一种用于母猪早期妊娠诊断的蛋白生物标志物及其用于母猪早期妊娠诊断方法

1.本发明属于生物技术诊断领域，具体涉及一种用于母猪早期妊娠诊断的蛋白生物标志物及其用于母猪早期妊娠诊断方法。


背景技术：

2.随着我国国民经济的快速发展以及越来越严格的环保要求，养猪方式迅速由散养向集约化转变。由于对优良品种的需求增加，繁殖已成为养猪业中最重要的一环。母猪配种后，及时且准确的妊娠诊断是母猪繁殖效率最大化的关键一环。母猪早期妊娠诊断可以确认配种后母猪的妊娠状态，对于已经妊娠的母猪及时采取保胎措施和相应的孕期管理，对于未妊娠的母猪及时采取复配措施、缩短其空怀期，对于屡配不孕的母猪则要及时淘汰。早期妊娠诊断可以降低母猪非生产天数降低饲养成本、提高母猪使用效率、提高母猪年生产力。
3.传统的妊娠诊断方法如试情法、外部观察法、超声波诊断法、阴道检查法等，有着各自的缺陷，诊断时间天数较长、症状诊断不明确、受使用者的经验程度影响等，误诊、漏诊均有不同程度的存在。鉴于传统妊娠诊断方法存在的缺陷，我们急需找到一种更为精准简便的早期妊娠诊断方法应用于生产管理。
4.因此，本申请提出了一种用于母猪早期妊娠诊断的蛋白生物标志物及其用于母猪早期妊娠诊断方法。


技术实现要素：

5.本发明提出了一种快捷高效诊断母猪早期妊娠诊断的蛋白生物标志物及母猪早期妊娠诊断方法。
6.蛋白质作为基因表达的最终产物，直接反映了机体生命的复杂和多变性。对蛋白质进行分析，才能更好地解释细胞活动或其行使功能的过程。生物标志物是指可以明确标识系统、器官等结构或功能的改变的生化指标，如dna、rna、蛋白质等都可以作为生物标志物用于研究。现代生物标志物的研发一般分为三个阶段：发现阶段、验证阶段和确认阶段。在发现阶段蛋白质组学的技术方法已经在生物标志物的发现和诊断中得到广泛应用。目前较为主流的一种基于串联质谱方法的蛋白质定量技术——itraq(isobaric tag for relative and absolute quantitation)，该技术通过对蛋白质酶解后肽段进行标记，利用串联质谱方法，对肽段进行精确鉴定和定量。目前关于母猪早期妊娠蛋白的研究较少，仍然缺乏准确可靠的蛋白生物标志物用于母猪早期妊娠诊断，急需开发一些具有早期诊断价值的母猪早期妊娠诊断蛋白生物标志物。理想的蛋白生物标志物需在母猪妊娠早期就能特异且灵敏的从外周血液中检出。目前，尚未公开用于母猪早期妊娠诊断的蛋白生物标志物。
7.本发明的目的之一在于提供一种用于母猪早期妊娠诊断的蛋白生物标志物。
8.本发明的目的之二在于通过检测该种蛋白生物标志物在母猪早期妊娠阶段的表
达水平，可以判断母猪是否妊娠，从而为母猪早期妊娠诊断提供一种新的方法。
9.本发明的目的之三在于提供一种母猪早期妊娠诊断方法。
10.本发明技术方案如下：
11.本发明提供一种用于母猪早期妊娠诊断的蛋白生物标志物，所述蛋白生物标志物为：flnc，其序列号为<210>1；adipoq，其序列号为<210>2；hp，其序列号为<210>3；terf2，其序列号为<210>4，上述蛋白生物标志物应用于母猪早期妊娠诊断。
12.一种母猪早期妊娠诊断方法，在母猪配种15天后采集外周血样，采用elisa酶联免疫吸附反应技术检测血液中flnc、adipoq、hp及terf2蛋白的表达水平，若检测显著低表达，则该母猪应当及时进行下一次人工授精配种，以达到缩短胎次间隔，进而有效降低母猪非生产天数，提高养猪企业的经济效益。
13.通过以下步骤实现：
14.①
、采集血样：采集配种后15天的母猪外周血；
15.②
、血样处理：对
①
步骤的血样进行分离血清或血浆处理：
16.③
、试剂盒检测：选用elisa试剂盒对
②
步骤处理后的血样进行检测，检测flnc蛋白、adipoq蛋白、hp蛋白及terf2蛋白的含量
17.所述elisa试剂盒是如下的一种：端粒重复结合因子2(terf2)的elisa试剂盒、结合珠蛋白(hp)的elisa试剂盒、脂联素(adipoq)的elisa试剂盒和细丝蛋白c(flnc)的elisa试剂盒。
18.即端粒重复结合因子2(terf2)的elisa试剂盒用于检测terf2蛋白；
19.结合珠蛋白(hp)的elisa试剂盒用于检测hp蛋白；
20.脂联素(adipoq)的elisa试剂盒用于检测adipoq蛋白；
21.细丝蛋白c(flnc)的elisa试剂盒用于检测flnc蛋白。
22.收集配种后15天母猪外周血液样本，在配种后25天进行b超妊娠诊断，35天妊娠复检，以区分妊娠组与未妊娠母猪组。分离蛋白，采用itraq技术结合系统的生物信息学分析方法，筛选在妊娠早期差异表达的蛋白，最终获得了4个与母猪早期妊娠密切相关的外周血液中的蛋白质，即flnc、adipoq、hp及terf2，在配种后15天妊娠与非妊娠母猪外周血液样本中表达量均存在显著差异并通过elisa验证，最终证明本发明提供的差异表达蛋白即flnc、adipoq、hp及terf2与母猪早期妊娠高度相关，能够作为快速进行母猪早期妊娠诊断的生物标志物，该种蛋白生物标志物具有良好的诊断指标的特性。
