菊三七中吡咯里西啶生物碱的风险评估方法与流程

本发明属于中药材检测领域，具体涉及菊三七中吡咯里西啶生物碱的风险评估方法。

背景技术：

菊三七来源于菊科菊三七属菊三七植物的根或全草，又称土三七、菊叶三七或紫背三七。在我国现代生药学著作中，如:《全国中草药汇编》和《中华本草》，均有记载。菊三七也曾是第一批中药材部颁质量标准《中华人民共和国卫生部药品标准》(中药材第一册)收载的品种之一；此外，该品还收录于多个地方药物志或中药材标准中，如《湖南药物志》(三七草)、《四川常用中草药》及《浙江药用植物志》等。

研究表明，菊三七具有止血、抗炎、降血糖、促进骨质愈合以及抗疟疾、抗肿瘤等多种药理活性，可用于治疗跌打损伤和外伤出血等。然而，菊三七具有双重性，一方面具有良好的临床药效；另一方面，临床上有较多药源性肝损伤的报道，主要表现为肝窦阻塞综合征(hsos)，其病因与该药材所含有的吡咯里西啶类生物碱(pa)有关，摄入含肝毒性吡咯里西啶类生物碱成分的野生植物或中草药是导致hsos的病因之一。1980年侯景贵等的首次报道以来，因服用菊三七导致hsos甚至死亡的临床案例报道一直未有间断。除了个案的报道，近百例的临床案例分析时有可见。凌美等经文献分析收集了菊三七致hsos患者81例，发现有18.5％的病死率，其中毒程度与服药剂量相关。因此，需要对于菊三七中的吡咯里西啶生物碱的风险进行科学、合理地评估和控制。

技术实现要素：

鉴于上述技术问题，本发明的目的在于提供一种菊三七中吡咯里西啶生物碱的风险评估方法，该评估方法在暴露量计算过程中增加了人类平均寿命、中药使用频率和暴露年限等，同时结合准确的吡咯里西啶生物碱含量测定方法，能够科学、合理地对菊三七中吡咯里西啶生物碱的风险进行评估，提高用药安全性。

为实现上述目的，本发明是采用如下技术方案实现的：

一种菊三七中吡咯里西啶生物碱的风险评估方法，包括以下步骤：

步骤1、根据中国人群中药的使用特点，建立暴露评估模型；

当菊三七为内服时，所述暴露评估模型为：

exp＝(ef×ed×ir×c)/(at×w)

其中，ef为用药频率，单位为天/年；ed为暴露年限；ir为菊三七每日用量，单位为g；c为中药材中吡咯里西啶生物碱总量的测定值，单位为mg/kg；at为平均寿命天数；w为人体平均体重，单位为kg；

当菊三七为外用时，所述暴露评估模型为：

exp＝(ef×ed×ir×c×v)/(at×w)

其中，ef为用药频率，单位为天/年；ed为暴露年限；ir为菊三七每日用量，单位为g；c为菊三七中吡咯里西啶生物碱总量的测定值，单位为mg/kg；v为透皮吸收系数，仅针对菊三七外用的情况；at为平均寿命天数；w为人体平均体重，单位为kg；

步骤2、根据中国人群中药消费情况及医院处方系统中药材使用情况，确定暴露评估模型的暴露评估参数；

步骤3、对菊三七中吡咯里西啶生物碱的含量进行测定：

步骤4、根据步骤1的暴露评估模型，结合步骤2、步骤3的数据计算得到暴露量；

步骤5、采用暴露限值moe法进行风险评估，若moe>10000，认为菊三七中吡咯里西啶生物碱的健康风险较低；若moe≤10000,认为菊三七中吡咯里西啶生物碱的健康风险较高，应予以关注，moe计算公式如下；

moe＝bmdl/exp

其中，moe为暴露限值，exp为计算得到的暴露量，单位为μg/kg·bw；bmdl为吡咯里西啶生物碱的基准剂量下限值。

作为本发明的优选，所述ef为90天/年，ed为20年，ir参照药典或地方标准，v根据风险最大化原则为100％，at为25550天，w为70kg；吡咯里西啶生物碱的bmdl10为237μg/kgbw/day。

作为本发明的优选，在对菊三七中吡咯里西啶生物碱的含量进行测定时，具体包括以下步骤：

步骤3.1、混合对照品溶液

精密称取千里光菲灵碱、n-氧化千里光菲灵碱、全缘千里光碱、千里光宁碱、n-氧化全缘千里光碱和n-氧化千里光宁碱的对照品适量，分别以50％甲醇水配成一定浓度的对照品储备液，分别精密称取各对照品储备液适量，用50％甲醇水配成一定浓度的混合对照品溶液；

