一种基于动物源食品中兽药化合物多维电子身份数据库的兽药残留分析方法和平台

本发明属于食品安全分析检测领域，具体涉及一种基于动物源食品中兽药化合物多维电子身份数据库的兽药残留分析方法和平台。

背景技术：

动物源食品是人类摄取高质量蛋白、脂肪以及必须氨基酸等营养素的主要来源，是人们一日三餐中的主要食品原料之一，随着我国居民生活水平的不断提高，人们对动物源食品消费需求量也日益增长。兽药的特别功效包括疾病防治与生长改良促进等，兽药在保护食品动物生长、提高产业收益、保障动物源食品储存质量等方面起到了至关重要的作用。然而，兽药是一柄“双刃剑”，合理使用可大大缓解人口增长与食物供给之间矛盾，而超量使用则不仅直接影响食品安全，还间接影响生态环境和动物源食品贸易。兽药残留安全问题是动物源食品安全中的主要问题，食品中兽药安全问题已经受到政府部门的高度重视和人民大众的广泛关注。因而兽药残留的检测，是一项非常重要的工作。但是，动物源食品基质复杂，而各类残留兽药含量甚微且极性差别大，因而利用一次检测获得多种兽药残留的信息是很困难的。传统的兽药残留检测方法多数仅能针对具有同类基本结构的少量兽药进行检测，难以实现对不同化学结构的大批量兽药同时检测。

超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱(uhplc-q/orbitrap)是一种将超高效液相色谱的高效分离能力与静电场轨道阱高分辨质谱的鉴别定性能力相结合的色谱-质谱联用来检测食品中农兽药痕量污染物的方法。随着广大科研学者对基于lc-hrms快速筛查检测技术可行性的不断探究，液相色谱与高分辨质谱联用已逐渐成熟。

uhplc-q/orbitrap具有高分辨的优点，有望克服不同种类的兽药难以在一次检测中被检出的缺陷。然而，由于体系过于复杂，uhplc-q/orbitrap检测食品得到的谱图非常复杂，需要大量的人工分析工作，且对谱图的分析非常依赖于解谱人员的相关经验及专业知识，这限制了该技术的广泛应用。因而，目前仍然缺少将uhplc-q/orbitrap应用于兽药检测，对兽药残留进行多目标快速锁定与甄别的技术。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于动物源食品中兽药化合物多维电子身份数据库的兽药残留分析方法和平台，实现了基于uhplc-q/orbitrap的检测结果和多维电子身份数据库对兽药残留进行快速识别的目的。

一种基于动物源食品中兽药化合物多维电子身份数据库的兽药残留分析方法，包括如下步骤：

(1)建立兽药化合物标准品的多维电子身份数据库，所述多维电子身份数据库包括：兽药化合物标准品的基本信息、色谱信息和质谱信息；

(2)对动物源食品样品进行uhplc-q/orbitrap检测，得到色谱图和质谱图；

(3)将所述色谱图和质谱图与所述多维电子身份数据库中的信息进行对比，得到所述动物源食品样品中兽药化合物残留的分析结果。

优选的，所述基本信息包括化合物中英文名称、cas号、化学分子式和理论精确分子质量数；

和/或，所述色谱信息包括保留时间；

和/或，所述质谱信息包括母离子质量数、碎片离子质量数、离子丰度比和离子加合方式。

优选的，所述多维电子身份数据库包括一级精确质量数指纹识别数据库和二级hcd碎片离子参考谱图确证库；

所述一级精确质量数指纹识别数据库是将兽药化合物的基本信息、色谱信息和质谱信息在tracefinder数据采集与处理软件中依次录入形成的指纹识别数据库；

所述二级hcd碎片离子参考谱图确证库是将兽药化合物在高能碰撞池中最优碰撞能量下裂解得到的二级hcd碎片离子质谱图在mzvault谱图管理软件中添加收录形成的谱图确证库，所述最优碰撞能量是在出现3-5个选择离子丰度比最大的碎片离子时，记录的碰撞能量值ce(20％，40％，60％，ev)。

优选的，步骤(1)获得所述色谱信息和质谱信息，或步骤(2)获得所述色谱图和质谱图时，采用如下色谱条件：

色谱柱为c18柱；和/或，流动相a为含0.02-0.1％甲酸和5-20mmol/l乙酸铵的水溶液，流动相b为乙腈；和/或，色谱柱温度30-40℃；和/或，流速：0.3-0.5ml/min；和/或，进样量5-15μl；和/或，梯度洗脱程序为：

