一种用于检测甲壳类原肌球蛋白的夹心式传感器及其应用

1.本发明涉及生物分析技术领域，具体涉及一种用于检测甲壳类原肌球蛋白的夹心式传感器及其应用。


背景技术：

2.甲壳类原肌球蛋白的检测方法主要有elisa、pcr、rt
‑
pcr等技术，这些技术存在检测时间长、灵敏度和精确度不高(易出现假阳性)等问题。因此，原肌球蛋白的检测方式有待改进。
3.核酸适配体是一种对靶物质有特异性识别能力的单链的核苷酸，无毒、化学稳定性好、容易被修饰、序列设计灵活多变、无免疫原性及可以高亲和性和特异性的结合几乎任何目标分子，有望成为抗体的替代物，在生物分析领域有巨大的应用潜力和多样性的应用范围。
4.分子印迹聚合物作为一种识别原件，能够高特异性和选择性的识别模板分子。但相较小分子的印迹，印迹模板体积大，结构复杂且容易发生变化，印迹的难度也大。因此，对于大部分的蛋白质大分子进行印迹仍存在许多难题。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种用于检测甲壳类原肌球蛋白的夹心式传感器及其应用。该传感器能快速、灵敏、专一的检测出甲壳类原肌球蛋白。
6.为此，在本发明的第一个方面，本发明提出了一种用于检测甲壳类原肌球蛋白的夹心式传感器，其包括分子印迹微球和核酸适配体探针，所述核酸适配体探针具有seq id no:1所示的核苷酸序列。
7.根据本发明的一种夹心式传感器，其不仅具有传统荧光探针检测的优点，且可特异性识别致敏原，该夹心式传感器将碳量子点的高灵敏的发光性能和核酸适配体高特异性识别抗原的性能相结合，从而可高效的体外检测甲壳类原肌球蛋白致敏原。
8.可选地，所述分子印迹微球的制备包括：
9.将fe3o4磁性微球和原肌球蛋白标准品溶于tris缓冲液中，于室温振荡孵育2h后加入多巴胺，继续在室温下振荡孵育3h，清洗，溶于pbs中，再加入多肽溶液，于室温振荡孵育24h后，用sds的乙酸溶液洗涤磁性微球，再用蒸馏水冲洗，得到分子印迹微球。
10.进一步地，将100mg fe3o4磁性微球和20mg原肌球蛋白标准品溶解于20ml 10mm ph 8.0的tris缓冲液中。
11.进一步地，所述多肽的氨基酸序列为ekekekeppppc。
12.进一步地，按照体积比为10:1加入0.71mm的所述多肽溶液。
13.进一步地，所述多巴胺的加入量为40mg。
14.进一步地，用3％(v/v)含0.1％(w/v)sds的乙酸溶液洗涤磁铁收集的磁性微球。
15.在本发明的第二方面，本发明提出了上述夹心式传感器检测甲壳类原肌球蛋白的方法，其包括：
16.取2mg分子印迹微球溶于pbs缓冲液中，超声30min，确保分子印迹微球充分分散，加入待测样品溶液，置于25℃摇床中孵育2h，再加入200pmol核酸适配体探针，于25℃震荡孵育1.5h，pbs溶液清洗三次，磁分离复溶于1ml pbs溶液中，通过酶标仪测定370nm光激发下480nm处的荧光发射强度。
17.根据本发明实施例的检测方法，能快速、灵敏、专一的检测出甲壳类原肌球蛋白。
18.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
19.图1是分子印迹
‑
核酸适配体夹心式传感器的原理图；
20.图2是fe3o4@pdanps元素分析；
21.图3是fe3o4@pda nps与印迹fe3o4@tm
‑
pda nps扫描电镜图(sem)；
22.图4是印迹fe3o4@tm
‑
pda静态吸附曲线；
23.图5是印迹fe3o4@tm
‑
pda特异性吸附图；
24.图6是分子印迹
‑
核酸适配体夹心式传感器检测的特异性。
具体实施方式
25.以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
26.为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
27.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
