解，配制成终浓度为1mg/ml的储备液。该系列实施例中，对照品溶液的配制过程全程避光操作。在一种具体的实施方式中，液相色谱的色谱柱选用五氟苯基填料的色谱柱，优选为飞诺美kinetexf5色谱柱(2.1mm×100mm，2.7μm)；在一种具体的实施方式中，液相色谱的流动相a为含0.1-0.2％％甲酸的水溶液；流动相b为含0.1-0.2％甲酸的甲醇溶液；该系列实施例中，液相色谱的梯度洗脱程序为:0～1.0min，1％b，3.0～6.0min，98％b，6.5～9min，1％b；该系列实施例中，柱温为35-45℃；流速为0.3-0.5ml/min。在一种具体的实施方式中，质谱条件为：采用电喷雾esi源正离子方式，离子源温度500-600℃，正离子电压3000-4000v。在本发明的第二方面，提供一种检测血清中维生素b12的预处理试剂盒，所述试剂盒包括甲醇和异丙醇混合溶液；优选的，所述甲醇和异丙醇的体积比8～10:1，进一步优选为9:1。下面结合具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明。实施例1氰钴胺(对照品)，纯度：99％；甲钴胺(对照品)，纯度:97％；羟钴胺(对照品)，纯度：96％；腺苷钴胺(对照品)，纯度：98％；氰钴胺－d7(内标)，纯度：>99％。(1)制备内标溶液用同位素标记的氰钴胺做内标，将氰钴胺－d7用甲醇配制为1μg/ml的溶液；临用时，用甲醇稀释至所需浓度。(2)配制对照品溶液氰钴胺标准品用水溶解，配制成终浓度为1mg/ml的储备液；甲钴胺标准品用甲醇溶解，配制成终浓度为1mg/ml的储备液；羟钴胺标准品用水溶解，配制成终浓度为1mg/ml的储备液；腺苷钴胺标准品用甲醇溶解，配制成终浓度为1mg/ml的储备液。此过程全程避光操作。(3)血清样本的预处理a.血清样本预处理条件的优化对比蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取等预处理方法，能够将氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺四种物质都提取出来是甲醇沉淀法，在此基础上，发明人又对提取试剂进行了优化，最终确定甲醇和异丙醇混合溶液(8～10:1，v/v)效果最佳。b.采用优化后的条件对血清样本进行预处理取血清样品200μl加入棕色玻璃瓶中，加入内标溶液(1μg/ml)1μl，涡旋30s，加入甲醇：异丙醇(9:1,v/v)600μl，涡旋5min，离心5min，取上清溶液至另一玻璃瓶中，氮气吹干，用75μl50％甲醇(甲醇：水＝1：1，v/v)复溶，复溶后转入进样板，进行hplc－ms/ms分析，所有操作在避光条件下进行。(4)hplc－ms/ms检测仪器：ysext9900md高效液相色谱串联质谱检测系统。a.色谱柱的优化选择：为了分开氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺四种物质，发明人尝试了几种不同的色谱柱，型号分别是飞诺美kinetexc18色谱柱(2.1mm×100mm，2.7μm)、飞诺美kinetexf5色谱柱(2.1mm×100mm，2.7μm)、飞诺美kinetexpolorc18色谱柱(2.1mm×100mm，2.7μm)，各物质保留时间如下表。发现五氟苯基填料的色谱柱能将四种物质分开，色谱柱型号为飞诺美kinetexf5色谱柱(2.1mm×100mm，2.7μm)。保留时间(min)c18f5polorc18氰钴胺2.204.813.77甲钴胺2.345.573.80羟钴胺2.124.013.42腺苷钴胺2.425.033.61b.采用优化选择的色谱柱进行hplc－ms/ms检测色谱条件：飞诺美kinetexf5色谱柱(2.1mm×100mm，2.7μm)；流动相a：含0.1％甲酸的水溶液；流动相b：含0.1％甲酸的甲醇溶液；柱温：40℃；流速：0.4ml/min。梯度洗脱：0～1.0min，1％b，3.0～6.0min，98％b，6.5～9min，1％b。如附图1所示，氰钴胺的保留时间为4.81min，甲钴胺的保留时间为5.57min，羟钴胺的保留时间为4.01min，腺苷钴胺的保留时间为5.03min，四种钴胺素的色谱峰已经分开，各物质不会互相干扰。质谱条件：采用电喷雾esi源正离子方式，离子源温度550℃、正离子电压3500v。维生素b12家族质谱扫描离子对及电压见表1。表1维生素b12家族质谱扫描离子对及电压物质母离子子离子透镜电压碰撞电压氰钴胺678.51474540甲钴胺6731476048羟钴胺6651478038腺苷钴胺790.51478550氰钴胺内标6821544542实施例2对实施例1建立的高效液相串联质谱的方法可行性进行考察：(1)线性关系及检测限、定量限：取氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺标准溶液与牛血清白蛋白(bsa)精确配制成10ng/ml的混合溶液，用bsa倍比稀释一系列不同浓度的标准曲线浓度。提取方法与样本相同，以四种物质与氰钴胺内标峰面积比值为纵坐标，以浓度为横坐标，构建校准曲线，得到回归方程和相关系数。以信噪比(s/n)≥3对应的浓度为检出限，(s/n)≥10对应的浓度作为定量限，得到维生素b12家族各物质的检出限和定量限，结果见表2。表2人血清中测定维生素b12家族含量方法的线性方程、检测限和定量限(2)提取回收率：选择临床样品，将其分为体积相同的3份，每份200μl。在其中1份样本中加入10μl不含待测物的空白试剂(甲醇色谱级或以上)，作为基础样本；而在另2份样本中各加入10μl不同浓度的待测物标准品溶液，加入后样本中的标准液浓度见表3，制成2个不同加入浓度的回收样本。要求加入标准液后低水平样本中的待测物在参考范围中间值附近，而高水平样本中的待测物达到参考范围上限。不同浓度下氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺的提取回收率结果准确、重现性好。表3人血清中测定维生素b12家族含量方法的提取回收率以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12