桃核承气汤特征图谱的构建方法与流程

1.本发明涉及中药质量分析检测技术领域，尤其涉及一种桃核承气汤特征图谱的构建方法。


背景技术：

2.桃核承气汤出自汉代张仲景的《伤寒论》：“太阳病不解，热结膀胱，其人如狂，血自下，下者愈。其外不解者，尚未可攻，当先解其外；外解已，但少腹急结者，乃可攻之，宜桃核承气汤。桃仁五十个(去皮尖)，大黄四两，桂枝二两(去皮)，甘草二两(炙)，芒硝二两。上五味，以水七升，煮取二升半，去滓，内芒硝，更上火，微沸下火，先食温服五合，日三服。”桃核承气汤在临床上的应用十分广泛，不仅局限于太阳蓄血证的少腹胀满疼痛，大便色黑，小便自利，谵语发狂等症状，也广泛运用于脑外伤后遗症，妇科的痛经、闭经，以及肾系病证的癃闭，前列腺炎或者前列腺增生导致的癃闭等。桃核承气汤目前在国内尚未开发成为中成药，但在日本已被开发为汉方制剂供临床广泛使用，作为汉方药在药店销售排名前列，该方在我国具有很强的开发价值。
3.目前，对桃核承气汤的研究主要集中在药理学的研究方面，对其汤剂的物质基础、提取工艺、多指标成分含量测定及特征图谱研究较少，缺少系统性。且对于如何衡量大生产制剂与传统汤剂质量的一致性也研究较少。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于，提供一种桃核承气汤特征图谱的构建方法，该方法重现性良好，准确可靠，可为桃核承气汤大生产质量控制提供数据基础，保证桃核承气汤产品质量的稳定性和可控性。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种桃核承气汤特征图谱的构建方法，其包括：
6.(1)分别取没食子酸对照品、儿茶素对照品、苦杏仁苷对照品、表儿茶素没食子酸酯对照品、甘草苷对照品、芹糖甘草苷对照品、桂皮醛对照品、肉桂酸对照品、大黄酚
‑1‑
o
‑
葡萄糖苷对照品、大黄酚
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷对照品、大黄素
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷对照品、大黄酸对照品、甘草酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品适量，加入溶剂溶解或提取，制得对照品溶液；
7.(2)取桃核承气汤，加提取溶剂提取，制得供试品溶液；
8.(3)取预设量的对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相a，磷酸水溶液为流动相b进行梯度洗脱，建立桃核承气汤的特征图谱。
9.作为上述技术方案的改进，所述梯度洗脱按下述程序进行：
10.0～5min，流动相a从1％
→
8％，流动相b从99％
→
92％；
11.5～21min，流动相a从8％
→
23％，流动相b从92％
→
77％；
12.21～35min，流动相a从23％
→
31％，流动相b从77％
→
69％；
13.35～45min，流动相a从31％
→
55％，流动相b从69％
→
45％；
14.45～51min，流动相a从55％
→
65％，流动相b从45％
→
35％；
15.51～56min，流动相a从65％
→
83％，流动相b从35％
→
17％；
16.56～65min，流动相a从83％
→
100％，流动相b从17％
→
0％。
17.作为上述技术方案的改进，步骤(3)中，分别吸取对照品溶液和供试品溶液各1～3μl，注入液相色谱仪进行检测，其中，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm，柱温为30～38℃；所述液相色谱仪以甲醇为流动相a，以0.15％～0.25％的磷酸水溶液为流动相b，流速为0.25～0.36ml/min，检测波长为220～290nm。
18.作为上述技术方案的改进，步骤(3)中，分别吸取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪进行检测，其中，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm，柱温为38℃；所述液相色谱仪以甲醇为流动相a，以0.2％的磷酸水溶液为流动相b，流速为0.3ml/min。
19.作为上述技术方案的改进，步骤(3)中，检测时间为0～30分钟时，检测波长为220nm；检测时间为30～45分钟时，检测波长为290nm，检测时间为45～65分钟时，检测波长为260nm。
20.作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，分别取没食子酸对照品、儿茶素对照品、苦杏仁苷对照品、表儿茶素没食子酸酯对照品、甘草苷对照品、芹糖甘草苷对照品、桂皮醛对照品、肉桂酸对照品、大黄酚
‑1‑
o
‑
葡萄糖苷对照品、大黄酚
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷对照品、大黄素
