RPS9蛋白在食蟹猴超数排卵良好应答预测中的应用

rps9蛋白在食蟹猴超数排卵良好应答预测中的应用
技术领域
1.本发明涉及超数排卵技术领域，更具体地，涉及rps9蛋白在食蟹猴超数排卵良好应答预测中的应用。


背景技术：

2.超数排卵是指利用外源性激素刺激雌性动物的卵巢，促使卵巢内的多个卵泡同时生长发育，最终获得多个成熟卵母细胞的技术。食蟹猴在自然月经周期中仅有一个优势卵泡发育成熟和排卵。如果在月经期中使用超数排卵技术，则可以将每次排卵的卵母细胞数量由原来的1个增加至10～20个甚至更多。成熟的卵母细胞是用于开展人类疾病，基因工程以及胚胎工程研究的重要材料。但是，通过自然周期获取符合要求的卵母细胞数量极少，远不能满足实验需求，并且所需要的周期过长。超数排卵可以充分发掘母畜的生殖潜能，可以使卵巢中大量卵母细胞得到生长发育并成熟。因此，通过超数排卵技术来获取大量成熟的卵母细胞是有效可行的途径。
3.在不同的超排方案中，虽然都得到了多于正常自然周期的成熟卵母细胞，但是不同动物获取卵母细胞的数量上存在较大的差异。相对来说，体重大于5kg的肥胖食蟹猴以及体重小于3kg的食蟹猴超排效果均不太理想，体重在3～5kg的食蟹猴超数排卵中成熟卵母细胞的数量较多。在重复超排中，若猕猴在第一次超数排卵时，卵巢应答较差，则在后续的超数排卵中，其超排效果不理想。若选用上一次超数排卵时卵巢应答较好的猕猴进行重复超排，则在下一次超排中获得的卵母细胞数量及质量较为理想。此外，具有季节性繁殖的猕猴，若在非生殖季节进行超数排卵获得成熟卵母细胞的数量明显低于在生殖季节进行超数排卵获得的成熟卵母细胞数量。此外，月经周期紊乱，腹泻以及卵巢上有未退化的黄体也会导致超数排卵的效果不理想。
4.核糖体蛋白s9(rps9)基因编码核糖体蛋白，该蛋白是40s亚基的一个组成部分，同时也是组装30s核糖体蛋白复合物必不可少的核糖体蛋白。该蛋白质属于核糖体蛋白的s4p家族它位于细胞质中，参与核糖体的产生。在牛泌乳周期中，与发情周期中卵巢的变化相比乳腺的特征是细胞和分子的变化。rps9在牛乳腺中稳定表达，并作为合适的参考基因。牛卵巢在其不同的位置包含大量异质细胞群体，这些细胞群体在形态和分子水平上受发情周期和妊娠的影响。h3f3b和rps9作为健康牛卵巢标准化的最佳参考基因。目前关于rps9蛋白与超数排卵之间的研究还没有被报道，rps9在超数排卵过程中与卵巢、卵母细胞等之间的相互作用尚未清楚。