23.所述flnc、adipoq、hp及terf2蛋白在配种后15天妊娠组母猪外周血液中表达量显著高于非妊娠组，进而flnc、adipoq、hp及terf2蛋白能够作为母猪早期妊娠的蛋白生物标志物用于母猪早期妊娠诊断。
24.本发明原理：flnc、adipoq、hp及terf2蛋白在妊娠早期母猪外周血液中相对于配种未妊娠母猪表达量显著升高，所以本发明重点分析了早期妊娠母猪外周血液中flnc、adipoq、hp及terf2蛋白的表达情况，首次发现flnc、adipoq、hp及terf2蛋白可以单独使用或者联合使用作为快速诊断母猪早期妊娠蛋白分子标志物，并进行应用。
25.本发明获得的有益效果：
26.本发明针对母猪早期妊娠诊断，筛选蛋白质分子，通过收集15天配种后妊娠与未妊娠母猪外周血液样本，从而对妊娠与未妊娠母猪样本中差异表达的蛋白质进行筛选和检
测，获得4个在妊娠与未妊娠差异显著且妊娠15天后显著升高的蛋白质，最终得到与母猪早期妊娠相关的差异表达蛋白，即：flnc、adipoq、hp及terf2蛋白，从而证明4个蛋白质可以用于母猪早期妊娠诊断。
27.本发明提供蛋白生物标志物flnc、adipoq、hp及terf2中的一种在母猪早期妊娠诊断中的应用，在母猪配种15天采集外周血液，采用elisa酶联免疫吸附反应技术检测血液中flnc、adipoq、hp及terf2蛋白的表达水平，若检测结果显著低表达，则该母猪应当及时进行下一次人工授精配种，以达到缩短胎次间隔，进而有效降低母猪非生产天数，提高养猪企业的经济效益。
28.本发明公开的4个蛋白生物标志物中，flnc在配种15天妊娠母猪与未妊娠母猪对照组中表达量差异显著；adipoq在配种15天妊娠母猪与未妊娠母猪对照组中表达量差异显著，hp在配种15天妊娠母猪与未妊娠母猪对照组中表达量差异显著，terf2在配种15天妊娠母猪与未妊娠母猪对照组中表达量差异显著。
29.本发明公开的4个蛋白生物标志物中，flnc在配种15天妊娠母猪与未妊娠母猪的roc曲线下面积(auc)为0.882，并且呈现出0.019水平的显著性(p＝0.019＜0.05)；adipoq在配种15天妊娠母猪与未妊娠母猪的roc曲线下面积(auc)为0.985，并且呈现出0.0031水平的显著性(p＝0.0031<0.05)；hp在配种15天妊娠母猪与未妊娠母猪的roc曲线下面积(auc)为0.941，并且呈现出0.007水平的显著性(p＝0.007<0.05)；terf2在配种15天妊娠母猪与未妊娠母猪的roc曲线下面积(auc)为1.000，并且呈现出0.0023水平的显著性(p＝0.0023<0.05)，flnc
‑
adipoq联合在配种15天妊娠母猪与未妊娠母猪的roc曲线下面积(auc)为1.000，并且呈现出0.002水平的显著性(p＝0.002＜0.05)；
30.adipoq
‑
hp联合在配种15天妊娠母猪与未妊娠母猪的roc曲线下面积(auc)为1.000，并且呈现出0.002水平的显著性(p＝0.002＜0.05)。
31.同时检测两种蛋白的含量，通过检测结果进行联合分析，可以得出准确率是100％的诊断结果。联合分析采用二元逻辑回归，属于常规的数据分析方法。
32.这意味着4个蛋白生物标志物均可单独或联合用于母猪早期妊娠诊断，且具有较高的早期妊娠诊断价值。
33.本发明为母猪早期妊娠诊断提供了新的蛋白生物标志物flnc、adipoq、hp及terf2，为母猪早期妊娠诊断提供了新的方向。
34.本发明在母猪配种后15天进行检测判断是否成功配种，而现有方法需要在23天或者25天的时候才能有80％的准确度判断是否成功配种，本方法诊断时间显著提前到未妊娠母猪再次发情之前。相对于集约化养殖场来说能够大幅降低生产成本，提高生产效益。对空怀母猪采取淘汰或重配措施是很有必要的，尽早进行早期妊娠诊断就能够尽早发现空怀母猪，及时进行下一次人工授精配种，以达到缩短胎次间隔，进而有效降低母猪非生产天数，提高养猪企业的经济效益。
附图说明
35.图1为差异蛋白在配种后15天妊娠与未妊娠母猪外周血液中表达水平差异图。
36.图2为itraq检测的差异蛋白表达的elisa验证图。
37.图3为flnc蛋白在配种后15天血液中表达情况的roc曲线分析。
38.图4为adipoq蛋白在配种后15天血液中表达情况的roc曲线分析。
39.图5为hp蛋白在配种后15天血液中表达情况的roc曲线分析。
40.图6为terf2蛋白在配种后15天血液中表达情况的roc曲线分析。
41.图7为flnc
‑
adipoq蛋白在配种15天血液中表达情况的roc曲线分析。
42.图8为adipoq
‑
hp蛋白在配种15天血液中表达情况的roc曲线分析。
具体实施方式
43.本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
44.本发明中，为了便于描述，各部件的相对位置关系的描述均是根据说明书附图1的布图方式来进行描述的，如：前、后、上、下、左、右等的位置关系是依据说明书附图的布图方向来确定的。
45.下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述：
46.下面详细说明本发明的优选实施方式。