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷对照品、大黄酸对照品、甘草酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含没食子酸15μg、儿茶素100μg、苦杏仁苷30μg、表儿茶素没食子酸酯50μg、甘草苷30μg、芹糖甘草苷70μg、桂皮醛10μg、肉桂酸10μg、大黄酚
‑1‑
o
‑
葡萄糖苷30μg、大黄酚
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷40μg、大黄素
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷50μg、大黄酸20μg、甘草酸100μg、大黄素10μg、大黄酚10μg的溶液，即得对照品溶液。
21.作为上述技术方案的改进，步骤(2)中，所述提取溶剂为20～100％甲醇，提取时间为10～30min，提取方式为超声提取。
22.作为上述技术方案的改进，步骤(2)包括：
23.取桃核承气汤冻干粉0.15～0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇10ml，称定重量，分别取出，采用功率为200～300w，频率为40～50khz的超声波处理20min，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
24.作为上述技术方案的改进，所述桃核承气汤的特征图谱包括15个特征峰；其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉桂酸峰，峰9为大黄酚
‑1‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰11为大黄素
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰。
25.作为上述技术方案的改进，所述桃核承气汤由以下重量份的组分组成：桃仁15份、大黄55.2份、肉桂27.6份、甘草27.6g、芒硝27.6g。
26.作为上述技术方案的改进，所述桃核承气汤的制备方法为：取桃仁、大黄、肉桂和
甘草加水1200～1500ml浸泡，武火煮沸，文火沸腾至药液为400～600ml，滤过后加入芒硝，加热煮沸即得。
27.作为上述技术方案的改进，所述桃核承气汤的制备方法为：取桃仁、大黄、肉桂和甘草加水1400ml浸泡，武火煮沸，文火沸腾至药液为500ml，滤过后加入芒硝，加热煮沸即得。
28.实施本发明，具有如下有益效果：
29.本发明建立了桃核承气汤的特征图谱，共标定了22个特征峰，可充分展示桃核承气汤的化学成分的特征，特征峰信息量丰富，可全面地反映桃核承气汤的质量信息，从而能够达到全面、有效地控制桃核承气汤产品质量的目的。同时，本发明的方法稳定，准确可靠，实现对多个药味的特征成分的质量监控。
附图说明
30.图1是本发明中桃核承气汤采用220nm波长测定时的特征图谱；
31.图2是本发明中桃核承气汤采用260nm波长测定时的特征图谱；
32.图3是本发明中桃核承气汤采用290nm波长测定时的特征图谱；
33.图4是本发明桃核承气汤采用乙腈
‑
磷酸作为流动相测定时的特征图谱；
34.图5是本发明桃核承气汤采用甲醇
‑
水作为流动相测定时的特征图谱；
35.图6是本发明桃核承气汤采用甲醇
‑
磷酸作为流动相测定时的特征图谱；
36.图7是本发明桃核承气汤采用不同色谱柱测定时的特征图谱；
37.图8是本发明桃核承气汤采用不同柱温测定时的特征图谱；
38.图9是本发明桃核承气汤采用不同流速测定时的特征图谱；
39.图10是本发明桃核承气汤特征图谱专属性考察中桃核承气汤、桃仁对照药材、缺桃仁阴性样品的特征图谱；其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉桂酸峰，峰9为大黄酚
‑1‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚
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o
‑
葡萄糖苷峰，峰11为大黄素
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰；
40.图11是本发明桃核承气汤特征图谱专属性考察中桃核承气汤、大黄对照药材、缺大黄阴性样品的特征图谱；其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉桂酸峰，峰9为大黄酚
‑1‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰11为大黄素
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰。
41.图12是本发明桃核承气汤特征图谱专属性考察中桃核承气汤、肉桂对照药材、缺肉桂阴性样品的特征图谱；其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉桂酸峰，峰9为大黄酚