优选的，步骤(1)获得所述色谱信息和质谱信息，或步骤(2)获得所述色谱图和质谱图时，采用如下q-orbitrap高分辨质谱条件：

加热电喷雾离子源；扫描采集方式：正负离子同时采集，一级全扫描/数据依赖二级扫描；和/或，喷雾电压：3.5kv(+)，-3.0kv(－)；和/或，离子传输管及加热器温度：325℃、450℃；和/或，鞘气及辅助气流速：35arb、10arb；和/或，采集范围：100～1000m/z；和/或，分辨率：fullms75000、dd-ms²17500；和/或，stepped(n)ce(20％，40％，60％)；和/或，c-trap中离子数最大容量：fullms3×10⁶、dd-ms²2×10⁵；和/或，c-trap中最大注入时间：fullms100ms、dd-ms²50ms；

和/或，所述q-orbitrap质谱的质量轴调谐校正，所述质量轴调谐校正为：将calmix校正液注射进入质谱仪器中，调试并观察calmix校正液特征离子峰，当正、负离子的离子峰均已出峰稳定后，用调谐应用软件进行自动校正。

优选的，步骤(3)中，判断某一兽药化合物呈阳性的标准是在5ppm质量窗口范围内进行提取的原始数据满足以下所有条件：

1)母离子质谱峰的保留时间误差范围在±15s内；

2)母离子质量数偏差小于等于5ppm；

3)二级质谱图中碎片离子的匹配个数大于等于2个，且碎片离子质量数偏差小于等于10ppm。

优选的，所述兽药化合物选自雄性激素、雌性激素、孕激素、糖皮质激素、玉米赤霉醇类化合物、β-受体激动剂、磺胺类抗菌素药物、喹诺酮类抗菌素或大环内酯类抗生素中的至少一种。

优选的，所述兽药化合物选自去氢睾酮、表睾酮、氟甲睾酮、甲睾酮、丙酸诺龙、诺龙、丙酸睾酮、群勃龙、美雄酮、苯丙酸诺龙、司坦唑醇、去甲雄烯二酮、雄烯二酮、17α-甲基异睾酮、美雄醇、表雄酮、17β-羟基雄烷-3-酮、美睾酮、达那唑、烯丙孕素、氯地孕酮醋酸酯、左炔诺孕酮、甲羟孕酮醋酸酯、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、炔诺酮、醋酸炔诺酮、21-α-羟基孕酮、炔诺醇、17-α-羟孕酮、丙酸倍氯米松、倍他米松、醋酸可的松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、曲安奈德、曲安西龙、可的松、地塞米松、醋酸氢化可的松、倍氯米松、氟米松、布地奈德、醋酸氟轻松、醋酸氟氢可的松、氟米龙、丙酸氯倍他索、醛固酮、泼尼松、雌三醇、雌酮、己二烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚、雌二醇、辛基酚、4-壬基酚、双酚a、炔雌醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、克伦特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、喷布特罗、奥西那林、福莫特罗、非诺特罗、塞布特罗、班布特罗、沙丁胺醇、特布他林、妥布特罗、西马特罗、马布特罗、磺胺苯吡唑、磺胺苯酰、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺噁唑、磺胺二甲基异噁唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺氯吡嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺脒、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺、磺胺硝苯、奥比沙星、达氟沙星、恩诺沙星、氟甲喹、氟罗沙星、环丙沙星、洛美沙星、萘啶酸、诺氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星、双氟沙星、司帕沙星、依诺沙星、氧氟沙星、红霉素、吉他霉素、林可霉素、泰乐菌素、替米考星、泰万菌素、竹桃霉素、多拉菌素、伊维菌素、罗红霉素中的至少一种。

本发明还提供一种计算机可读存储介质，其上存储有上述多维电子身份数据库；或其上存储有用于实现上述方法的计算机程序。

本发明还提供一种基于动物源食品中兽药化合物多维电子身份数据库的兽药残留分析平台，包括：

检测模块，用于对动物源食品进行uhplc-q/orbitrap检测；

多维电子身份数据库；

分析模块，用于将uhplc-q/orbitrap检测的结果与多维电子身份数据库进行对比，给出兽药残留的分析结果。

本发明的技术方案具有如下有益效果：

(1)本发明提出一种基于uhplc-q/orbitrap的动物源食品中兽药化合物多维电子身份数据库的构建方法及侦测平台，基于uhplc-q/orbitrap技术在获得色谱和质谱信息的基础上，建立了128种兽药化合物的多维电子身份数据库，以电子身份取代实物标准品，可实现自动化、多目标、高精度、高效率的非靶向兽药残留侦测。对实现动物源食品中上百种痕量兽药残留的多目标快速锁定与甄别确证具有重要意义。采用本发明的方法，对多种兽药化合物进行批量处理时更加简单高效，对操作人员的知识和经验水平要求较低，有利于本发明技术的广泛应用。

(2)本发明以兽药化合物多维电子身份数据库及侦测平台为基础的高通量侦测方法，取代了以实物标准品参考对照的传统靶向定性分析方法，实现了兽药残留由已知分析物靶向侦测向未知分析物高通量非靶向侦测技术的跨越式发展。不仅缩短了样品分析时间，提高了样品检测效率，还节省了资源，减少了污染，满足了可持续发展与环境友好的要求。