47.实施例1：itraq技术筛选配种后第15天妊娠与非妊娠母猪外周血液中差异蛋白
48.本实施例采集了配种后第15天妊娠与非妊娠的母猪血液，分离蛋白，采用itraq技术及生物信息学方法分析筛选在妊娠早期差异表达的蛋白，具体步骤如下：
49.1.试验样本
50.选取正常长大二元母猪8头随机分为对照组和试验组。按照常规生产流程查情配种，试验组母猪输入正常的精液，对照组母猪输入死精(正常精液高温煮沸，并在显微镜下观察确保精子死亡)。在配种后第15天采集妊娠母猪和对照组母猪血液，分离血浆，立即置于干冰中冷冻保存，并尽快运回实验室并置于超低温冰箱保存备用。
51.2.总蛋白提取和定量
52.从超低温冰箱(
‑
80℃)取出血浆样品，分别加入4倍体积裂解缓冲液(8m尿素，1％蛋白酶抑制剂，3μm tsa，50mm nam和2mm edta)，利用超声进行裂解。然后4℃，12000g离心10min，去除细胞碎片，将上清液转移至新的离心管，利用bradford蛋白质检测试剂盒进行蛋白浓度测定。
53.3.去高丰度蛋白及sds
‑
page电泳
54.为了分离和鉴定提取的血浆总蛋白，使用blue白蛋白及igg去除试剂盒(sigma
‑
aldrich)去除高峰度蛋白，然后，每个样品取30μg，以5:1(v/v)加入5x上样buffer，混匀后沸水煮10min使蛋白变性，12,000rpm离心5min后取上清液30μl，在4％浓缩胶和12％的分离胶中分别用80v和120v电压电泳，凝胶用考马斯亮兰染色液室温染色1h，用脱色液在摇床上脱色至背景清晰后拍照。
55.4.itraq定量蛋白组测序筛选差异蛋白
56.(1)胰蛋白酶酶切
57.样品各取100μg蛋白加入10mm dtt在37℃还原60分钟，25mm碘乙酰胺(iam)暗处室温反应30分钟。使用胰蛋白酶进行二步法酶切，第一次酶切37℃反应过夜(蛋白质与胰酶的质量比为50:1)，第二次酶切37℃反应4小时(蛋白质与胰酶的质量比为100:1)。
58.(2)肽段同位素标记
59.胰蛋白酶酶解完成后，使用strata x spe柱子脱盐，真空干燥。肽段溶解在20μl 500mm teab中，使用8
‑
plex itraq试剂进行标记。每管itraq试剂用50μl异丙醇溶解并全部加入溶解后肽段样品中，在室温下反应2小时，真空干燥。
60.(3)hplc分馏
61.干燥的标记后肽段用hplc溶液a(2％acn，98％h2o，ph 10)溶解。用waters bridge peptide beh c18(3.5μm，4.6*250mm)高ph反相hplc进行分馏。使用2％to98％乙腈ph 10进行肽段分离，流速为0.5ml/min，时长100分钟，收集馏分48管。之后馏分合成15管进行真空离心干燥。肽段样品根据操作手册用ziptip c18脱盐。样品于
–
20℃保存，直至质谱上机。
62.(4)lc
‑
ms/ms分析
63.使用质谱仪为proxeon easy
‑
nlc 1000coupled to thermo fisher q exactive。将分馏样品溶解在溶液a(0.1％fa，2％acn)中，100％溶液a以5μl/min 100％平衡预处理柱(acclaim100c18，3μm，75μm
×
2cm)和分析柱(acclaimrslc c18，2μm，50μm
×
15cm)。洗脱梯度为0
‑
5min，0％b
‑
8％b；5
‑
40min，8％b
‑
25％b；40
‑
50min，25％b
‑
100％b；50
‑
58min，100％b；恒定流速300nl/min在easy
‑
nlc 1000系统中。洗脱液在2.2kv nsi源喷出，进入q exactive串联质谱分析。谱图采集为数据依赖型，自动转换一级质谱和二级质谱。全扫描质谱(质荷比为300
‑
1800)分辨率设置为70000。取离子强度前15的母离子进入c
‑
trap进行hcd碎裂，碎裂能为32％，动态排除时间为10秒。
64.(5)数据分析
65.采集的二级谱图通过uniprot数据库下载猪蛋白质组数据库(物种编号：9823，包含40706蛋白质序列，蛋白质组编号：up000008227)使用软件proteome discoverer(版本1.3，thermo scientific)进行搜库。设置胰蛋白酶为消化酶，允许2个漏切位点。半胱氨酸碘乙酰化，itraq(肽段n
‑
末端，赖氨酸，酪氨酸)为固定修饰，甲硫氨酸氧化和氨基端乙酰化为可变修饰。搜索设置了肽段容差20ppm，产生的子离子容为0.05da，容错率(fdr)为1％。
66.(6)生物信息学分析方法
67.①
功能注释分析：蛋白在gene ontology(go)可进行3个方面分类注释：生化过程，细胞定位，分子功能。go的注释信息主要来自于uniprot
‑
goa数据库(http://www.ebi.ac.uk/goa/)。kyoto encyclopedia of genes and genomes(kegg)数据库用来分析蛋白通路。首先使用kegg在线工具kaas进行kegg数据库的蛋白质功能注释，然后使用kegg的在线工具kegg mapper绘制注释蛋白的代谢通路。
