一种化橘红胎对照提取物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及中药质量控制技术领域，特别是涉及一种化橘红胎对照提取物及其制备方法和应用。

背景技术：

现行中药质量控制模式基本上是沿着天然药物化学的发展，对中药某一种或几种有效成分为目标的分析方法和既有定性又可定量的质量标准的构思，参照国外植物药的质量控制方法，借鉴化学药品质量控制的模式，并借助文献报道建立相应的简单理化鉴别，再发展到以光谱、色谱为主的鉴别和含量测定的质量标准。

每一味中药材都是多成分的综合体，这决定了其特有的整体性和模糊性，也表明以药材中一两个甚至几个成分作为药材质量的评价方法存在很大的局限性。1990版《中国药典》增加了对照药材的薄层色谱鉴别，使得中药及中成药的鉴别有了很大的进展。目前中药和国外的草药越来越重视多成分或多组分的检测，例如德国银杏叶提取物的质量控制。指纹图谱的分析方法，可以从整体上对药材进行质量控制，现在仍然有很大的研究价值。

目前中国药典在控制药材质量方面有两种“对照品”，化学对照品和中药对照药材。其中化学对照品可用于药材的定性鉴别和定量分析，中药对照药材则用于显微鉴别和薄层鉴别。然而，化学对照品和中药对照药材在中药质量控制上都有其局限性。这种局限性表现在，一、中药中化学成分多样化，单一或者几个化合物并不能反映药材的全貌，而现有的标准往往有很多漏洞，以次充好的现象时有发生；二、中药对照药材受到产地、生长环境的影响，很难保证每一批的质量一致，而且只能用于定性鉴别，无法反映药材成分含量的高低。

中药对照提取物是用中药材制备的性状及成分稳定，可以用于定性或者定量分析的提取物，谢培山先生对中药对照提取物提出了四个基本要求(ascs)，也是对照提取物应具备基本条件：authenticity，药材来源可靠，具有代表性；specificity，使用的检测方法专属性；con-sistency，不同批次对照提取物应保持一致；stability，性状稳定、均匀、便于使用。运用高效薄层色谱指纹图谱以及高效液相指纹图谱等方法，可以用于药材的定性鉴别，经过外标法标化的对照提取物，可以进一步用来半定量及定量分析检测。中药对照提取物将对中药质量控制有重要的意义。

技术实现要素：

鉴于此，有必要提供一种化橘红胎对照提取物及其制备方法和应用。本发明提供了一种化橘红胎对照提取物的制备方法，该方法操作简便、成本低、重复性好且提取率高；本发明还提供了利用化橘红胎对照提取物的制备方制备的化橘红胎对照提取物，制备的化橘红胎对照提取物一致性好、性状稳定、均匀且便于使用，能够反映药材的全貌。

