胱抑素C胶乳增强免疫比浊试剂的制作方法

胱抑素c胶乳增强免疫比浊试剂
技术领域
1.本发明涉及一种胱抑素c胶乳增强免疫比浊试剂，属于医学免疫领域。


背景技术：

2.胱抑素c(cysc)：也称半胱氨酸蛋白酶抑制剂c、γ
‑
微量蛋白或γ
‑
后球蛋白，广泛存在于各种组织的有核细胞和体液中，是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质，分子量为13.3kda，由122个氨基酸残基组成，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。cysc血清浓度与肾功能损害程度高度相关，能够准确反映人体gfr的变化，是评估肾功能的一个重要指标。
3.免疫比浊法是目前检测cysc最主流的方法。在测定过程中，若所用抗原抗体反应速率过快时会导致试剂延展性不好，需要调整反应曲线至试剂兼顾灵敏度及延展性。为达到上述目的，通常单独或配合使用以下三种方法：一是降低抗体使用量，二是调试试剂2的粒子浓度，三是调整试剂在生化仪上计算吸光度差值的读点。但通过上述方法进行的调试通常会影响样本测值(尤其是高浓度范围)，导致试剂整体相关性变差(slope升高或降低，r降低)。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种胱抑素c胶乳增强免疫比浊试剂，通过在乳胶微球上连接一定比例的normal igg，达到在调整反应曲线，保证试剂灵敏度和/或延展性的基础上，还能确保样本测值准确性的目的。
5.为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种胱抑素c胶乳增强免疫比浊试剂，包括试剂1和试剂2，所述试剂1为促进抗原和抗体反应的溶液，试剂2为包被有动物抗人cysc抗体的乳胶微球分散液，其特征在于：所述乳胶微球还包被有对应动物的normal igg，所述normal igg在抗体系统中占比30％
‑
60％，normal igg在抗体系统中占比30％
‑
60％是指normal igg占所有抗体重量的30
‑
60％。
6.优选的，所述normal igg为正常未免疫兔的igg，所述cysc抗体为兔抗人cysc抗体。
7.优选的，所述normal igg为正常未免疫山羊的igg，所述cysc抗体为山羊抗人cysc抗体。
8.优选的，所述试剂2还包括ph7.5的磷酸缓冲液0.1m，防腐剂proclin300 0.01g/l及nacl 0.1g/l。
9.优选的，所述试剂1还包括ph7.5的磷酸缓冲液0.1m，防腐剂proclin300 0.01g/l及nacl 0.1g/l。
10.本发明提供了一种胱抑素c胶乳增强免疫比浊试剂，采用了乳胶微球上包被一定比例的normal igg与特异性抗体共同结合乳胶微球上的结合位点，减慢了特异性抗原抗体的反应速率，达到在调整反应曲线，保证试剂灵敏度和/或延展性的基础上，还能确保样本
测值准确性的目的。另外，不同批次抗体可通过调整与normal igg的比例，在一定程度上解决抗体批间差导致的试剂反应性差异的问题。
附图说明
11.图1为rabbit normal igg占比为0％、40％及60％的试剂与在售试剂的反应性对比。
12.图2为rabbit normal igg占比为40％及60％的试剂与在售试剂的样本相关性。
13.图3为goat normal igg占比为0％、30％及50％的试剂与在售试剂的反应性对比。
14.图4为goat normal igg占比为30％及50％的试剂与在售试剂的样本相关性。
具体实施方式
15.实施例1
16.配制试剂1：试剂1成分如下:
17.磷酸缓冲液0.1m/l 磷酸缓冲液ph 7.5
18.tween20 0.01g/l
19.nacl 0.1g/l
20.proclin3000.01g/l。
21.配制试剂2：使用兔igg系统，即兔抗人cysc多克隆抗体及正常未免疫兔的igg(rabbit normal igg)。
22.(1)溶液制备
23.a.活化缓冲液：100mm/l磷酸缓冲液，ph7.5；
24.b.活化剂：按照10mg/ml的浓度称量edc(1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐),现用现配；