技术实现要素：

5.本发明为了克服现有技术中存在的上述问题，首先提供了rps9蛋白在食蟹猴超数排卵良好应答预测中的应用。
6.本发明的目的通过以下技术方案实现：
7.rps9蛋白在食蟹猴超数排卵良好应答预测中的应用。
8.超数排卵一直是辅助生殖技术研究的重点，在超数排卵中获得卵母细胞的数量、成熟度以及发育潜能至关重要。食蟹猴在正常超数排卵中可以获得十个甚至数十个成熟的mii期卵母细胞，然而在重复超排后，部分食蟹猴开始在超数排卵中产生应答，只能获得少量的gv期卵，并且在后续的超数排卵中都表现不佳。虽然卵巢中储备着大量的原始卵泡，但无法通过超数排卵进行有效的获取。尽管大量对超数排卵的研究证实了在超数排卵中存在抗体、体重、季节、年龄等影响因素，但是超数排卵是一个促性腺激素与卵母细胞之间的相关调控，是一个复杂的动态过程。因此，影响超数排卵的机制还未被阐明以及有效的解决方法还未被提出。由于蛋白质是生命活动中最终发挥作用的执行者，超数排卵过程中也是大量的蛋白在生命体中进行相关作用的结果。
9.在本次实验中采用的是dia非标定量的技术，该技术将质谱整个扫描范围分为若干个窗口，并且高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂以及检测。因此，与传统的dda技术相比，dia可以将样本中的全部碎片信息都收集，数据利用度大大提高，缺失值少，具有较高的低丰度蛋白的检测率。本研究中，按超数排卵的结果对血液样本进行分组，通过蛋白质组学的方法对6只食蟹猴超数排卵的血液样品进行分析，共鉴定出1550个蛋白，其中对超数排卵成功组第1天、超数排卵成功组第5天、超数排卵失败组第1天以及超数排卵失败组第5天的样本蛋白进行生物信息分析，得到各组之间的差异蛋白。从蛋白质水平研究，对揭示超数排卵中血液的蛋白表达变化进行了探讨。尝试筛选出超数排卵中影响卵母细胞数量和质量的相关差异蛋白，对进一步改善超数排卵方案以及预测超数排卵结果提供了可能的分子标志物。
10.从蛋白质定性分析中可以得知，rps9蛋白在超数排卵成功组中第5天表达，而在第5天超数排卵失败组中不表达。提示在超排失败组prs9表达下调影响mapk信号通路和nk
‑
κb通路的活化，从而使细胞凋亡、细胞周期阻滞并抑制增殖。prs9表达下调可能引起p53的活化，从而导致细胞增殖受到抑制，从而影响了卵泡形成，导致超排应答失败。
11.优选的，rps9蛋白作为食蟹猴超数排卵良好应答预测的正调控因子。
12.因此，在具体预测食蟹猴超数排卵的成功或者失败时，可以通过检测食蟹猴超排的第1天至第5天的血液样品中的rps9蛋白存在与否来预测。
13.当然，食蟹猴超数排卵时，同样可以按照现有的方案给予激素，给予激素的方案包括但不限于以下三种：
14.第一种：雌性食蟹猴月经第1天皮下注射gnrh激动剂3.75mg。两到三周后，雌性食蟹猴皮下注射75iu/kg rhfsh，每隔72h注射三次，最后一次注射后60h静脉注射1200iu hcg。
15.第二种：雌性猴子在月经1～3天时，肌内注射60iu rhfsh每天两次连续6天，然后60iu肌内注射rhfsh和60iu rhlh每天两次连续3天，随后5小时后静脉注射1000iu的hcg。为了抑制过早排卵，从刺激rhfsh的第1天开始，每天注射0.25mg gnrh抑制剂，并持续到hcg当天。
16.第三种：在月经的第1天，对雌性食蟹猴进行gnrh激动剂3.75mg皮下注射。两到三周后，用a或b方法刺激卵泡生长。方法a：25iu/kg的rhfsh溶解在甘油/生理盐水(1:1)皮下注射9天，一天一次，36h后静脉注射1200iu hcg。方法b：雌性食蟹猴每隔3天皮下注射75iu/kg hfsh，最后一次处理间隔60h后静脉注射1200iu hcg。
17.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
18.本发明通过蛋白质组学的方法对超数排卵成功组第1天、超数排卵成功组第5天、超数排卵失败组第1天以及超数排卵失败组第5天的样本蛋白进行生物信息分析，得到各组之间的差异蛋白。从蛋白质水平研究，对揭示超数排卵中血液的蛋白表达变化进行了探讨。尝试筛选出超数排卵中影响卵母细胞数量和质量的相关差异蛋白，对进一步改善超数排卵方案以及预测超数排卵结果提供了可能的分子标志物。
19.在食蟹猴超数排卵中，rps9蛋白在超数排卵成功组中第5天表达，而在第5天超数排卵失败组中不表达。提示在超排失败组prs9表达下调影响mapk信号通路和nk
‑
κb通路的活化，从而使细胞凋亡、细胞周期阻滞并抑制增殖。prs9表达下调可能引起p53的活化，从而导致细胞增殖受到抑制，从而影响了卵泡形成，导致超排应答失败。
20.上述预测为食蟹猴超数排卵良好应答预测提供了新的方法，具有实际的应用价值。