28.结合图1，该夹心式传感器的原理是将分离富集元件(分子印迹微球)与信号元件(荧光适配体探针)相结合，共同构建分子印迹
‑
适配体夹心式生物传感器。利用分子印迹微球分离富集溶液中的原肌球蛋白，荧光适配体探针特异性识别原肌球蛋白，根据荧光信号的变化指示原肌球蛋白含量的变化。
29.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
30.实施例1
31.原肌球蛋白的制备：
32.(1)取50g南美白对虾肌肉，去虾头、尾、壳及肠线。
33.(2)将虾肌肉用小刀切成泥状，溶于buffer a(50mmol/l kcl和2mmol/l nahco3)中，充分均质后于4℃下抽提20min。
34.(3)将步骤(2)抽提后的溶液于4℃、10000r/min下离心20min后取沉淀，将沉淀重悬在10倍体积的buffer a中，4℃、10000r/min离心20min后取沉淀，重复5次。
35.(4)将步骤(3)获得的沉淀经预冷丙酮充分洗涤至无色后用六层纱布过滤取沉淀，沉淀于室温晾干，除去脂肪及脂溶性色素等杂质得到对虾丙酮粉。
36.(5)将对虾丙酮粉溶于buffer b(0.02mol/l的tris
‑
hcl、1mol/l的kcl和0.1mmol/l的dtt，ph 7.5)中，抽提72h。
37.(6)将步骤(5)获得的抽提液用六层纱布过滤取滤液，滤液隔水加热20min。
38.(7)将步骤(6)加热后的滤液于4℃、10000r/min下离心20min后，取上清液，按每100ml上清液加入16.4g硫酸铵的用量缓慢加入硫酸铵，使滤液的硫酸铵终浓度为30％，于4℃下静置1h。
39.(8)将静置后的液体于4℃、10000r/min下离心20min后取沉淀，采用1mol/l pbs复溶，获得原肌球蛋白液。
40.(9)将原肌球蛋白液用deae sepharose f.f.阴离子交换柱，0.5mol/l nacl溶液梯度洗脱，收集洗脱产物，得到原肌球蛋白，备用。
41.实施例2
42.1、核酸适配体的筛选：采用毛细管电泳
‑
指数富集配体进化技术(ce
‑
selex)法筛选核酸适配体
43.随机核苷酸(dna)文库和引物的构建：随机dna文库，上游引物，下游引物均出自生工生物工程(上海)股份有限公司合成(中国)；长度为75nt的随机单链核苷酸(ssdna)文库如下：
[0044]5′‑
tactaacggt acaagcta
‑
n40
‑
aacgttgacctagaagc
‑3′
；
[0045]
中间为40nt的随机序列，两端有长度为8nt和17nt的固定序列(引物结合区域)。
[0046]
上游引物：5
′‑
tactaacggtacaagcta
‑3′
；
[0047]
下游引物：5
′‑
gcttctaggtcaacgtt
‑3′
；
[0048]
构建甲壳类原肌球蛋白随机ssdna文库：20μl上述的随机ssdna文库(100μmol/l)与500μl硼砂
‑
硼酸盐缓冲液(100mmol/l，ph＝8.2)混合，95℃热变性10min，而后立即冰水冷却10min，得到甲壳类原肌球蛋白随机ssdna文库，将甲壳类原肌球蛋白ssdna文库与原肌球蛋白按最终浓度比2：1混合，混合成200μl体系，25℃下孵育30min，得到混合溶液。将上述混合溶液通过毛细管电泳法筛选，获得核苷酸序列为seq id no:1～n，将所得适配体以其各自的核苷酸序列为引物进行pcr扩增，并进行平衡解离常数的测定，选择解离常数最小的，即获得特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体seq id no:1
[0049]
表1适配体序列及解离常数
[0050][0051]
2、核酸适配体探针的制备：
[0052]
碳量子点的制备：取苹果酸6g于带盖烧杯中，205℃加热直到固体完全融化，维持15min后冷却至室温，向液体中加入0.25m氢氧化钠50ml，此后用0.05m naoh调节溶液ph至6.0，用1kda透析膜透析3d；利用真空蒸发器在40℃下浓缩碳量子点溶液，获得碳量子点。
[0053]