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o
‑
葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚
‑8‑
o
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葡萄糖苷峰，峰11为大黄素
‑8‑
o
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葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰；
42.图13是本发明桃核承气汤特征图谱专属性考察中桃核承气汤、甘草对照药材、缺甘草阴性样品的特征图谱；其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉
桂酸峰，峰9为大黄酚
‑1‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰11为大黄素
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰；
43.图14是20批次桃核承气汤样品的特征图谱叠加图；其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉桂酸峰，峰9为大黄酚
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o
‑
葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚
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o
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葡萄糖苷峰，峰11为大黄素
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰；
44.图15是桃核承气汤特征图谱对照品指认色谱峰叠加图，其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉桂酸峰，峰9为大黄酚
‑1‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰11为大黄素
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰；
45.图16是桃核承气汤供试品溶液总离子流质谱与紫外液相色谱图。
具体实施方式
46.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。
47.本发明的桃核承气汤出自伤寒论，现有记载中一般认为其由桃仁、大黄、桂枝、炙甘草、芒硝组成。基于古籍文献进行多方面循古考证，所确定的桃核承气汤方剂如下：燀桃仁(山桃)15.0g、大黄(掌叶大黄)55.2g、肉桂27.6g、炒甘草27.6g、芒硝27.6g。其中，各药材经鉴定符合2020年版《中国药典》一部相关项下规定。需要说明的是，张仲景对《伤寒论》中药物下方标注的炙，与现代药典中的清炒法最为接近，古代不加辅料炒制分为炒黄和炒炭两种方法，结合2020年版《中国药典》并参照了其他地方的炮制规范，确定了桃仁为燀桃仁或山桃仁，大黄为掌叶大黄，桂枝为肉桂，炙甘草为炒甘草。
48.进一步的，基于古籍文献考证确定桃核承气汤传统汤剂的制法为：取除芒硝外的上述四味，加水1400ml，浸泡，武火煮沸，文火保持沸腾至药液约500ml，筛网滤过，滤液加入芒硝，加热至微沸，得桃核承气汤汤剂。
49.本发明中所采用的桃核承气汤样品均为桃核承气汤冻干粉，具体的，将桃核承气汤汤剂搅匀分装棕色西林瓶中，转移至真空循环泵真空冷冻干燥机中冷冻干燥，取出，得冻干粉，即得桃核承气汤冻干粉。此外，为了全面地反映桃核承气汤的质量信息，发明人针对各药材收集了不少于3产地15个批次，并制备样品进行研究。
50.为了全面地反映桃核承气汤的质量信息，实现全面、有效地控制桃核承气汤产品质量，本发明提供了一种桃核承气汤特征图谱的建立方法，以下对其进行详细说明：
51.1仪器与试药
52.本发明所用到的仪器、试剂与试药信息如表1～表3所示：
53.表1仪器信息汇总表
[0054][0055]
表2试剂信息汇总表
[0056][0057][0058]
表3对照品信息
[0059]
[0060][0061]
表4 20批对应实物饮片组方信息表
[0062]
[0063]
[0064]
[0065][0066]
2色谱条件与参照物溶液、供试品溶液的制备
[0067]
2.1色谱条件
[0068]
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm，色谱柱：waters cortecs t3柱)；以甲醇为流动相a，以0.2％磷酸水溶液为流动相b，按表中的规定进行梯度洗脱；柱温为38℃；流速为每分钟0.3ml；进样量1μl，检测波长0