本发明一方面提供了一种化橘红胎对照提取物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

步骤一、乙醇提取，所述乙醇提取包括如下步骤：

a)取化橘红胎药材粉末与乙醇混合，闪提后过滤，得到滤液1和滤渣1；

b)将滤渣1重复步骤a)操作，得到滤液2和滤渣2，所得滤渣2再重复步骤a)操作，以此类推步骤b)共重复步骤a)进行n次操作，得到滤液n+1和滤渣n+1；

c)将滤液1～(n+1)合并得提取液1，将提取液1低温浓缩得到化橘红胎干膏；

步骤二、制备化橘红胎提取物：将步骤二得到的化橘红胎提取物干膏溶解于乙醇，得到化橘红胎提取物干膏的乙醇溶液，再加入辅料，低温干燥过筛得到化橘红胎提取物；

步骤三、调配：将不同批次的化橘红胎提取物进行调配，得到化橘红胎对照提取物。

上述制备过程中的低温浓缩、低温干燥所采取的温度为20℃-60℃。

将不同批次的化橘红胎提取物进行调配，可以理解的是至少有五批次的化橘红胎提取物进行调配或勾兑。

优选地，上述步骤一中8≥n≥0，且n为整数。

优选地，上述步骤一中的n为3。

优选地，上述步骤一中化橘红胎粉末与乙醇的重量体积比为1:5～1:50，所述的重量体积比的单位为g/ml。

更优选地，上述步骤一中的化橘红胎粉末与乙醇的重量体积比为1：5。

优选地，上述步骤一中的乙醇的浓度为50％～95％。

更优选地，上述步骤一中的乙醇的浓度为50％。

优选地，上述步骤一中的闪提时间为1～3min，功率为100w～3kw。

更优选地，上述步骤一中的闪提时间为1min，功率为2000w。

优选地，上述步骤一中的过滤是用中速滤纸或者2000目筛网过滤。

优选地，上述步骤二中的化橘红胎提取物干膏与乙醇的重量体积比为1:5～1:50。所述的重量体积比的单位为g/ml，所述酒精的浓度50％。

优选地，上述步骤二中的化橘红胎提取物干膏与乙醇的重量体积比为1:5。

优选地，上述辅料的重量为化橘红胎干膏重量的20％～60％。

优更选地，上述辅料的重量为化橘红胎干膏重量的30％。

优选地，上述辅料为微粉硅胶。

优选地，上述步骤二低温干燥后是过90～200目筛网过滤。

更优选地，上述步骤二低温干燥后是过110目筛网。

据优选地，上述步骤二和步骤四之间还包括以薄层色谱法和/或高效液相色谱法对不同批次的化橘红胎提取物进行检测的调配前处理步骤。

本发明第二方面提供了一种化橘红胎对照提取物，所述的化橘红胎对照提取物通过上面所述的制备方法获得。

优选地，上述的化橘红胎对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的图谱与其对应的原料药材一致。

优选地，上述的化橘红胎对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的图谱与其对应的原料药材在柚皮苷的位置处的图谱一致。

优选地，上述的化橘红胎对照提取物含有的主要物质包含柚皮苷。

本发明第三方面提供了上述的化橘红胎对照提取物在药材或中药制剂的鉴别，或在化橘红胎或含化橘红胎/化橘红胎有效成分的药材或中药制剂的质量控制中的应用。

优选地，上述药材或中药制剂的鉴别，或在化橘红胎或含化橘红胎/化橘红胎有效成分的药材或中药制剂的质量控制的方法为：将上面所述的化橘红胎对照提取物、药材或中药制剂以薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测，对比判别。

优选地，上述薄层色谱法和/或高效液相色谱法是对化橘红胎对照提取物、药材或中药制剂中的主要成分进行检测，所述的主要成分包含柚皮苷。

优选地，上述化橘红胎对照提取物、药材或中药制剂以薄层色谱法进行检测时，需要将化橘红胎对照提取物、药材或中药制剂配置成溶液再进行检测，其中化橘红胎对照提取物溶液的配置方法为：将权利要求6所述的化橘红胎对照提取物加甲醇，配置成浓度为10mg/ml～50mg/ml的化橘红胎对照提取物甲醇溶液，过0.12～0.32μm滤膜即得化橘红胎对照提取物溶液，所述甲醇浓度为100％。

优选地，上述化橘红胎对照提取物甲醇溶液浓度为40mg/ml；所述滤膜为0.22μm。

进一步的，所述薄层色谱法中待检药材溶液配制方法为：取待检产品过四号筛后称取0.1～2g，加入1ml～20ml甲醇，冷浸1～30min，超声1～30min，功率为100w～3kw后离心1～20min，转速为1000～5000转/min，取上清液过0.12-0.32μm滤膜即得待检产品溶液；优选称取待检产品0.5g，加入5ml甲醇，冷浸15min，超声15min，功率为500w，离心10min，转速4000转/min，取上清液过0.22μm滤膜，即得待检产品溶液。