步骤3.2、供试品溶液

取菊三七适量，粉碎过4号筛，将适量菊三七粉末置于具塞锥形瓶中，加入0.05mol·l^–1硫酸溶液，超声提取，过滤，取续滤液进行spe-pcx的富集纯化，spe-pcx的富集纯化过程为：甲醇活化spe-pcx小柱，0.05mol·l^–1硫酸溶液平衡小柱，将上述续滤液上柱，以甲醇淋洗除杂，8％氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液并浓缩，用50％甲醇水稀释定容至一定体积量瓶中，过微孔滤膜，即得；

步骤3.3、测定

分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱与质谱联用仪，测定，记录30min的色谱图，依据外标法计算千里光菲灵碱、n-氧化千里光菲灵碱、全缘千里光碱、千里光宁碱、n-氧化全缘千里光碱和n-氧化千里光宁碱的含量；

其中，色谱-质谱条件——色谱柱：watersacquityuplchsst3色谱柱；柱温：40℃；流动相：0.05％甲酸和2.5mmol·l^–1甲酸铵的水溶液(a)及含0.05％甲酸和2.5mmol·l^–1甲酸铵的乙腈(b)，梯度洗脱条件为：0～20min，0％b→8％b；20～30min，8％b；流速：0.3ml·min^–1；进样量：1μl；质谱离子源为电喷雾离子化源，正离子，多反应监测模式，毛细管电压3.0kv，离子源温度150℃，去溶剂温度500℃。

本发明的优点和积极效果：

(1)本发明提供的风险评估方法在建立暴露评估模型时，考虑了我国居民中药的消费量及消费模式，包括不同省份居民中草药使用率，不同类别人群使用中药所占比例、不同人群中草药食用方式等，总结出对暴露量影响重要的参数，并将反映中药暴露特点的重要参数(人类平均寿命、中药使用频率、暴露年限等)引入暴露量计算过程中，使其能够更加科学、合理地对菊三七中吡咯里西啶生物碱的风险进行评估，为菊三七的质量评价及安全用药提供科学依据，提高用药安全性。

(2)本发明在暴露评估模型参数确定过程中，是根据国家食品安全中心在11省进行的中药消费模式调查所获得的不同中药材使用模式下用药频率的分布，采用保守性原则，以p95百分位数为基点，确定中药材使用频率的p95值为90天，暴露年限为20年，人类平均寿命按照国际一般要求，为365天×70年。

(3)本发明提供的风险评估方法在对菊三七中吡咯里西啶生物碱含量进行测定时，提供了一种全新的方法，该方法能够准确测定菊三七中千里光菲灵碱、n-氧化千里光菲灵碱、全缘千里光碱、千里光宁碱、n-氧化全缘千里光碱和n-氧化千里光宁碱6种吡咯里西啶生物碱的含量，使获得的咯里西啶生物碱含量的结果更加准确，进一步保证菊三七风险评估的准确性。

附图说明

图1为混合对照品溶液的mrm色谱图；

图2为供试品溶液(编号s1)的mrm色谱图；

图中，1为千里光菲灵碱(seneciphylline)；2为n-氧化千里光菲灵碱(seneciphyllinen-oxide)；3.为全缘千里光碱(integerrimine)；4为千里光宁碱(senecionine)；5为n-氧化全缘千里光碱(integerriminen-oxide)；6为n-氧化千里光宁碱(senecioninen-oxide)。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作以进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明所述的技术方案，但并不以此限制本发明。

菊三七含量测定所需仪器与材料

watersacquity^tmuplc色谱仪(waters公司)；watersxevotq-s三重四极杆串联质谱检测器(waters公司)；kq-500de型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；xs105du十万分之一电子分析天平(mettlertoledo公司)；mili-q超纯水系统(millipore公司)。cleanetpcx固相萃取小柱(500mg/6ml，天津博纳艾杰尔科技有限公司)。

对照品千里光菲灵碱(批号11783)、n-氧化千里光菲灵碱(批号13878)、全缘千里光碱(批号11335)和n-氧化全缘千里光碱(批号11432)购于phytolabgmbh公司，千里光宁碱(批号chb181120)和n-氧化千里光宁碱(批号chb181215)购于成都克洛玛生物科技有限公司，纯度均大于98％；乙腈、甲醇、甲酸和甲酸铵均为质谱级(fisher公司)，其他试剂为分析纯。

菊三七样品共6批，(编号分别标记为s1～s6)分别采自云南省、贵州省和四川省，经中国食品药品检定研究院昝珂副研究员鉴定为菊三七gynurajaponica(thunb.)juel.的干燥块根。

实施例1

菊三七中吡咯里西啶生物碱的风险评估方法，包括以下步骤：

步骤1、根据中国人群中药的使用特点，建立暴露评估模型；

当菊三七为内服时，所述暴露评估模型为：

exp＝(ef×ed×ir×c)/(at×w)