25.c.封闭液：10％(w/v)bsa；
26.d.复溶溶液(即r2缓冲液):磷酸缓冲液0.1m/l ph 7.5，nacl 0.1g/l，proclin3000.01g/l。
27.(2)特异性兔抗人抗cysc多克隆抗体及兔normal igg的包被
28.①
取粒径为150nm的聚苯乙烯乳胶粒子10mg与活化缓冲液a按体积比1:20进行在37℃条件下混合后混匀10分钟；
29.②
向步骤
①
中加入0.5mg的混合抗体(特异性兔抗人抗cysc多克隆抗体及兔normal igg，其中normal igg蛋白占比不同)：配比1的normal igg占比0％(即cysc多克隆抗体0.5mg，normal igg 0.0mg)、配比2占比20％(即cysc多克隆抗体0.4mg，normal igg 0.1mg)、配比3占比40％(即cysc多克隆抗体0.3mg，normal igg 0.2mg)、配比4占比60％(即cysc多克隆抗体0.2mg，normal igg 0.3mg)、配比5占比80％即cysc多克隆抗体0.1mg，normal igg 0.4mg)，37℃条件下混合60分钟；
30.③
向步骤
②
加入100ul的活化剂b,37℃条件下混合60分钟；
31.④
向步骤
③
中加入0.5ml的封闭液c,37℃条件下混合60分钟；
32.⑤
步骤
④
反应完成后，离心并去除上清液。离心条件为转速15000rpm,离心时间为30分钟，温度设定10℃；
33.⑥
去除上清液，并用复溶溶液复溶，重悬乳胶微球，重悬过程可使用细胞破碎仪辅助重悬。试剂2制备完成。
34.检测方法
35.使用全自动生化分析仪东芝40fr来检测cysc。检测条件如下:
36.样本量3ul
37.试剂1量235ul
38.试剂2量50ul
39.主波长540nm
40.副波长700nm
41.在全自动生化分析仪东芝40fr上设置好以上参数，检测在售试剂及不同normal igg占比组(配比1、配比2、配比3、配比4、配比5)的吸光度，结果如表1所示。对比检测15例血清样本的浓度，得到的结果如表2所示。
42.从表1可以看出，随normal igg蛋白占比增加，在校准范围内(0
‑
8mg/l)试剂的反应性降低(0.5mg/l时的dabs降低)、延展性增加(8m/l信号与4mg/l信号的比值越高)，在检测高浓度抗原时(>8mg/l)试剂prozone越好(50mg/l信号与8mg/l信号的比值越高)。与在售试剂相比，normal igg蛋白占比在40
‑
60％时试剂灵敏度及延展性较合适。
43.表1 rabbit normal igg蛋白占比分别为0％，20％，40％，60％，80％时的反应性及延展性对比
[0044][0045]
从表2可以看出：未添加normal igg(0％)时，由于测值范围仅到4mg/l，未进行样本测值确认。
[0046]
添加了normal igg的试剂与在售试剂对比，slope值及r值越接近1，说明样本测值的相关性越好。随normal igg蛋白占比增加，高浓度样本测值越高。normal igg蛋白占比在
40
‑
60％时，无论slope还是r，均与在售试剂相当。
[0047]
表2在售试剂、rabbit normal igg占比分别为20％，40％，60％，80％时的样本测值对比
[0048][0049][0050]
表1结果表明配比3、配比4的灵敏度及延展性较好。与在售试剂反应曲线对比图见图1。
[0051]
表2结果表明配比3、配比4的样本测值与在售试剂最接近，相关性slope 0.90
‑
1.10，r>0.99。与在售试剂的样本相关性图见图2。
[0052]
根据表1和表2综合结果得知，rabbit normal igg蛋白占比40％～60％之间时结果最优。
[0053]
实施例2
[0054]
配制试剂1：试剂1成分如下:
[0055]
磷酸缓冲液0.1m/l 磷酸缓冲液ph 7.5
[0056]
tween20 0.01g/l
[0057]
nacl 0.1g/l
[0058]
proclin3000.01g/l。
[0059]
配制试剂2：使用山羊igg系统，即山羊抗人cysc多克隆抗体及正常未免疫山羊的
igg(goat normal igg)。
[0060]
(1)溶液制备
[0061]