‑
30分钟为220nm，30
‑
45分钟为290nm，45
‑
65分钟为260nm。理论板数按儿茶素峰计算应不低于10000。
[0069]
表5梯度洗脱表
[0070][0071]
2.2对照品溶液的制备
[0072]
分别精密称取没食子酸对照品、儿茶素对照品、苦杏仁苷对照品、表儿茶素没食子酸酯对照品、甘草苷对照品、芹糖甘草苷对照品、桂皮醛对照品、肉桂酸对照品、大黄酚
‑1‑
o
‑
葡萄糖苷对照品、大黄酚
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷对照品、大黄素
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷对照品、大黄酸对照品、甘草酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含没食子酸15μg、儿茶素100μg、苦杏仁苷30μg、表儿茶素没食子酸酯50μg、甘草苷30μg、芹糖甘草苷70μg、桂皮醛10μg、肉桂酸10μg、大黄酚
‑1‑
o
‑
葡萄糖苷30μg、大黄酚
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷40μg、大黄素
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷50μg、大黄酸20μg、甘草酸100μg、大黄素10μg、大黄酚10μg的溶液，即得。
[0073]
2.3供试品溶液的制备
[0074]
取桃核承气汤冻干粉约0.25g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇10ml，超声处理(功率250w，频率45khz)20分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0075]
2.4测定法
[0076]
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。供试品特征图谱中应分别呈现与对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰。按中药色谱特征图谱相似度评价系统计算，供试品特征图谱与对照特征图谱的相似度不得低于0.90。供试品特征图谱中应呈现15个特征峰；其中，峰1为没食子酸峰，峰2为儿茶素峰，峰3为苦杏仁苷峰，峰4为表儿茶素没食子酸酯峰，峰5为甘草苷峰，峰6为芹糖甘草苷峰，峰7为桂皮醛峰，峰8为肉桂酸峰，峰9为大黄酚
‑1‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰10为大黄酚
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰11为大黄素
‑8‑
o
‑
葡萄糖苷峰，峰12为大黄酸峰，峰13为甘草酸峰，峰14为大黄素峰，峰15为大黄酚峰。
[0077]
3 色谱条件的确定
[0078]
3.1 最佳吸收波长的确定
[0079]
对不同吸收波长进行考察；吸收波长分别为220nm、260nm、290nm。采用waters cortecs t3(2.1
×
150mm，1.6μm)色谱柱；以甲醇为流动相a，以0.2％磷酸为流动相b，按表5中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；进样量为1μl；结果见图1～图3。
[0080]
实验结果表明，通过全波长扫描，发现在220～290nm之间，供试品色谱中较多色谱峰响应值较高，但桂皮醛、肉桂酸色谱峰在290nm有最大吸收，综合考虑所得色谱图在不同波长下各色谱峰的数目、丰度、分离程度，以及基线的漂移情况等因素，最终选择测试时间为0～30分钟时检测波长为220nm；测试时间为30～45分钟时，检测波长为290nm；测试时间为45～65分钟时，检测波长为260nm。
[0081]
3.2不同流动相的考察
[0082]
对流动相类型进行考察，分别选用乙腈
‑
磷酸、甲醇
‑
水、甲醇
‑
0.1vol％磷酸水溶液、甲醇
‑
0.2vol％磷酸水溶液作为流动相，并采用如表5的梯度洗脱程序进行考察。采用waters cortecs t3(2.1
×
150mm，1.6μm)色谱柱；流速为每分钟0.3ml；进样量为1μl；测试时间为0～30分钟时检测波长为220nm；测试时间为30～45分钟时，检测波长为290nm；测试时间为45～65分钟时，检测波长为260nm。结果见图4～图6。
[0083]
由图可知，采用乙腈
‑
磷酸为流动相，供试品色谱较多成分出峰较早，色谱峰分离差；以甲醇
‑
水为流动相，色谱峰较少，且分离度较差；以甲醇
‑
磷酸作为流动相，色谱图信息较为丰富，色谱峰分离度较好，基线较平稳，出峰时间适宜。最终确定以甲醇为流动相a，以0.2％磷酸水溶液为流动相b，按表5程序进行梯度洗脱。
[0084]