其中，ef为用药频率，单位为天/年；ed为暴露年限；ir为菊三七每日用量，单位为g；c为中药材中吡咯里西啶生物碱总量的测定值，单位为mg/kg；at为平均寿命天数；w为人体平均体重，单位为kg；

当菊三七为外用时，所述暴露评估模型为：

exp＝(ef×ed×ir×c×v)/(at×w)

其中，ef为用药频率，单位为天/年；ed为暴露年限；ir为菊三七每日用量，单位为g；c为菊三七中吡咯里西啶生物碱总量的测定值，单位为mg/kg；v为透皮吸收系数，仅针对菊三七外用的情况；at为平均寿命天数；w为人体平均体重，单位为kg；

步骤2、根据中国人群中药消费情况及医院处方系统中药材使用情况，确定暴露评估模型的暴露评估参数；其中，所述ef为90天/年，ed为20年，ir参照药典或地方标准用量，云南省标准规定菊三七用量为3～9g；v根据风险最大化原则为100％,仅针对菊三七外用的情况；at为25550天，w为70kg。

步骤3、对菊三七中吡咯里西啶生物碱的含量进行测定，具体包括以下步骤：

步骤3.1、混合对照品溶液

精密称取千里光菲灵碱、n-氧化千里光菲灵碱、全缘千里光碱、千里光宁碱、n-氧化全缘千里光碱和n-氧化千里光宁碱的对照品适量，分别以50％甲醇水配成质量浓度分别为0.988、0.984、0.948、0.968、0.992和1.006μg·ml^–1的对照品储备液。分别精密称取各对照品储备液适量，用50％甲醇水配成质量浓度分别为19.76、19.68、18.96、19.36、19.84和50.30ng·ml^–1的混合对照品溶液；

步骤3.2、供试品溶液

取菊三七适量(0.2g)，粉碎过4号筛，分别精密称取6批样品粉末1.0g，置于具塞锥形瓶中，加入0.05mol·l^–1硫酸溶液40ml，超声(300w，40khz)提取30min，过滤，取续滤液10ml进行spe-pcx的富集纯化，spe-pcx富集纯化具体流程：甲醇5ml活化spe-pcx小柱，0.05mol·l^–1硫酸溶液5ml平衡小柱，将上述续滤液10ml上柱，以甲醇10ml淋洗除杂，8％氨水-甲醇溶液10ml洗脱，收集洗脱液并浓缩至1ml左右，用50％甲醇水稀释定容至100ml量瓶中，过0.22μm微孔滤膜，即得6批菊三七的供试品溶液；

步骤3.3、测定

分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱与质谱联用仪，测定，记录30min的色谱图，依据外标法计算千里光菲灵碱、n-氧化千里光菲灵碱、全缘千里光碱、千里光宁碱、n-氧化全缘千里光碱和n-氧化千里光宁碱的含量，结果见表2。

其中，色谱-质谱条件——色谱柱：watersacquityuplchsst3色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm)；柱温：40℃；流动相：0.05％甲酸和2.5mmol·l^–1甲酸铵的水溶液(a)及含0.05％甲酸和2.5mmol·l^–1甲酸铵的乙腈(b)，梯度洗脱(0～20min，0％b→8％b；20～30min，8％b)；流速：0.3ml·min^–1；进样量：1μl；质谱离子源为电喷雾离子化源(esi)，正离子，多反应监测模式(mrm)，毛细管电压3.0kv，离子源温度150℃，去溶剂温度500℃，6种吡咯里西啶生物碱的质谱检测参数见表1，混合对照品及样品s1的mrm色谱图见图1、图2。

表1目标成分的质谱检测参数

表26批菊三七中吡咯里西啶生物碱的含量测定结果(μg·g^-1,n＝2)

步骤4、根据步骤1的暴露评估模型，结合步骤2、步骤3的数据计算得到暴露量；

步骤5、采用暴露限值moe法进行风险评估，若moe>10000，认为菊三七中吡咯里西啶生物碱的健康风险较低；若moe≤10000,认为菊三七中吡咯里西啶生物碱的健康风险较高，应予以关注，moe计算公式如下；

moe＝bmdl/exp

其中，moe为暴露限值，exp为计算得到的暴露量，单位为μg/kg·bw；bmdl为吡咯里西啶生物碱的基准剂量下限值，吡咯里西啶生物碱的bmdl10为237μg/kgbw/day(参考文献：efsa,2017.risksforhumanhealthrelatedtothepresenceofpyrrolizidinealkaloidsinhoney,tea,herbalinfusionsandfoodsupplements.efsaj.15.)，风险评估结果见表3。

