载脂蛋白apoa1在宫颈癌对铂类化疗耐药检测中的应用
技术领域：
：1.本发明涉及医药
技术领域：
：，尤其是涉及载脂蛋白apoa1在宫颈癌对铂类化疗耐药检测中的应用。
背景技术：
：：2.宫颈癌是危害全球女性健康的第四位常见恶性肿瘤。据2012年统计据，全球每年宫颈癌新发病例52.8万，新增死亡病例26.6万，我国是新发病例和死亡病例最多的国家，可见宫颈癌严重威胁女性生命。尽管近期hpv疫苗在我国上市，其仅适用于少数特定人群，而且hpv疫苗并不能预防所有型别的高危型hpv感染，意味着不能完全阻断宫颈癌的发生；虽然多年来拥有完善的宫颈癌筛查体系，可以早发现，早治疗。但是基于我国国情，地域辽阔，人口众多，城乡间文化水平仍存在差距，医疗保健知识仍未广泛普及，直至目前近一半宫颈癌患者就诊时已为中晚期，并有年轻化趋势。化疗作为继宫颈癌放疗及手术治疗后第三大治疗手段，在晚期及复发宫颈癌治疗中处于举足轻重的地位，并被美国国家综合癌症网络(nationalcomrehensivecancernetwork，nccn)纳入宫颈癌患者治疗指南。但是，产生化疗耐药的患者，会导致五年生存率明显降低。我们前期研究也发现，对于局部晚期宫颈癌患者，进行紫杉醇联合铂类术前新辅助化疗，有较好的缩小肿瘤效果，为手术创造机会，有效率达90％，但仍有近10％的患者出现化疗耐药，导致新辅助化疗失败，使患者丧失手术机会甚至病情进展。化疗耐药是影响晚期和复发宫颈癌治疗效果关键因素之一。因此，对宫颈癌化疗耐药展开深入的研究迫在眉睫。3.与此同时，目前apoa1与肿瘤化疗耐药研究较少，目前在妇科肿瘤领域中，通过蛋白质组学研究发现，相比癌旁组织样本，apoa1在卵巢癌铂类化疗耐药样本中呈现高表达。吴文娟的研究中，用定量蛋白质组学技术筛选铂类耐药组与铂类敏感组间血清样品中的差异表达蛋白质，有32个蛋白质的表达上调，30个蛋白质表达下调，其中上调蛋白质包括apoa1，表明apoa1与铂类化疗耐药相关。cruz等利用蛋白质组学技术在铂类耐药卵巢癌细胞和组织中发现了189个差异蛋白质，针对蛋白酶体泛素化耐药信号通路寻找相关蛋白质，通过组织样本验证，明确apoa1在铂类化疗耐药相关差异蛋白质中显著性上调表达，可以作为卵巢癌铂类化疗耐药预测标志物。但是目前对于宫颈癌耐药尚无预测靶点及治疗靶点，对于apoa1参与宫颈癌铂类化疗耐药机制尚不明确。4.有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：5.本发明的目的在于提供一种载脂蛋白apoa1的新用途，即载脂蛋白apoa1在宫颈癌对铂类化疗耐药检测中的应用。通过本发明的研究，明确了载脂蛋白apoa1可以作为宫颈癌铂类化疗耐药标志物，能促进细胞增殖，使铂类药物的化疗耐药。6.为解决上述技术问题，本发明提供了载脂蛋白apoa1在宫颈癌对铂类化疗耐药检测中的应用。7.进一步的，载脂蛋白apoa1作为宫颈癌铂类化疗耐药标志物。8.进一步的，所述的检测为通过检测被试者载脂蛋白apoa1的宫颈癌组织免疫组化。结果发现，在铂类化疗耐药的宫颈癌患者中apoa1阳性表达率高于铂类化疗敏感的宫颈癌患者。9.进一步的，载脂蛋白apoa1促进细胞增殖，使铂类药物的化疗耐药。10.进一步的，载脂蛋白apoa1通过stat1调控mapk信号通路来促进细胞增殖，使铂类药物的化疗耐药。11.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：12.本发明提供了一种载脂蛋白apoa1的新用途，具体将载脂蛋白apoa1应用于宫颈癌铂类化疗耐药检测，通过研究明确了载脂蛋白apoa1可以作为宫颈癌铂类化疗耐药标志物，并通过stat1调控mapk信号通路促进细胞增殖导致铂类药物的化疗耐药。