68.②
功能富集：利用双尾fisher检验对鉴定的go和kegg通路以及结构域富集的差异蛋白检测。用fdr和p<0.05的多重假设检验校正。
69.③
差异蛋白的富集分析和富集聚类：富集分析和富集聚类被用来探索不同蛋白质在参与的通路(比如kegg通路)中潜在关系。我们首先通过分析所有蛋白质的p值对蛋白质功能富集，然后过滤掉低富集度的蛋白质。过滤的p值矩阵用x＝
‑
log10(p
‑
value)表示，再由x值对每个功能类别做z变换，z值用于单方聚类分析(欧几里得距离，平均距离聚类)。用r语言中pheatmap包对差异蛋白进行聚类分析。
70.5.差异蛋白互作网络分析
71.将差异蛋白用string(https://string
‑
db.org/cgi/input.pl)在线软件进行互
作网络分析，string(search tool for the retrieval of interacting genes/proteins)是一个专门研究、收集针对己知者预测蛋白相互作用的数据库。将猪的蛋白质比对到string数据库中对应物种的蛋白上，获得表达该蛋白的基因登录号进行string分析。
72.6.检测结果
73.利用t检验分析妊妊娠与未妊娠两组样本间蛋白表达的差异，筛选条件为显著性检验值p<0.05和两组样本定量比值fc>1.20或fc<0.83。在本次测序结果中，通过go和kegg富集分析，以及差异蛋白互作网络分析，共筛选到与胚胎附植相关的差异蛋白4个，分别是flnc、adipoq、hp和terf2。
74.本实施例通过收集配种后15天妊娠与未妊娠母猪外周血液样本，从而对妊娠与未妊娠母猪外周血液样本中差异表达的蛋白进行筛选和检测，共获得4个妊娠早期与胚胎附植相关的差异表达蛋白——flnc、adipoq、hp和terf2。
75.7.elisa对4个差异蛋白表达情况的验证
76.为进一步验证itraq检测的蛋白表达结果，我们使用elisa技术对上述样本中4个差异表达蛋白的表达情况进行验证。
77.端粒重复结合因子2(terf2)、结合珠蛋白(hp)、脂联素(adipoq)和细丝蛋白c(flnc)的elisa试剂盒购于上海恒远生物科技有限公司。elisa酶联免疫吸附剂测定试验按照试剂盒说明书进行操作，具体操作流程如下：
78.(1)标准品的稀释：试剂盒提供原倍标准品一只，按照下表在小试管中进行稀释。
79.4000ng/l5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液2000ng/l4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液1000ng/l3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液500ng/l2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液250ng/l1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液
80.(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上标准孔准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
81.(3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
82.(4)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
83.(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
84.(6)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
85.(7)温育：操作同(3)。
86.(8)洗涤：操作同(5)。
87.(9)显色：每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
88.(10)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
89.(11)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
90.(12)elisa结果及数据分析
91.以标准物的浓度为横坐标，od值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。根据样品的od值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与od值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的od值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