表36批菊三七的风险评估结果

菊三七中吡咯里西啶生物碱含量测定方法的方法学考察

1、线性关系考察和检测下限、定量下限测定和灵敏度考察

精密吸取各对照品储备液0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0ml，分别置于6个10ml量瓶中，加10％乙腈定容至刻度，摇匀，即得各系列浓度的对照品混合溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，进样。按照上述色谱-质谱条件进行测定。以对照品的峰面积y为纵坐标，对应的浓度x为横坐标，进行线性回归。以定量离子的色谱峰信噪比s/n≥3对应的最低浓度为检测下限(lod)，以定量离子色谱峰信噪比≥10对应的最低浓度为定量下限(loq)，结果见表4。

表4线性方程、线性范围、检测下限和定量下限

2、精密度试验精密吸取“3.1”项的混合对照品溶液1μl，连续进样6次，记录峰面积。结果千里光菲灵碱、n-氧化千里光菲灵碱、全缘千里光碱、千里光宁碱、n-氧化全缘千里光碱和n-氧化千里光宁碱峰面积的rsd(n＝6)分别为2.5％、3.2％、2.5％、2.8％、2.4％和2.6％，表明仪器精密度良好。

3、稳定性试验取同一份供试品溶液(样品s1)，分别于0、2、4、8、12、24h进样测定。结果千里光菲灵碱、n-氧化千里光菲灵碱、全缘千里光碱、千里光宁碱、n-氧化全缘千里光碱和n-氧化千里光宁碱峰面积的rsd(n＝6)分别为2.0％、2.9％、2.3％、2.6％、2.8％和1.8％，表明供试品溶液在24h内稳定。

4、重复性试验按照“3.2”项下方法制备样品s1的供试品溶液6份，分别进样测定。结果千里光菲灵碱、n-氧化千里光菲灵碱、全缘千里光碱、千里光宁碱、n-氧化全缘千里光碱和n-氧化千里光宁碱的平均含量分别为119.88、4.91、19.17、237.448、101.42和352.12μg·g^-1，rsd均小于4.0％，表明该方法的重复性良好。

5、加样回收试验精密称取千里光菲灵碱、n-氧化千里光菲灵碱、全缘千里光碱、千里光宁碱、n-氧化全缘千里光碱和n-氧化千里光宁碱的对照品适量，精密称定，分别加50％甲醇水配制成上述6个成分质量浓度依次为9.88、39.36、1.896、19.36、9.92和40.24μg·ml^–1的各对照品溶液。取已知含量的样品(s1)粉末6份，每份各约0.1g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入上述6个对照品溶液各1.0ml，再加入0.05mol·l^–1硫酸溶液34ml，按照“3.2”项方法平行制备供试溶液，进样分析，计算回收率。结果千里光菲灵碱、n-氧化千里光菲灵碱、全缘千里光碱、千里光宁碱、n-氧化全缘千里光碱和n-氧化千里光宁碱平均加样回收率(n＝6)分别为86.5％、89.2％、90.3％、91.2％、88.4％和93.5％，rsd分别为3.1％、3.3％、2.8％、3.4％、2.9％和2.5％。

上述吡咯里西啶生物碱的化学结构式如下：

1.千里光菲灵碱(seneciphylline)；2.n-氧化千里光菲灵碱(seneciphyllinen-oxide)；3.全缘千里光碱(integerrimine)；4.千里光宁碱(senecionine)；5.n-氧化全缘千里光碱(integerriminen-oxide)；6.n-氧化千里光宁碱(senecioninen-oxide)。

本发明考察了不同配比乙腈-水以及含有甲酸和甲酸铵等含酸溶液作为流动相对吡咯里西啶生物碱的分离能力的影响。由于化合物3～4和5～6均为顺反异构体，分子离子峰和质谱裂解行为基本一致，需要通过色谱柱将其分开，通过调节梯度比例25min内这2组非对映异构体均达到基线分离，最终确定流动相为含0.05％甲酸和2.5mmol·l^–1甲酸铵的水溶液及含0.05％甲酸和2.5mmol·l^–1甲酸铵的乙腈，梯度洗脱；在该系统下6个成分得到较好的保留和分离。

本发明提供的uplc-ms/ms法同时测定菊三七中的6个主要吡咯里西啶生物碱的含量，方法简便、准确且重复性好。菊三七中的n-氧化千里光菲灵碱、n-氧化全缘千里光碱和n-氧化千里光宁碱含量为首次报道。本发明通过测定6个批次的菊三七中6个吡咯里西啶生物碱的含量结果，表明千里光菲灵碱、n-氧化千里光菲灵碱、全缘千里光碱、千里光宁碱、n-氧化全缘千里光碱和n-氧化千里光宁碱的含量范围分别为89.65～125.32、237.63～391.91、19.17～36.25、189.61～288.65、63.25～101.42、218.65～392.12μg·g^-1。