3.3不同色谱柱的考察
[0085]
分别比较了waters cortecs t3柱(1.6μm，150mm
×
2.1mm)、phenomenex omega 1.6μm ps c18 100a柱(1.6μm，150mm
×
2.1mm)、waters acquity uplc hss t3柱(1.8μm，150mm
×
2.1mm)三根色谱柱对桃核承气汤特征图谱色谱行为的影响。除色谱柱外，其他测试条件如2.1节。结果见图7。
[0086]
实验结果表明，不同色谱柱对桃核承气汤特征图谱色谱峰峰数、峰形、峰分离度存在较大影响，以waters cortecs t3柱(1.6μm，150mm
×
2.1mm)为色谱柱，色谱峰峰数稍多，且峰形较好，基线较平稳，故选择waters cortecs t3柱(1.6μm，150mm
×
2.1mm)为桃核承气汤特征图谱研究色谱柱。
[0087]
3.4不同柱温的考察
[0088]
分别考察了柱温为30℃、35℃、38℃、40℃对桃核承气汤特征图谱的影响。除柱温外，其他测试条件如2.1节。结果如图8所示。
[0089]
实验结果表明，不同色谱柱温度对桃核承气汤特征图谱的色谱行为存在一定影响，综合考虑色谱峰峰形、峰分离度、基线等情况，本实验确定桃核承气汤特征图谱研究的色谱柱温为38℃。
[0090]
3.5流速的考察
[0091]
分别考察了流速为每分钟0.25ml、每分钟0.3ml、每分钟0.35ml对桃核承气汤特征图谱色谱行为的影响。除流速外，其他测试条件如2.1节。结果如图9所示。
[0092]
结果显示，不同流速对桃核承气汤特征图谱色谱行为存在一定的影响，综合考虑色谱峰分离度、柱压等情况，研究确定桃核承气汤特征图谱流动相流速为每分钟0.3ml。
[0093]
3.6色谱条件的确定
[0094]
根据以上实验，确定色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(waters cortecs t3柱，柱长150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以甲醇为流动相a，以0.2％磷酸水溶液为流动相b，按上述表5的规定进行梯度洗脱；检测波长0
‑
30分钟为220nm，30
‑
45分钟为290nm，45
‑
65分钟为260nm，柱温为38℃；流速为每分钟0.3ml。
[0095]
4供试品溶液制备方法考察
[0096]
4.1提取溶剂考察
[0097]
分别考察了不同提取溶剂对桃核承气汤特征图谱的影响，选取20％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇作为提取溶剂，并比较不同提取溶剂特征图谱结果。
[0098]
其中，供试品溶液制备方法为：取桃核承气汤冻干粉制剂(批号：s9)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入20％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇10ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率45khz)20分钟，取出，放冷，再称定重量，用相应的提取溶剂补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。
[0099]
色谱条件为：以waters cortecs t3柱(1.6μm，150mm
×
2.1mm)为色谱柱，以甲醇为流动相a，0.2％磷酸为流动相b，按表5的规定进行梯度洗脱；柱温为38℃；流速为每分钟0.3ml；测试时间为0～30分钟时检测波长为220nm；测试时间为30～45分钟时，检测波长为290nm；测试时间为45～65分钟时，检测波长为260nm。
[0100]
桃核承气汤特征图谱不同提取溶剂考察结果见表6。
[0101]
表6桃核承气汤特征图谱提取溶剂考察结果表
[0102][0103]
实验结果：通过对比4种提取溶剂的特征图谱可发现，当提取溶剂为甲醇时，桂皮醛色谱不明显，当20％甲醇、50％甲醇、70％甲醇为提取溶剂时，桃核承气汤的特征图谱峰数一样，其中以70％甲醇为提取溶剂时，总峰面积/称样量较大，可充分表现桃核承气汤特征图谱，因此采用70％甲醇作为桃核承气汤特征图谱的提取溶剂。
[0104]
4.2提取时间考察
[0105]
考察不同提取时间对桃核承气汤特征图谱的影响，选取考察10分钟、20分钟、30分钟三个不同提取时间。
[0106]
取桃核承气汤冻干粉制剂(批号：s9)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇10ml，称定重量，分别取出，超声处理(功率250w，频率45khz)10分钟、20分钟、30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。
[0107]
色谱条件：以waters cortecs t3柱(1.6μm，150mm
×