92.使用spss 21.0软件分析妊娠与非妊娠组中差异蛋白表达量。数据表示为平均值+标准误，并且通过t检验或方差分析测试样品之间的差异。p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异极显著。
93.如图1、图2所示，结果表明4个差异蛋白在配种后15天妊娠与未妊娠母猪外周血液中的表达与itraq检测结果一致。
94.实施例2：elisa在配种后15天妊娠与未妊娠外周血液中差异蛋白表达情况的大群验证
95.为进一步验证itraq检测的蛋白表达结果，我们使用elisa技术对以上4个蛋白的表达情况进行了大群验证。
96.端粒重复结合因子2(terf2)、结合珠蛋白(hp)、脂联素(adipoq)和细丝蛋白c(flnc)的elisa试剂盒购于上海恒远生物科技有限公司。
97.1.样本信息采集
98.在配种后第15天采集母猪血液样本21例，分离血浆，立即置于干冰中冷冻保存，并尽快运回实验室并置于超低温冰箱保存备用。
99.2.样本信息确认
100.血液样本采集后，在配种后第25天时对所有配种母猪进行b超孕检，随后在配种后第35天时对所有配种母猪再次进行b超复检，确定所有配种母猪的妊娠状态，分为妊娠与非妊娠组，对所有样品均进行试验检测。21例样本b超孕检诊断结果为为妊娠17例，未妊娠4例。
101.3.elisa酶联免疫吸附剂测定试验按照试剂盒说明书进行操作，具体操作流程如下：
102.(1)标准品的稀释：试剂盒提供原倍标准品一只，按照下表在小试管中进行稀释。
103.4000ng/l5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液2000ng/l4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液1000ng/l3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液500ng/l2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液250ng/l1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液
104.(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上标准孔准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
105.(3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
106.(4)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
107.(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如
此重复5次，拍干。
108.(6)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
109.(7)温育：操作同(3)。
110.(8)洗涤：操作同(5)。
111.(9)显色：每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
112.(10)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
113.(11)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
114.4.elisa结果及数据分析
115.以标准物的浓度为横坐标，od值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。根据样品的od值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与od值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的od值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
116.5.4种蛋白生物标志物的roc曲线及曲线下面积auc数据分析
117.roc曲线是以1
‑
特异性即误报率为x轴，以特异性(敏感度)作为y轴而建立的折线图。本领域中，roc曲线以下的面积值代表着预测的准确率情况，我们称其为auc值。显然，auc值越大，以为着预测准确率越高，反之则说明预测准确率越低。auc值介于0到1之间，关于auc值的判断说明如下：
118.auc＜0.5：不符合实际情况，预测诊断比随机性猜测差，实际情况中不应该出现；
119.auc＝0.5：说明完全无预测诊断价值，预测准确率和猜测效果一样；
120.0.5＜auc＜0.7：预测诊断价值很低，此种情况相对较常见；
121.0.7≤auc＜0.9：具有一定的预测诊断价值，对于实际诊断有较大的实用性；
122.auc≥0.9：说明预测诊断价值高，此种情况较好；