核酸适配体探针的制备：取上述旋蒸后的碳量子点20μl于1ml ep管中，加入40μl2μmol/l上述获得的氨基核酸适配体(seq id no:1)，于25℃恒温摇床中孵育2h，获得核酸适配体探针。
[0054]
实施例3
[0055]
分子印迹微球的制备：
[0056]
将100mg fe3o4磁性微球和20mg原肌球蛋白(tm)标准品溶解于20ml 10mm tris缓冲液(ph 8.0)中，于室温振荡孵育2h，随后，向上述混合溶液中加入40mg多巴胺(pda)，在室温下继续振荡孵育3h，用蒸馏水充分清洗后，溶于pbs中至终浓度为5mg/ml，此后按照体积比10:1加入0.71mm的ekekekeppppc多肽溶液，于室温振荡孵育24h。用3％(v/v)含0.1％(w/v)sds的乙酸溶液洗涤磁铁收集的磁性微球5次，再用蒸馏水彻底冲洗8次，经多次洗涤以完全清洗掉模板分子(原肌球蛋白分子)，即得分子印迹微球(fe3o4@tm
‑
pda nps)。
[0057]
实施例4
[0058]
1、分子印迹微球元素分析
[0059]
用elementar vario el cube对分子印迹微球进行元素分析。
[0060]
结果如图2所示，fe3o4@pda nps的表面的碳含量约为8.35％。因此，可以确定在fe3o4粒子的表面存在pda涂层。
[0061]
2、fe3o4@pda nps与分子印迹微球(fe3o4@tm
‑
pda nps)的透射电镜分析，
[0062]
结果如图3所示，fe3o4@pda nps比印迹fe3o4@tm
‑
pda nps微球更加光滑，其形状表现为较规则的圆形，表面没有裂痕和沟壑。从图3b中可以看出，印迹fe3o4@tm
‑
pda nps微球的表面存在裂痕，表面的裂痕表示为原肌球蛋白分子的结合位置。
[0063]
3、分子印迹微球(fe3o4@tm
‑
pda nps)与原肌球蛋白静态结合
[0064]
将2mg分子印迹微球悬浮于1.0ml不同浓度的原肌球蛋白溶液(ph 7.5tris缓冲液，含0.01％sds)中，并于室温振荡孵育2h，收集磁分离后的上清液，用bradford试剂盒测定上清液中的原肌球蛋白含量；通过原肌球蛋白总量与上清液中原肌球蛋白含量之差计算分子印迹微球结合的原肌球蛋白含量。
[0065]
结果如图4所示，印迹fe3o4@tm
‑
pda nps结合原肌球蛋白的量，随初始原肌球蛋白浓度的增加而增加，当蛋白浓度增加到一定量时，蛋白吸附量逐渐达到饱和。此外，印迹fe3o4@tm
‑
pda nps与fe3o4@pda nps相比表现出了明显的原肌球蛋白吸附能力。利用scatchard方程对静态吸附实验数据进行进一步处理，以评判印迹fe3o4@tm
‑
pda nps结合原肌球蛋白的能力，分析结果表明，印迹fe3o4@tm
‑
pda nps的解离常数为77.46μg/ml，fe3o4@pda nps的解离常数为353.8μg/ml，由于解离常数越小表明亲和性越强，可见印迹fe3o4@tm
‑
pda nps对tm的亲和性优于fe3o4@pda nps。
[0066]
4、分子印迹微球(fe3o4@tm
‑
pda nps)选择性识别致敏原分析
[0067]
对于特异性测试，将2mg分子印迹微球悬浮于1.0ml浓度为2μg/ml的原肌球蛋白、牛血清白蛋白、除去原肌球蛋白的虾的全蛋白、鸡卵白蛋白和虾精氨酸激酶溶液(ph 7.5tris缓冲液，含0.01％sds)中，并于室温振荡孵育2h，磁分离后提取上清液，收集磁分离
后的上清液，用bradford试剂盒测定上清液中的蛋白含量。蛋白结合量为添加的蛋白总质量与结合后溶液中剩余蛋白质量之差。
[0068]
结果如图5所示，其中，5种蛋白初始浓度均为50μg/ml。对于fe3o4@pda nps而言，存在一定的蛋白吸附量，但不同蛋白之间并无明显差异，证明这些蛋白吸附均为非特异性吸附。针对印迹fe3o4@tm
‑
pda nps组进行t检验分析和单因素方差分析，分析可知印迹fe3o4@tm
‑
pda nps与fe3o4@pda nps在原肌球蛋白的结合量上具有显著差异(p＜0.05)，且印迹fe3o4@tm