2.1mm)为色谱柱，以甲醇为流动相a，0.2％磷酸为流动相b，按表5的规定进行梯度洗脱；柱温为38℃；流速为每分钟0.3ml；测试时间为0～30分钟时检测波长为220nm；测试时间为30～45分钟时，检测波长为290nm；测试时间为45～65分钟时，检测波长为260nm。
[0108]
桃核承气汤特征图谱不同提取溶剂考察结果见表7。
[0109]
表7桃核承气汤特征图谱提取时间考察结果表
[0110][0111]
结果显示：通过对比不同提取时间对桃核承气汤特征图谱影响发现，超声提取10分钟、30分钟总峰面积/称样量比超声提取20分钟小，为保证桃核承气汤提取完全且成分不损失，选择超声提取20分钟。
[0112]
4.3供试品溶液制备方法的确定
[0113]
根据上述实验结果，桃核承气汤特征图谱样品前处理方法确定为：
[0114]
取桃核承气汤冻干粉约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇10ml，超声处理(功率250w，频率45khz)20分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0115]
5 方法学验证
[0116]
5.1 专属性考察
[0117]
分别取缺每味药物的桃核承气汤，按照供试品溶液的制备方法制备，得到缺每味药材的阴性样品溶液。
[0118]
分别取桃仁、大黄、肉桂、甘草对照药材，按照对照药材参照物溶液的制备方法制备每味药材的对照药材参照物溶液。
[0119]
取没食子酸对照品、儿茶素对照品、苦杏仁苷对照品、表儿茶素没食子酸酯对照品、甘草苷对照品、芹糖甘草苷对照品、甘草酸对照品、桂皮醛对照品、肉桂酸对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含没食子酸15μg、儿茶素100μg、苦杏仁苷30μg、表儿茶素没食子酸酯50μg、甘草苷30μg、芹糖甘草苷70μg、甘草酸100μg、桂皮醛10μg、肉桂酸10μg、大黄酸20μg、大黄素10μg、大黄酚10μg的溶液，即得到每种对照品的对照品溶液。
[0120]
将供试品溶液、缺每味药材的阴性样品溶液、每味药材的对照药材参照物溶液、每种对照品的对照品溶液各1μl注入液相色谱仪，按2.1节的色谱条件进样分析，结果如图10～图13所示。
[0121]
由图10～图13可知：检测出桃核承气汤制剂特征图谱15个共有色谱峰，其中1个峰(3号峰)来源于桃仁：10个峰(1、2、4、8、9、10、11、12、14和15号峰)来源于大黄，3个峰(2、7、8号峰)来源于肉桂，3个峰(5、6、13号峰)来源于甘草，0个峰来源于芒硝；1个峰(2号峰，儿茶素)为大黄和肉桂所共有，1个峰(8号峰，肉桂酸)为大黄、肉桂所共有；建立的特征图谱能反应来源于处方中除矿物药芒硝外的所有药味成分。
[0122]
此外，由图10～图13可以看出，供试品色谱在与对照品色谱相应保留时间处有相同的色谱峰，阴性无干扰，综上所述，说明该方法专属性良好。
[0123]
5.2整体性考察
[0124]
精密吸取桃核承气汤冻干粉制剂(批号：s9)供试品溶液1μl，注入超高液相色谱仪，按确定的色谱条件(2.1节)测定，保持同一梯度，在梯度终点的流动相比例下延长洗脱
一倍时间，分析特征图谱，未见滞后峰的出现，表明本发明方法整体性良好。
[0125]
5.3精密度考察
[0126]
取桃核承气汤冻干粉制剂(批号：s9)供试品溶液，按确定的色谱条件(2.1节)重复进样6次，进样体积1μl，以表儿茶素没食子酸酯峰为参照峰，计算各共有特征峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算rsd值，同时采用中药色谱特征图谱相似度(2012年版)评价软件计算各个特征图谱的相似度，结果各共有特征峰相对保留时间的rsd为0.04％～0.39％，相对峰面积的rsd为0.12％～1.36％，相似度均为1.000，表明仪器精密度良好，实验结果见表8～表10。
[0127]
表8桃核承气汤特征图谱精密度考察结果表(相对保留时间)
[0128][0129]
表9桃核承气汤特征图谱精密度考察结果表(相对峰面积)
[0130][0131][0132]
表10桃核承气汤特征图谱精密度试验相似度分析结果
[0133][0134]
5.4稳定性考察
[0135]
取桃核承气汤冻干粉制剂(批号：s9)供试品溶液，按确定的色谱条件(2.1节)分别在0、3、6、9、12、15、18、21、24小时进样，进样体积1μl，以表儿茶素没食子酸酯峰为参照峰，计算各共有特征峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算rsd值，同时采用中药色谱特征图谱相似度(2012年版)评价软件计算各个特征图谱的相似度，结果各共有特征峰相对保留时间的rsd为0.05％～0.43％，相对峰面积的rsd为0.80％～2.96％，相似度均为1.000，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好，实验结果见表11～表13。