(3)优选方案中，对液相色谱条件和高分辨质谱参数的优化，从而得到最佳仪器条件，进而建立了快速高效、稳定可靠的仪器分析方法。

(4)优选方案中，依据目标化合物的保留时间、精确质量数、离子丰度比、碰撞能量、二级hcd碎片离子图等信息，通过检索比对待测兽药化合物采集信息与数据库中的多维电子身份信息，以一级精确质量数指纹识别数据库(ms¹)中色质谱指纹信息筛查识别，再配以二级hcd碎片离子参考谱图确证库(ms²)中特征谱图确证，保证了药物精准定性筛查结果的准确性。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为兽药化合物多维电子身份数据库及侦测平台的构建流程图。

图2为兽药残留化学污染物多维电子身份数据库模型。

具体实施方式

需要特别说明的是，实施例中未具体说明的数据采集、传输、储存和处理等步骤的算法，以及未具体说明的硬件结构、电路连接等均可通过现有技术已公开的内容实现。

以下实施例采用实验仪器如下：vanquishuhplc/qexactiveplus超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱系统(hp-1510，含65μmpdms/dvb萃取头，美国thermofisher公司)；milli-q超纯水系统(美国millipore公司)；me203型电子天平(瑞士mettlertoledo公司)，watersacquitybehc18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm，美国waters公司)，q-exactiveorbitrap专用质量轴校正液(美国thermoscientific公司)。

实施例1多维电子身份数据库的建立

如图1、图2所示，兽药化合物的多维电子身份数据库包括兽药化合物标准品的基本信息、色谱信息和质谱信息。所述基本信息包括化合物中英文名称、cas号、化学分子式和理论精确分子质量数；所述色谱信息包括保留时间；所述质谱信息包括母离子质量数、碎片离子质量数、离子丰度比和离子加合方式。

所述多维电子身份数据库包括一级精确质量数指纹识别数据库(ms¹)和二级hcd碎片离子参考谱图确证库(ms²)。所述一级精确质量数指纹识别数据库是将兽药化合物的基本信息、色谱信息和质谱信息在tracefinder4.1数据采集与处理软件中依次录入形成的指纹识别数据库。所述二级hcd碎片离子参考谱图确证库是将兽药化合物在高能碰撞池中最优碰撞能量下裂解得到的二级hcd碎片离子质谱图在mzvault谱图管理软件中添加收录形成的谱图确证库，所述最优碰撞能量是在出现3-5个选择离子丰度比最大的碎片离子时，记录的碰撞能量值，stepped(n)ce(20％，40％，60％)。

基于uhplc-q/orbitrap采集色谱信息的色谱条件如下：

色谱柱：watersacquitybehc18(2.1mm×100mm，1.7μm)。色谱柱温度：40℃。流速：0.5ml/min。流动相a(水相)为含0.1％甲酸的乙酸铵(20mmol/l)水溶液，流动相b(有机相)为乙腈。进样量：10μl。梯度洗脱程序：

表1液相色谱流动相梯度洗脱程序

基于uhplc-q/orbitrap采集色谱信息的质谱条件如下：

加热电喷雾离子源；扫描采集方式：正负离子同时采集，一级全扫描/数据依赖二级扫描(fullms/dd-ms²)(topn)；喷雾电压：3.5kv(+)，-3.0kv(－)；离子传输管及加热器温度：325℃、450℃；鞘气及辅助气(n2)流速：35arb、10arb；采集范围：100～1000m/z；分辨率：75000(fullms)、17500(dd-ms²)；stepped(n)ce(20％，40％，60％)；c-trap中离子数最大容量(agctarget)：3×10⁶(fullms)、2×10⁵(dd-ms²)；c-trap中最大注入时间：100ms(fullms)、50ms(dd-ms²)。

q/orbitrap质谱的质量轴调谐校正，所述质量轴调谐校正为：首先拾取专用适配注射器吸取适量calmix校正液，定向缓慢注射进入质谱仪器中，调试并观察注射液特征离子峰，当正、负离子的离子峰均已出峰稳定后再用调谐应用软件qexactive2.1进行自动校正。所述调试并观察注射液特征离子峰为当正离子由低位caffeine(咖啡因)质荷比到中位mrfa(多聚酪氨酸短肽)，再逐渐升至高位质荷比，直到离子峰出现始终以22收尾；与此同时，负离子由低位k12(十二烷基硫酸钠)到中位st(牛黄胆酸钠)，再到高位质荷比，直到待到离子峰出现始终以80收尾；表明此时正、负离子的离子峰均已出峰稳定。