a.活化缓冲液：100mm/l磷酸缓冲液，ph 7.5；
[0062]
b.活化剂：按照10mg/ml的浓度称量edc,现用现配；
[0063]
c.封闭液：10％(w/v)bsa；
[0064]
d.复溶溶液(即r2缓冲液):磷酸缓冲液0.1m/l ph 7.5,nacl 0.1g/l，proclin3000.01g/l。
[0065]
(2)特异性山羊抗人cysc多克隆抗体及山羊normal igg的包被
[0066]
①
取粒径为150nm的聚苯乙烯乳胶粒子10mg与活化缓冲液a按体积比1:10进行在37℃条件下混合后混匀10分钟；
[0067]
②
向步骤
①
中加入0.8mg的混合抗体(特异性山羊抗人抗cysc多克隆抗体及兔normal igg，其中normal igg蛋白占比不同)：配比6的normal igg占比0％(即cysc多克隆抗体0.8mg，normal igg 0.0mg)、配比7占比10％(即cysc多克隆抗体0.72mg，normal igg 0.08mg)、配比8占比30％(即cysc多克隆抗体0.56mg，normal igg 0.24mg)、配比9占比50％(即cysc多克隆抗体0.4mg，normal igg 0.4mg)、配比10占比70％即cysc多克隆抗体0.24mg，normal igg 0.56mg)，42℃条件下混合60分钟；
[0068]
③
向步骤
②
加入120ul的10mg/ml的活化剂b,37℃条件下混合60分钟；
[0069]
④
向步骤
③
中加入0.5ml的10％的msa(封闭液c),37℃条件下混合60分钟；
[0070]
⑤
步骤
④
反应完成后，离心并去除上清液。离心条件为：转速15000rpm,离心时间30分钟，温度设定为10℃；
[0071]
⑥
去除上清液，并用复溶溶液复溶，重悬乳胶微球，重悬过程可使用细胞破碎仪辅助重悬。试剂2制备完成。
[0072]
检测方法
[0073]
使用全自动生化分析仪东芝40fr来检测cysc。检测条件如下:
[0074]
样本量3ul
[0075]
试剂1量235ul
[0076]
试剂2量50ul
[0077]
主波长540nm
[0078]
副波长700nm
[0079]
在全自动生化分析仪东芝40fr上设置好以上参数，检测在售试剂及不同normal igg占比组(配比6、配比7、配比8、配比9、配比10)的吸光度，结果如表3所示。对比检测15例血清样本的浓度，得到的结果如表4所示。
[0080]
从表3可以看出，随normal igg蛋白占比增加，在校准范围内(0
‑
8mg/l)试剂的反应性降低(0.5mg/l时的dabs降低)、延展性增加(8m/l信号与4mg/l信号的比值越高)，在检测高浓度抗原时(>8mg/l)试剂prozone越好(50mg/l信号与8mg/l信号的比值越高)。与在售试剂相比，normal igg蛋白占比在30
‑
50％时试剂灵敏度及延展性较合适。
[0081]
表3 goat normal igg蛋白占比分别为0％，10％，30％，50％，70％时的反应性及延展性对比
[0082][0083][0084]
未添加normal igg(0％)时，由于测值范围仅到4mg/l，表4中未进行配比6的样本测值确认。
[0085]
从表4可以看出，添加了normal igg的试剂与在售试剂对比，slope值及r值越接近1，说明样本测值的相关性越好。随normal igg蛋白占比增加，高浓度样本测值越高。normal igg蛋白占比在30
‑
50％时，无论slope还是r，均与在售试剂相当。
[0086]
表4在售试剂、goat normal igg占比分别为0％，10％，30％，50％，70％时的样本测值对比
[0087][0088][0089]
表3结果表明配比8、配比9的灵敏度及延展性较好。与在售试剂反应曲线对比图见图3。
[0090]
表4结果表明配比8、配比9的样本测值与在售试剂最接近，相关性slope0.90
‑
1.10，r>0.99。与在售试剂的样本相关性图见图4。
[0091]
根据表3和表4综合结果得知，goat normal igg蛋白占比30％～50％之间时结果最优。
[0092]
以上两组组实验结果说明，normal igg蛋白占比在30％～60％时，可在确保试剂灵敏度的基础上，有效改善试剂延展性及样本测值。