优选地，上述薄薄层色谱法的检测条件为检测条件一或检测条件二，所述检测条件一为：

薄层板：hptlcg60预制板；

点样：对照品：2μl，5μl，条带状点样；

展开剂：

黄酮苷：氯仿-甲醇-水-冰醋酸(13：4：1：1.5)下层溶液；

黄酮苷元：s1：甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20：20：1：1)上层溶液；

s2:甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20：10：1：1)上层溶液；

检视：

黄酮苷：喷以5％三氯化铝乙醇溶液，立即置于紫外光(366nm)下检视，再喷以5％香草醛10％硫酸乙醇混合溶液，105℃加热至斑点显色清晰，可见光下检视；

黄酮苷元：直接至于紫外光(366nm)下检视；

所述检测条件二为：

薄层板：tlcg60预制板；

点样：2μl，条带状点样；

展开剂：乙酸乙酯-丙酮-冰乙酸-水(8∶4∶0.3∶1)；

检视：喷5％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热1分钟，置紫外光灯(365nm)下检视；

任选的，上述化橘红胎对照提取物、药材或中药制剂以高效液相色谱法进行检测时，需要将化橘红胎对照提取物、药材或中药制剂配置成溶液再进行检测，其中化橘红胎对照提取物溶液的配置方法为：将权利要求6所述的化橘红胎对照提取物加甲醇，配置成浓度为2mg/ml-15mg/ml的化橘红胎对照提取物甲醇溶液，过0.12—0.32μm滤膜即得化橘红胎对照提取物溶液，所述甲醇浓度为100％。

优选地，上述化橘红胎对照提取物甲醇溶液浓度为2.5mg/ml；所述滤膜为0.22μm。

进一步的，所述高效液相色谱法检测中，待检药材溶液的配制方法为：取待检产品过四号筛后精密称取0.1～2g，置10～100ml容量瓶中，加入5～50ml甲醇，超声处理30～60min，功率为100w～3kw，放冷，50％甲醇定容至刻度，摇匀，过0.12～0.32μm滤膜，取续滤液即得待检产品溶液。优选精密称取待检产品0.5g，置100ml容量瓶中，加入50ml甲醇，超声处理30min，功率为500w，放冷，50％甲醇定容至刻度，摇匀，过0.22μm滤膜，即得待检产品溶液，所述甲醇浓度为100％。

优选地，上述的高效液相色谱法的检测条件：

色谱仪器：thermofisheu3000高效液相色谱仪；

检测器：thermofishedad检测器；

色谱柱：zorbaxsbc18(4.6×250mm,5μm)

流动相：甲醇-0.3％醋酸溶液(35:65)；

检测波长：320nm；流速1ml/min；进样量10μl；柱温35℃；运行时间：50min；

本发明具有以下有益效果：

本发明的化橘红胎对照提取物的制备方法采用了提取、制备化橘红胎提取物和调配的步骤，操作简便、成本低、重复性好且提取率高。用此制备方法制备得到的化橘红胎对照提取物因是不同批次的提取物进行调配而成，克服了因中药对照药材受到产地、生长环境的影响，很难保证每一批的质量一致的缺陷，从而保证了不同批次的化橘红胎对照提取物的一致性；保证了制备全过程的低温控制，有效防止了有效成分的变化；其性状稳定、均匀且便于使用；采用本发明的化橘红胎对照提取物的制备方法最终得到的对照提取物薄层色谱指纹图谱、hplc指纹图谱与药材对应一致。

本发明还提供了药材或中药制剂的鉴别方法，或化橘红胎或含化橘红胎/化橘红胎有效成分的药材或中药制剂的质量控制方法，可以对药材或中药制剂进行定性鉴别。

附图说明

图1是针对以柚皮苷为参照物质对化橘红胎原料药材进行薄层色谱法得到的薄层色谱图(一)。1为对照品柚皮苷，2-16依次对应化橘红胎原料药材：化橘红胎原料药材1、化橘红胎原料药材2、化橘红胎原料药材3、化橘红胎原料药材4、化橘红胎原料药材5，化橘红胎原料药材6、化橘红胎原料药材7、化橘红胎原料药材8、化橘红胎原料药材9、化橘红胎原料药材10、化橘红胎原料药材11、化橘红胎原料药材12、化橘红胎原料药材13、化橘红胎原料药材14、化橘红胎原料药材15。