[0136]
表11桃核承气汤特征图谱稳定性考察结果表(相对保留时间)
[0137][0138][0139]
表12桃核承气汤特征图谱稳定性考察结果表(相对峰面积)
[0140]
[0141]
表13桃核承气汤特征图谱稳定性试验相似度分析结果
[0142][0143]
5.5重复性考察
[0144]
取同一批桃核承气汤冻干粉制剂(批号：s9)约0.25g，精密称定，平行6份，按确定的方法制备供试品溶液(2.3节)，按确定的色谱条件(2.1节)，分别进样1μl。以表儿茶素没食子酸酯峰为参照峰，计算各共有特征峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算rsd值，同时采用中药色谱特征图谱相似度(2012年版)评价软件计算各个特征图谱的相似度，结果各共有特征峰相对保留时间的rsd为0.00％～0.34％，相对峰面积的rsd为1.06％～3.95％，相似度均为1.000，表明该方法重复性良好。实验结果见表14～表16。
[0145]
表14桃核承气汤特征图谱重复性考察结果表(相对保留时间)
[0146][0147]
表15桃核承气汤特征图谱重复性考察结果表(相对峰面积)
[0148][0149][0150]
表16桃核承气汤特征图谱重复性试验相似度分析结果
[0151][0152]
6不同批次样品的测定及共有峰的确定
[0153]
取20批次桃核承气汤对应实物，按确定的供试品溶液制备方法(2.3节)，制得供试品溶液，再按确定的色谱条件(2.1节)，分别进样1μl，测定。以表儿茶素没食子酸酯峰为参照峰，计算各共有特征峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算rsd值，同时采用中药色谱特征图谱相似度(2012年版)评价软件计算各个特征图谱的相似度。结果见表17～表19，色谱图见图14。
[0154]
结果表明共有特征峰相对保留时间的rsd为0.00％～0.19％，因各批次样品共有特征峰对应成分含量存在一定的差异，各共有特征峰相对峰面积的rsd为0.00％～51.70％，偏差较大，20批次核承气汤制剂均特征图谱相似度范围为0.937～0.998，均大于0.9。对20批桃核承气汤制剂特征图谱进行分析，可确定15个共有特征峰。
[0155]
表17 20批次桃核承气汤冻干粉制剂特征图谱相似度表
[0156][0157][0158]
表18 20批桃核承气汤冻干粉制剂特征图谱相对保留时间结果
[0159][0160]
表19 20批桃核承气汤冻干粉制剂特征图谱相对峰面积结果
[0161][0162][0163]
7特征图谱的化学成分试验研究
[0164]
根据桃核承气汤方中各药味所含化学成分，采用高分辨质谱，对桃核承气汤所含
化学成分进行指认。
[0165]
7.1高分辨质谱指认
[0166]
质谱条件：waters acquity uplctm i
‑
class型超高效液相色谱仪；沃特世超高效液相飞行时间高分辨质谱联用系统(xevo g2
‑
xs qtof ms)，数据处理系统为unifi 1.8工作站(waters,manchester,u.k.)；waters xselected hss t3(柱长150mm，内径2.1mm，粒径2.5μm)色谱柱。氮气作为质谱离子源的雾化、锥孔气；电喷雾电离正离子模式；毛细管电压：2.0kv；锥孔电压：40v；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：450℃；脱溶剂气流速：800l/h；扫描时间：0.5s；扫描时间间隔：0.02s；质荷比范围：50～1200；数据采集模式：esi(+)下采集mse；以甲酸钠溶液校正质量轴，以亮氨酸脑啡肽(leucine
‑
enkephalin)为内标校正质量精度，锥孔气体流量：50l/h。
[0167]
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(waters xselected hss t3柱，柱长150mm，内径为2.1mm，粒径为2.5μm)；以甲醇为流动相a，以水溶液水(含2mmol/l乙酸铵和0.05％甲酸)为流动相b，按表20中的规定进行梯度洗脱；柱温为40℃；流速为每分钟0.35ml；进样量1μl，波长260nm。
[0168]
对照品溶液的制备：同2.2项；
[0169]
供试品溶液的制备：同2.3项。
[0170]
表20色谱指认研究梯度洗脱程序表
[0171][0172]
鉴定结果详见表21，色谱图见图15、图16。
[0173]
表21桃核承气汤特征图谱成分指认结果
[0174][0175][0176]
综上，本发明建立了桃核承气汤的特征图谱，该特征图谱可充分展示桃核承气汤的化学成分特征，特征峰信息量丰富，可全面地反映桃核承气汤的质量信息，从而能够达到全面、有效地控制桃核承气汤产品质量的目的。同时，本发明中的特征图谱构建方法重现性良好，准确可靠，稳定性好。
[0177]
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。