123.auc＝1，是完美预测没有瑕疵，绝大多数情况下，不存在完美的预测诊断。
124.根据elisa试验结果，分别进行roc曲线分析，并计算其auc面积及置信度，如图3至图6，表1。
125.表1roc曲线结果汇总
126.蛋白名auc标准误p值95％ciflnc0.8820.0880.0200.710adipoq0.9850.0230.0030.941hp0.9410.0530.0070.836flnc
‑
adipoq1.0000.0000.0021.000adipoq
‑
hp1.0000.0000.0021.000
127.从上表可知，针对表达时期和蛋白对应的妊娠结局构造roc曲线，用于判断它们对于妊娠结局的诊断价值，根据以上结果，我们以auc值＞0.8且p值＜0.05作为阈值来筛选可以作为生物标志物的蛋白及其表达时期：
128.flnc对应的auc值为0.882，并且呈现出0.020水平的显著性(p＝0.020<0.05)意味着flnc对于妊娠的诊断价值非常高；
129.adipoq对应的auc值为0.985，并且呈现出0.003水平的显著性(p＝0.003<0.05)意味着adipoq对于妊娠的诊断价值非常高；
130.hp对应的auc值为0.941，并且呈现出0.007水平的显著性(p＝0.007<0.05)意味着hp对于妊娠的诊断价值非常高；
131.terf2对应的auc值为1.000，并且呈现出0.002水平的显著性(p＝0.002<0.05)意味着terf2对于妊娠的诊断价值非常高；
132.flnc
‑
adipoq对应的auc值为1.000，并且呈现出0.002水平的显著性(p＝0.002＜0.05)意味着flnc
‑
adipoq对于妊娠的诊断价值非常高；
133.adipoq
‑
hp对应的auc值为1.000，并且呈现出0.002水平的显著性(p＝0.002＜0.05)意味着adipoq
‑
hp对于妊娠的诊断价值同样非常高。
134.根据上述结果，对4个蛋白生物标志物诊断与b超诊断结果进一步分析如下：
135.表2四种蛋白生物标志物诊断结果与b超诊断结果
[0136][0137]
注释：flnc、adipoq、hp及terf2均为上调蛋白，大于最佳阈值判断为妊娠，小于最佳阈值判断为未妊娠。
[0138]
表3四种蛋白生物标志物诊断结果分析
[0139] flncadipoqhpterf2flnc
‑
adipoqadipoq
‑
hp真阳性(％)88.294.182.4100100100假阳性(％)2500000真阴性(％)75100100100100100假阴性(％)11.85.917.6000准确率(％)85.7195.2485.71100100100
[0140]
由表中可以看出flnc、adipoq、hp及、terf2、flnc
‑
adipoq及adipoq
‑
hp的真阳性率
(妊娠母猪诊断为妊娠状态)有较高的准确性，分别为88.2％、94.1％、82.4％、100％、100％和100％；adipoq、hp及terf2在判断假阳性率(未妊娠母猪诊断为妊娠状态)为0；flnc为25％。真阴性率(未妊娠母猪诊断为妊娠状态)adipoq、hp及terf2均达到100％，flnc为75％。而假阴性率(未妊娠母猪诊断为妊娠状态)terf2为0；adipoq为5.9％；flnc为11.8％；hp为17.6％。flnc、adipoq、hp、terf2、flnc
‑
adipoq及adipoq
‑
hp在诊断母猪妊娠状态的准确率分别为85.71％、95.24％、85.71％、100％、100％和100％。
[0141]
综上所述，本发明提供的配种后15天妊娠与未妊娠母猪外周血液中差异flnc蛋白、adipoq、hp、terf2、flnc
‑
adipoq联合及adipoq
‑
hp联合适合作为猪早期妊娠诊断生物标志物，且准确性与特异性较好。
[0142]
实施例3：蛋白生物标志物在母猪早期妊娠诊断中的应用
[0143]
本实施例提供了一种蛋白生物标志物在母猪早期妊娠诊断中的应用。通过检测蛋白生物标志物的表达水平，判断母猪是否妊娠，本例以elisa酶联吸附反应为例进行早期妊娠诊断，elisa试剂盒购于上海恒远生物科技有限公司。
[0144]
1.血液样本的类型和采集
[0145]
血清：将收集与血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000
×
g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于
‑
20℃或
‑
80℃保存，但应避免反复冻融。
[0146]
血浆：用edta或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内与2
‑
8℃1000
×
g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于
‑
20℃或
‑
80℃保存，但应避免反复冻融。
[0147]
2.elisa酶联免疫吸附剂测定试验按照试剂盒说明书进行操作，具体操作流程如下：