‑
pda nps原肌球蛋白的结合量与其他蛋白的结合量同样具有显著差异(p＜0.05)，印迹fe3o4@tm
‑
pda nps原肌球蛋白的结合量与其他蛋白相比最高比率可达4.9倍。以上结果表明，印迹fe3o4@tm
‑
pda nps可高特异性识别原肌球蛋白。
[0069]
5、分子印迹
‑
核酸适配体夹心式传感器特异性分析
[0070]
取分子印迹微球(fe3o4@tm
‑
pda nps)2mg溶于pbs缓冲液中，超声30min，确保分子印迹微球充分分散，加入预先稀释好的含有2μg样品蛋白溶液(精氨酸激酶(ak)或原肌球蛋白(tm)，牛血清蛋白(bsa)或鸡卵清蛋白(ova)或去除原肌球蛋白的虾的全蛋白(protein without tm))，置于25℃摇床中孵育2h。此后，向混合体系中加入200pmol适配体荧光探针，于25℃震荡孵育1.5h。通过酶标仪测定370nm激发波长下480nm处的荧光强度，按照蛋白浓度
‑
荧光值标准曲线y＝22411*x+1556(r2＝0.9933)确定对应浓度，对比检测方法的特异性。
[0071]
结果如图6所示，加入相同的量的原肌球蛋白时测得的数据与其他蛋白相比，测得的荧光值差异显著，表明其他蛋白对原肌球蛋白的检测没有明显的干扰，证明方法特异性良好。检测数据使用软件graphpad prism 7.00进行独立样本t检验分析和单因素方差分析，显著性差异以*表示，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
[0072]
实施例5
[0073]
1、甲壳类全蛋白原肌球蛋白检测：
[0074]
提取甲壳类(包括：中国对虾，鹰爪虾，南美白对虾，日本沼虾和刀额新对虾)全蛋白并用bca法定量，取1ml加入到超声混匀后的分子印迹微球(fe3o4@tm
‑
pda nps)溶液中，而后加入核酸适配体探针孵育1.5h，孵育完成后，通过酶标仪测定370nm激发下480nm发射的荧光强度，将荧光值代入标准曲线y＝22411*x+1556(r2＝0.9933)中计算实际样品中原肌球蛋白含量。
[0075]
结果如表2所示：
[0076]
表2全蛋白中原肌球蛋白的检测含量
[0077][0078]
结果说明原肌球蛋白浓度的检测结果和其在虾全蛋白中的比例与其他文献中所描述的类似，存在一定差异可能是因为不同产品批次之间的固有差异及部分实验误差，综上证明此分子印迹
‑
核酸适配体夹心式传感器检测方法具有一定可行性。
[0079]
2、虾加工制品中原肌球蛋白的检测。
[0080]
将虾加工制品(虾味饺、虾球、虾滑、虾皮和虾丸)切碎置于烧杯中，称取质量。随后，加入浸提液(含50mm kcl及2mm nahco3的水溶液)充分均质，直至无颗粒状沉淀，于4℃浸提6h，浸提液在4℃、8000r/min下离心20min，收集上清液。
[0081]
分子印迹微球(fe3o4@tm
‑
pda nps)超声混匀后，分别加入上述1ml虾加工制品的上清液进行孵育2h，磁分离后加入200pmol核酸适配体探针孵育1.5h，孵育完成后，用pbs溶液清洗三次，磁分离复溶于1ml pbs溶液中，通过酶标仪测定370nm光激发下480nm处的荧光发射强度，并利用标准曲线y＝22411*x+1556(r2＝0.9933)计算分离提取的原肌球蛋白含量。
[0082]
结果如表3所示：
[0083]
表3虾加工制品中原肌球蛋白的检测含量
[0084][0085][0086]
原肌球蛋白浓度的检测结果表明在虾丸，虾滑和虾味饺中原肌球蛋白浓度较高，尤其是虾丸中，这也与这些类虾加工制品的加工原料和处理方式相关。而在虾皮中检测到较低量的原肌球蛋白浓度，这可能是虾皮上残留的虾肉所致，而较低的原肌球蛋白浓度也侧面证明本文中分子印迹
‑
核酸适配体夹心式传感器的检测准确性。
[0087]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
[0088]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。