图2是针对以柚皮苷为参照物质对化橘红胎原料药材进行薄层色谱法得到的薄层色谱图(二)。1为对照品柚皮苷，2-16依次对应化橘红胎原料药材：化橘红胎原料药材1、化橘红胎原料药材2、化橘红胎原料药材3、化橘红胎原料药材4、化橘红胎原料药材5，化橘红胎原料药材6、化橘红胎原料药材7、化橘红胎原料药材8、化橘红胎原料药材9、化橘红胎原料药材10、化橘红胎原料药材11、化橘红胎原料药材12、化橘红胎原料药材13、化橘红胎原料药材14、化橘红胎原料药材15。

图3是对化橘红胎原料药材进行薄层色谱法得到的高效薄层色谱图(三)。1-15依次对应化橘红胎原料药材：化橘红胎原料药材1、化橘红胎原料药材2、化橘红胎原料药材3、化橘红胎原料药材4、化橘红胎原料药材5，化橘红胎原料药材6、化橘红胎原料药材7、化橘红胎原料药材8、化橘红胎原料药材9、化橘红胎原料药材10、化橘红胎原料药材11、化橘红胎原料药材12、化橘红胎原料药材13、化橘红胎原料药材14、化橘红胎原料药材15。

图4是对化橘红胎原料药材进行高效液相色谱法得到的hplc指纹图谱叠加图，r对应化橘红胎原料药材共有模式(共有模式)，1-15依次对应化橘红胎原料药材：化橘红胎原料药材1、化橘红胎原料药材2、化橘红胎原料药材3、化橘红胎原料药材4、化橘红胎原料药材5，化橘红胎原料药材6、化橘红胎原料药材7、化橘红胎原料药材8、化橘红胎原料药材9、化橘红胎原料药材10、化橘红胎原料药材11、化橘红胎原料药材12、化橘红胎原料药材13、化橘红胎原料药材14、化橘红胎原料药材15。

图5为本发明化橘红胎对照提取物制备流程图。

图6为化橘红胎对照提取物利用高效液相色谱法测定得到指纹图谱，与制备原料药材共有模式图谱进行相似度检测，ers对应化橘红胎对照提取物，r为化橘红胎原料药材共有模式。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例中使用到的仪器和材料的来源如下：

拟用于制备对照提取物的药材:化橘红胎。

ats4薄层色谱全自动点样仪、薄层色谱双槽展开缸、和tlcvisualizer薄层色谱摄像仪(瑞士，camag)。

thermofisheu3000高效液相液质色谱仪，thermofishedad检测器。

甲醇色谱纯(merck)、香草醛(macklin)。

本发明未标注纯度的甲醇，纯度为大于或者等于99.5％。

本发明涉及的5％香草醛10％硫酸乙醇混合溶液是含体积百分比5％的香草醛和体积百分比10％的硫酸的乙醇溶液。

本发明涉及的展开剂的比例均是体积比。

甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、冰醋酸、硫酸、甲酸、丙酮、三氯化铝均为分析纯(广州化学试剂厂)。

柚皮苷对照品，(中国食品药品检定研究院；批号：110722-201815，标示含量≥91.7％)；

测试药材化橘红胎：

化橘红胎原料药材15批采购于广东化州：化橘红胎原料药材1、化橘红胎原料药材2、化橘红胎原料药材3、化橘红胎原料药材4、化橘红胎原料药材5，化橘红胎原料药材6、化橘红胎原料药材7、化橘红胎原料药材8、化橘红胎原料药材9、化橘红胎原料药材10、化橘红胎原料药材11、化橘红胎原料药材12、化橘红胎原料药材13、化橘红胎原料药材14、化橘红胎原料药材15。

实施例1：化橘红胎原料药材的筛选

本实施例提供了本发明化橘红胎对照提取物的原料药材的筛选方法。

用高效薄层色谱法以及高效液相色谱法分别以化橘红胎对照药材为参照物质对化橘红胎原料药材进行分析以及筛选。

化橘红胎药材购于全国各大药材市场，经谢培山教授鉴定为芸香科植物化州柚(citrusgrandis‘tomentosa’)的未成熟或近成熟的干燥果实。经鉴定15批药材符合标准可以备用。