[0148]
(1)标准品的稀释：试剂盒提供原倍标准品一只，按照下表在小试管中进行稀释。
[0149]
4000ng/l5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液2000ng/l4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液1000ng/l3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液500ng/l2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液250ng/l1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液
[0150]
(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上标准孔准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
[0151]
(3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
[0152]
(4)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
[0153]
(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
[0154]
(6)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
[0155]
(7)温育：操作同(3)。
[0156]
(8)洗涤：操作同(5)。
[0157]
(9)显色：每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光
显色10分钟。
[0158]
(10)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
[0159]
(11)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
[0160]
3.结果计算：
[0161]
以标准物的浓度为横坐标，od值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的od值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与od值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的od值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
[0162]
4.根据蛋白浓度进行妊娠诊断
[0163]
flnc蛋白诊断最佳阈值点蛋白浓度为148.103ng/ml；adipoq蛋白诊断最佳阈值点蛋白浓度为31.323ng/ml；hp蛋白诊断最佳阈值点蛋白浓度为82.832ng/ml；terf2蛋白诊断最佳阈值点蛋白浓度为4.912ng/ml。
[0164]
flnc、adipoq、hp及terf2均为上调蛋白，大于最佳阈值判断为妊娠，小于最佳阈值判断为未妊娠。
[0165]
优选的，本实施例提供flnc、adipoq、hp及terf2蛋白生物标志物中的任意一种在母猪早期妊娠诊断中的应用，在母猪配种15天后采集外周血样，采用elisa酶联免疫吸附反应技术检测血液中flnc、adipoq、hp及terf2蛋白的表达水平，若能检测显著低表达，则该母猪应当及时进行下一次人工授精配种，以达到缩短胎次间隔，进而有效降低母猪非生产天数，提高养猪企业的经济效益。
[0166]
综上所述，flnc、adipoq、hp及terf2蛋白在母猪外周血液中，采用elisa方法在妊娠15天与未妊娠母猪外周血液样本中进一步验证得出，flnc、adipoq、hp及terf2蛋白在妊娠15天与未妊娠母猪外周血液中存在显著差异，因此将flnc、adipoq、hp及terf2蛋白中的任意一种应用到快速诊断母猪早期妊娠诊断技术领域时，可以作为诊断母猪早期妊娠的蛋白分子标志物，该种蛋白分子标志物具有良好的诊断指标的特性，与现有的激素测定和超声波诊断等方法相比，本申请具有较好的特异性和灵敏性，能在配种后15天诊断确定母猪是否妊娠。
[0167]
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经对本发明作了详尽的描述，但其不得解释为对本发明自身的限制。在本发明的基础上，可对其在形式上和细节上作出一些修改或改进。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0168]
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变化和改进，这些都属于本发明的保护范围。