附图说明13.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。14.图1为本发明的siha细胞中oe组对应ic50值；15.图2为本发明的siha细胞中nc组对应ic50值；16.图3为本发明的裸鼠移植瘤实图；17.图4为本发明的裸鼠移植瘤的生长曲线；18.图5为本发明的各组裸鼠移植瘤重量的比较；19.图6为本发明的过表达apoa1对caski细胞克隆形成能力的影响；20.图7为过表达apoa1对siha细胞克隆形成能力的影响；具体实施方式21.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。22.实施例123.宫颈鳞癌细胞中筛选铂类化疗耐药差异蛋白：24.宫颈鳞癌siha细胞在铂类化疗药物中培养14天，培养对铂类化疗耐药的siha细胞系，提取蛋白质，通过itraq试剂标记联合lc‑ms/ms鉴定总蛋白数为7139个，选取低分子量范围(1000‑50000da)生物标志筛查结果，通过对卡铂组和mock组差异表达蛋白质进行比较分析，以在样本中表达上调大于1.2倍数或下调小于0.83倍(p<0.05)组织样本蛋白为筛选标准，并结合文献检索相关蛋白质功能，筛选可识别的差异蛋白峰96个。通过go分类和kegg注释辅助筛选出有统计学意义的差异蛋白质卡铂组/mock组85个，上调蛋白70种，表达下调蛋白15种。试验结果见表1：25.表1卡铂组与mock组差异表达蛋白质(15种上调蛋白)[0026][0027][0028]实施例2[0029]过表达apoa1铂类化疗耐药蛋白质验证：[0030]根据国内外文献，以及go和kegg分析结果，选取上调表达的apoa1为目的蛋白质，进行基因过表达。构建过表达apoa1慢病毒(无荧光)，与siha细胞共培养。应用real‑pcr检测过表达apoa1在siha细胞中的表达情况，发现过表达组(overexpression，oe)组apoa1基因表达丰度是nc组的355.459倍。应用cck‑8检测apoa1过表达对化疗药物(卡铂)浓度的影响。卡铂组过表达apoa1后ic50对应浓度为86.31ug/ml高于nc组ic50对应药物浓度为51.88ug/ml(如图1‑2所示)，证明apoa1与siha细胞(鳞癌)铂类耐药相关。[0031]实施例3[0032]apoa1在宫颈癌耐药组织中的表达：[0033]在临床获得局部晚期宫颈鳞癌患者的癌灶组织10例，所有患者在首次手术前均接受cbp联合紫杉醇的nact治疗，以化疗治疗结束21‑28天为时间标准，依据who实体肿瘤疗效评估标准(responseevaluationcriteriainsolidtumors，recist)标准进行化疗效果评估，将患者分为完全缓解(completeresponse，cr)、部分缓解(partialremission，pr)、疾病稳定(stabledisease，sd)、疾病进展(progressivedisease，pd)，其中sd+pd为化疗耐药组，cr为化疗敏感组，每组各5例标本。通过ihc测定apoa1蛋白表达情况。结果显示：化疗耐药组中40％(2/5)的鳞状细胞癌组织中apoa1是高表达的，而化疗敏感组中只有20％(1/5)apoa1呈高表达。化疗耐药组和化疗敏感组的平均染色强度评分均为6±1.67，试验结果见表2：[0034]表2ihc检测宫颈癌组织apoa1的表达[0035][0036]实施例4[0037]裸鼠动物中证明apoa1与宫颈癌铂类化疗耐药相关：[0038]选择siha细胞进行裸鼠成瘤实验，进行化疗，实验分组为nc组、oe组、nc+cbp组、oe+cbp组。