1薄层色谱

1.1样品制备

对照品溶液制备：称取柚皮苷对照品适量，用甲醇配制成浓度为1mg/ml的溶液，过0.22μm滤膜，即得对照品溶液。

原料药材溶液：取化橘红胎原料药材(1-15)粉末，过四号筛(250±9.9μm，65目，下同)，各精密称定0.5g，加入5ml甲醇，冷浸15min，超声15min，功率为500w，离心10min，转速4000转/min，取上清液过0.22μm滤膜，即得，即得原料药材溶液。

检测条件如下：

方法一：

薄层板：hptlcg60预制板；

点样：对照品：2μl，条带状点样；

展开剂：

黄酮苷：氯仿-甲醇-水-冰醋酸(13：4：1：1.5)下层溶液；

黄酮苷元：s1：甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20：20：1：1)上层溶液；

s2:甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20：10：1：1)上层溶液；

检视：

黄酮苷：喷以5％三氯化铝乙醇溶液，立即置于紫外光(366nm)下检视，再喷以5％香草醛10％硫酸乙醇混合溶液，105℃加热至斑点显色清晰，可见光下检视；

黄酮苷元：直接至于紫外光(366nm)下检视；

方法二：

薄层板：tlcg60预制板；

点样：2μl，条带状点样；

展开剂：乙酸乙酯-丙酮-冰乙酸-水(8∶4∶0.3∶1)；

检视：喷5％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热1分钟，置紫外光灯(366nm)下检视；

检测结果如图1-图3所示，图1为方法一展开后用三氯化铝乙醇溶液显色，在紫外灯(366nm)下检视薄层色谱图，图2为方法一三氯化铝显色后再用香草醛硫酸乙醇混合溶液显色，在可见光下检视薄层色谱图，图3为方法二于紫外光(366nm)检视薄层色谱图。图1和图2：1为对照品柚皮苷，2-16依次对应化橘红胎原料药材：化橘红胎原料药材1、化橘红胎原料药材2、化橘红胎原料药材3、化橘红胎原料药材4、化橘红胎原料药材5，化橘红胎原料药材6、化橘红胎原料药材7、化橘红胎原料药材8、化橘红胎原料药材9、化橘红胎原料药材10、化橘红胎原料药材11、化橘红胎原料药材12、化橘红胎原料药材13、化橘红胎原料药材14、化橘红胎原料药材15，图3：1-15依次对应化橘红胎原料药材：化橘红胎原料药材1、化橘红胎原料药材2、化橘红胎原料药材3、化橘红胎原料药材4、化橘红胎原料药材5，化橘红胎原料药材6、化橘红胎原料药材7、化橘红胎原料药材8、化橘红胎原料药材9、化橘红胎原料药材10、化橘红胎原料药材11、化橘红胎原料药材12、化橘红胎原料药材13、化橘红胎原料药材14、化橘红胎原料药材15。由图1-图3可见，各批次化橘红胎原料药材在同一位置都可以显示相同的斑点，初步筛选为化橘红胎作对照提取物的原料药材。

2高效液相色谱

2.1样品制备

原料药材溶液：精密称取化橘红胎原料药材(1-15)粉末0.5g，置100ml容量瓶中，加入50ml甲醇，超声处理30min，功率为500w，放冷，50％甲醇定容至刻度，摇匀，过0.22μm滤膜，即得原料药材溶液。

2.2高效液相色谱检测

高效液相色谱法检测条件如下：

色谱仪器：thermofisheu3000高效液相色谱仪；

检测器：thermofishedad检测器；

色谱柱：zorbaxsbc18(4.6×250mm,5μm)；

流动相：甲醇-0.3％醋酸溶液(35:65)；

检测波长：320nm；流速1ml/min；进样量10μl；柱温35℃；运行时间：50min；

高效液相色谱法检测方法：分别取化橘红胎对照药材溶液和原料药材溶液各10μl，注入液相色谱仪。

高效液相色谱法检测结果：

测定，记录色谱图，即得图4所示的hplc指纹图谱叠加图，r对应化橘红胎原料药材共有模式(共有模式)，1-15依次对应化橘红胎原料药材：化橘红胎原料药材1、化橘红胎原料药材2、化橘红胎原料药材3、化橘红胎原料药材4、化橘红胎原料药材5，化橘红胎原料药材6、化橘红胎原料药材7、化橘红胎原料药材8、化橘红胎原料药材9、化橘红胎原料药材10、化橘红胎原料药材11、化橘红胎原料药材12、化橘红胎原料药材13、化橘红胎原料药材14、化橘红胎原料药材15。