附图说明
21.图1为本发明蛋白质组学实验步骤和结果分析流程图；
22.图2为差异蛋白定量分析结果；其中图2a为差异蛋白柱状图；图2b为差异蛋白和鉴定蛋白总数的韦恩图。
具体实施方式
23.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
24.下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
25.一、超数排卵实验过程
26.每天观察目标猴群中的成年母食蟹猴的生理状态，在发现月经出现的第1天做好笼号以及猴号登记记录。在月经第1～4天时，对月经期的食蟹猴进行静脉血液样本采集，卵巢及子宫b型超声影像检查，卵巢及子宫彩色超声影像检查。同时，在采集月经期血液样本的当天晚上开始肌肉注射rhfsh，并将当天记录为超排第1天。从第二天开始每天早晚各注射一次rhfsh。在注射rhfsh的第5天时，再次进行血液样本的采集。在超数排卵的第9天早上肌肉注射完rhfsh后就停针。在超数排卵的第10天晚上对超排的食蟹猴使用hcg进行肌肉注射一次。最后，在rhcg注射36小时后，及超数排卵的第12天早上进行血液样本采集和腹腔镜手术取卵。
27.二、蛋白质组学检测及结果分析
28.筛选出3只超数排卵应答不良和3只超数排卵应答良好的食蟹猴，将其第1天以及第5天的采集的2ml血液样本放在提前预冷好的4℃离心机中，3000rpm离心10分钟，取上清液于ep管中，放置
‑
80度冰箱保存。
29.将血液样本分为4组，分别为超排失败组第1天，超排失败组第5天，超排成功组第1天，超排成功组第5天。将4组血浆样本进行蛋白质组学的后续工作，并将4组蛋白进行相互
地对比分析，直至蛋白质数据的产生。本次蛋白质组学方法选用的是dia非标记定量蛋白质组学技术完成分析。在数据非依赖型采集模式下，能够提供大量的蛋白质组覆盖，同时让每个样品中的大量蛋白质可以精确、高度可重复的定量，是一个提供理想的差异蛋白质组定性分析或海量样品的蛋白质组定量平台。具体实验流程以及信息分析流程如图1所示。蛋白质组学中最终鉴定的蛋白质序列都来源于uniprot蛋白数据库，ncbi和ensembl基因注释系统，并由spectronaut软件完成，其中差异分析由rstudio软件完成。
30.将四组血液样本蛋白质组学的数据结果进行筛选和整合，从蛋白质定性以及差异分析进行探讨。
31.实验结果：将超数排卵应答不良的雌性食蟹猴第1天及第5天的血液蛋白分别记为treated1组(t1)和treated 2组(t2)，超数排卵应答良好的雌性食蟹猴第1天和第5天的血液蛋白分别记为treated 3组(t3)和treated 4组(t4)。其中差异蛋白的对比分为三部分，第一部分是将超排失败t1与t2间的差异蛋白与超排成功组t3与t4间的差异蛋白进行对比分析，比较超排失败组与超排成功组在超排过程中差异蛋白的变化；第二部分是将超排失败组t1与超排成功组t3的差异蛋白进行分析，对比超排失败组与超排成功组在月经期血液蛋白的差异；第三部分是将超排失败组t2与超排成功组t4的差异蛋白进行分析，比较在超排成功组与超排失败组在超排过程中血液的差异蛋白。其中每部分的差异蛋白将从差异蛋白的基因本体(go)，通路富集分析(kegg)，相互作用等方面进行分析。
32.如图2a所示，通过差异蛋白定量分析可知，t1与t2相比，一共有56个差异蛋白，其中有52个差异蛋白上调以及4个差异蛋白下调。
33.由于差异蛋白分析结果是对4个组别样本中都存在的蛋白的差异水平进行分析，而在鉴定出的蛋白中除了146个差异蛋白外，如图2b所示，还有55个蛋白在4个分组中的部分组别样本里没有检测到，包括60s核糖体蛋白l26(60s ribosomal protein l26，rps9)，40s核糖体蛋白s9(40s ribosomal protein s9，rps9)，儿茶酚o甲基转移酶(catechol
‑
o
‑
methyltransferase，comt)。其中，rps9蛋白在超排失败组的第5天中没有检测到，其它组别中均存在。在go分析中，rps9蛋白主要参与了翻译、rna结合等过程。在kegg分析中，rps9蛋白主要参与了核糖体信号通路。研究表明，核糖体生物发生的干扰会引起了核糖体应激，一组核糖体蛋白(ribosomal protein，rps)作为p53信号通路的关键介质出现。因此，在食蟹猴超数排卵中，rps9蛋白在超数排卵成功组中第5天表达，而在第5天超数排卵失败组中不表达。提示在超排失败组prs9表达下调影响mapk信号通路和nk
‑
κb通路的活化，从而使细胞凋亡、细胞周期阻滞并抑制增殖。prs9表达下调可能引起p53的活化，从而导致细胞增殖受到抑制，从而影响了卵泡形成，导致超排应答失败。