将过表达apoa1的siha细胞接种于裸鼠皮下，当瘤体直径大7mm时给予铂类(cbp)化疗，每3天测量一次移植瘤长短径，计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。实验结束时裸鼠移植瘤的实图见如图3所示，cbp干预14天后，与nc组相比，oe组肿瘤体积明显缩小，差异有统计学意义(p<0.01)，表明过表达apoa1可抑制肿瘤生长；与nc组相比，nc+cbp组肿瘤体积明显缩小，差异有统计学意义(p<0.05)，表明cbp化疗可抑制肿瘤生长；而oe组、oe+cbp组两组间肿瘤体积差异无统计学意义(p＞0.05)，表明过表达apoa1后，siha细胞对cbp化疗敏感性降低(如图3‑4所示)。[0039]给予cbp化疗14天后剥离裸鼠皮下移植瘤进行称重，结果显示：与nc组相比，oe组肿瘤重量明显缩小，差异有统计学意义(p<0.01)，表明过表达apoa1可抑制肿瘤生长；与nc组相比，nc+cbp组肿瘤重量明显缩小，差异有统计学意义(p<0.01)，表明cbp化疗可抑制肿瘤生长；而oe组、oe+cbp组两组间肿瘤体重差异无统计学意义(p＞0.05)，表明过表达apoa1后，siha细胞对cbp化疗的敏感性降低(如图5所示)。[0040]实施例5[0041]过表达apoa1在宫颈癌siha细胞影响铂类化疗耐药的机制：[0042]在c‑33a、caski和siha宫颈鳞癌细胞株进行细胞功能试验，[0043](1)细胞克隆实验[0044]使用平板克隆实验观察过表达apoa1在c‑33a、caski和siha细胞中检测克隆形成能力，将细胞培养12天后计数细胞克隆数目。结果显示：在caski和siha细胞中，相比nc+cbp组，oe+cbp组细胞克隆数明显增加，差异有统计学意义。而在c‑33a中克隆数无明显增加(如图6‑7所示，其中，(a)nc组；(b)nc+cbp；(c)oe；(d)oe+cbp(p<0.05))。[0045](2)细胞增殖、细胞凋亡及细胞转移实验[0046]探究过表达apoa1对宫颈癌细胞增殖的影响，将c‑33a、caski和siha细胞在卡铂中培养48小时，nc组和oe组分别培养1天、2天、3天、4天和5天，进行mtt检测，与nc+cbp相比，oe+cbp组细胞增殖无明显变化。[0047]探究过表达apoa1在c‑33a、caski和siha细胞对cbp化疗细胞凋亡的影响，将nc组、oe组细胞经cbp处理48小时后，经tunel方法进行凋亡检测，结果显示：nc组、oe组细胞凋亡差异均无统计学意义(p＞0.05)。[0048]探究过表达apoa1在c‑33a、caski和siha细胞对cbp化疗细胞迁移的影响，将nc组、oe组细胞经cbp处理48小时后，经transwell方法进行细胞迁移检测，结果显示：nc组、oe组细胞细胞迁移差异均无统计学意义(p＞0.05)。[0049]实施例6[0050]蛋白质多肽质谱技术(tmt)检测过表达apoa1下游差异蛋白质，并进行prm验证：[0051]过表达apoa1进行tmt标记，通过go和kegg生物信息分析，寻找过表达apoa1的下游差异表达蛋白，并通过ipa关联词分析(化疗耐药，肿瘤转移，复发，信号通路)，prm鉴定寻找到29个下游差异表达蛋白，且差异有统计学意义(p<0.05)试验，试验结果见表3。结合文献报道，apoa1通过调控下游stat1参与mapk信号通路增强对铂类化疗耐药。[0052]表3prm验证tmt筛选出来的apoa1下游蛋白质[0053][0054][0055]最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3