由图4可以看出，化橘红胎原药材1-化橘红胎原药材15的指纹图谱具有高度的一致性，由此建立化橘红胎药材的指纹图谱共有模式，并对所有样品进行相似度分析。根据共有模式图谱，采用夹角余弦算法根据各样品组分及其峰面积对15批化橘红胎原料药材进行相似度评价，结果如表1所示。

表1

根据以上相似度分析结果，15批化橘红胎原药材的相似度都很高，可选用为化橘红胎对照提取物的原料药材。

实施例2：化橘红胎对照提取物的制备

本实施例提供了本发明化橘红胎对照提取物的制备方法，其方法流程图如图5所示。

一：提取

选取化橘红胎药材，制成粉末，药材粉末过四号筛，然后加入其质量5倍体积的的50％乙醇(即固液比为1：5(w/v，g/ml))，闪提(功率2000w，常温，具体方法参照沈瑞.闪式提取在中药中的应用进展[j].中药材,2015,38(07):1540-1542.中的闪式提取法)提取1min后中速定性滤纸(通用电气生物科技(杭州)有限公司，型号：99-103-125)过滤，收集滤渣1和滤液1，滤渣1按相同方法再次提取三次，并将再次提取的三次收集的滤液与滤液1合并即为提取液，将提取液低温(小于45℃)浓缩溶剂即得化橘红胎提取物干膏。

二：制备化橘红胎提取物

用化橘红胎提取物干膏质量5倍体积(w/v，g/ml)的50％乙醇将化橘红胎提取物干膏溶解，得到化橘红胎提取物干膏的50％乙醇溶液，再加入化橘红胎提取物干膏重量30％的微粉硅胶(山河药辅，批号170115)，混匀，用旋转蒸发仪低温((小于45℃)浓缩至干，粉碎过110目筛，得到化橘红胎提取物。

多批次的化橘红胎药材粉末按照上述步骤一至步骤二的操作方法制得不同批次的化橘红胎提取物。

三：调配

将步骤二的15个批次的化橘红胎提取物按1:1:1:1:1:1:1：1:1:1:1:1：1:1:1比例混合勾兑得到化橘红胎对照提取物，最终产品对应化橘红胎原药材比例大约为1：16.95(g/g)。

调配标准为：应使最终得到的对照提取物得到的图谱与其对应的原料药材图谱一致，此调配标准中的各成分的含量的范围也是经过多次反复实验综合保持稳定性、一致性以及后面的应用等得出的最佳数据。

四：检测

将步骤三调配成的化橘红胎对照提取物利用高效液相色谱法测定得到指纹图谱，与制备原料药材共有模式图谱进行相似度检测，如图6，ers对应化橘红胎对照提取物，r为化橘红胎原药材共有模式。得到相似度为1，化橘红胎对照提取物和化橘红胎原药材指纹图谱共有模式的相似度高，这说明本发明的化橘红胎对照提取物能代表化橘红胎原药材。

实施例3：化橘红胎对照提取物的性状分析

1.表观状态：实施例2得到的化橘红胎对照提取物均为黄褐色粉末。

2.水分测定按照2015版中国药典四部0832水分测定法项下第一法(1、容量滴定法p104)测定。检测结果为化橘红胎对照提取物含水量为3.89％。

3.一致性测试：按照实施例2的方法制备15批次化橘红胎对照提取物，经测定各批薄层色谱检测图谱差异很小。因此利用本发明的化橘红胎对照提取物的制备方法制备得到的化橘红胎对照提取物一致性非常好。