本实施例按照上述方法建立了128种兽药化合物的多维电子身份数据库，128种兽药化合物的具体信息如下表所示：

表2uhplc-q/orbitrap128种兽药化合物清单

实施例2畜禽肉中128种兽药uhplc-q/orbitrap高通量侦测技术

1、待测样品制备

在西南地区某省份城市采集猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉各24批次，选取样品中可食部分，按照gb/t30891-2014的要求制样后装入洁净的容器内密封并标识。准确称取通过混匀处理后的待测样品2.5g(精确至百分位)，转移至50ml刻度的pp离心管，缓慢添加乙腈(80％)-甲酸(0.2％)水溶液10ml。静置10min，添加陶瓷均质子(2粒)，快速剧烈振摇并旋涡振荡30min(2000r/min)使样品充分散开。样品在高速离心机中以9500r/min离心5min，取上清液5ml，以1滴/s过6cc200mg的primehlb固相萃取柱。收集后半段流出液并准确量取2ml，n2下吹干，1ml初始流动相定容，过0.22μm聚四氟乙烯滤膜，供uhplc-q/orbitraphrms测试。

2、uhplc-q/orbitraphrms操作条件

化合物通过超高效液相色谱系统进行分离，uhplc条件：色谱柱：watersacquitybehc18(2.1mm×100mm，1.7μm)。色谱柱温度：25℃。流速：0.5ml/min。流动相a(水相)为含0.1％甲酸的乙酸铵(20mmol/l)水溶液，流动相b(有机相)为乙腈。梯度洗脱程序：0～0.5min，5％b；0.5～15min，98％b；15～20min，98％b；20～20.1min，5％b；20.1～25min，5％b。进样量：10μl。

q/orbitrap高分辨质谱条件：加热电喷雾离子源；扫描采集方式：正负离子同时采集，一级全扫描/数据依赖二级扫描(fullms/dd-ms²)(topn)；喷雾电压：3.5kv(+)，-3.0kv(－)；离子传输管及加热器温度：325℃、450℃；鞘气及辅助气(n2)流速：35arb、10arb；采集范围：100～1000m/z；分辨率：75000(fullms)、17500(dd-ms²)；stepped(n)ce(20％，40％，60％)；c-trap中离子数最大容量(agctarget)：3×10⁶(fullms)、2×10⁵(dd-ms²)；c-trap中最大注入时间：100ms(fullms)、50ms(dd-ms²)。

3、数据处理与分析

在tracefinder4.1分析软件中，运用实施例1建立好的一级精确质量数指纹识别数据库(ms¹)对uhplc-q/orbitrap采集的样品数据进行检索匹配分析，利用质谱软件的自动去卷积功能，并与database中的保留时间、精确母离子质量数、碎片离子质量数等相关参数进行对比定性鉴定(按照设置的筛查标准)，针对可疑化合物利用和二级hcd碎片离子参考谱图确证库(ms²)进一步确证分析。

4、侦测结果

检测完成后，统计样品溶液中所含兽药残留的信息，本次畜禽肉侦测共检出兽药残留17种，共计检出兽药残留频次59次，涉及样品59批次(猪肉和鸡肉各17批次，牛肉14批次，羊肉11批次)。具体结果见表3。

表3畜禽肉样品中兽药残留侦测结果

实施例3：鱼肉中128种兽药uhplc-q/orbitrap高通量侦测技术实例

1、在西南地区某省份城市采集多宝鱼、鳜鱼、乌鱼和草鱼各9批次，待测样品制备、uhplc-q/orbitraphrms操作条件和数据处理与分析过程均参照实施例2。

2、侦测结果

检测完成后，统计样品溶液中所含兽药残留的信息，本次鱼肉侦测共检出兽药残留13种，共计检出兽药残留频次22次，涉及样品18批次(多宝鱼7批次，鳜鱼5批次，草鱼4批次，乌鱼2批次)。具体结果见表4。

表4鱼肉样品中兽药残留侦测结果

实施例4：猪肝和鸡肝中128种兽药uhplc-q/orbitrap高通量侦测技术

1、在西南地区某省份城市采集猪肝和鸡肝各8批次，待测样品制备、uhplc-q/orbitraphrms操作条件和数据处理与分析过程均参照实施例2。

2、侦测结果

检测完成后，统计样品溶液中所含兽药残留的信息，本次猪肝和鸡肝侦测共检出兽药残留7种，共计检出兽药残留频次12次，涉及样品8批次(猪肝4批次，鸡肝3批次)。具体结果见表5。

表5猪肝和鸡肝样品中兽药残留侦测结果

通过上述实施例可见，本发明提供的技术方案能够对各种动物源食品中的兽药化合物残留进行非靶向的批量、快速、高效的检测。本发明的方法对操作人员的经验和专业知识水平要求低，有利于大规模使用，具有很高的应用价值。