一种准确、快速测定黄芩药材及其制品中总黄酮含量的方法与流程

本发明涉及测定黄芩总黄酮含量的方法。

背景技术：

黄芩(scutellariabaicalensisgeorgi)为唇形科植物，其干燥根为我国传统中药，具有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎等功效。黄酮类化合物为黄芩中的主要活性成分，主要包括苷类(黄芩苷、汉黄芩苷)和苷元类(黄芩素、汉黄芩素)。其中黄芩苷是黄芩中含量最高的黄酮类成分，约占黄芩药材重量的9％以上。

目前，已经报道了许多关于黄芩中黄酮类化合物测定方法的研究，涉及的方法主要有液相色谱法、近红外光谱法、分光光度法等。下面对这三种方法的研究现状及优缺点进行概述：

1、液相色谱法：

液相色谱法是黄芩黄酮分析的经典方法之一，《中国药典》2015版第一部中将液相色谱法作为黄芩苷含量检测的标准方法，即：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水-磷酸(47:53:0.2)为流动相，检测波长为280nm。另外有许多科研人员对检测条件进行了研究，形成了许多利用液相色谱技术检测黄芩有效成分的方法。如《滨州医学院学报》2020年2月第43卷第一期文章“同时测定黄芩提取液中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素含量的高效液相色谱方法的建立”，使用c18色谱柱，流动相为乙腈：含0.05％磷酸水溶液(25:75)，流速1ml/min，检测波长275nm，在该检测条件下，黄芩中的这三种成分分离良好，取得了较好的检测结果。专利“cn201210150241-一种从黄芩根中提取黄芩苷和黄芩素的方法”、专利“cn200910075407-黄芩中黄芩苷及黄芩总苷元同时提取分离工艺”等专利中同样采用高效液相色谱法检测黄芩中的黄酮类化合物。

液相色谱法在诸多方法中相对准确，具有更高的灵敏度，且通过对复杂组分进行分离，能够精确测定某单一组分的含量。但液相色谱法需要复杂昂贵的仪器，在使用过程中需要消耗大量有毒有害的有机溶剂。仪器在进样前需要长时间排气泡、走平基线，在分析完毕后还需长时间的冲洗色谱柱，所以现在的液相色谱技术还存在耗时长的缺点。

2、近红外光谱法：

近红外光谱是介于可见光和中红外之间的电磁辐射波，通过扫描样品的近红外光谱，可以得到样品中有机分子含氢基团的特征信息，是一种快速、无损的检测手段，在食品、药品等领域具有广泛的应用前景。专利“cn201610462580-一种黄芩颗粒及其中药制剂”中使用近红外光谱法对黄芩颗粒的质量进行控制，首先采集大量的样品原始吸收光谱图，然后对这些样品中的有效成分进行测定得到实测值，接着采用一系列的化学计量学方法对原始光谱图进行处理，最后构建出近红外光谱数据与实测值之间的定量模型。该专利中所构建的定量模型预测值与实测值之间的偏差较小，取得了比较好的结果。但精密的近红外光谱仪价格昂贵，便宜的便携式光谱仪往往达不到好的预测结果，而且该方法需要经过复杂的数学运算，对使用人员有严苛的知识要求，使得该方法的普及难以实现。

3、分光光度法：

分光光度法是在植物总黄酮含量分析中使用最广泛的一种方法，《中国药典》2015版第一部中将其作为许多药材总黄酮含量测定的标准方法，如山楂叶、沙棘、半枝莲等药材，大多采用以芦丁为对照品、以亚硝酸钠、硝酸铝与氢氧化钠为显色剂显色后在500nm处测定吸光度值，其原理是芦丁遇到上述显色剂后形成红色络合物，溶液变为红色，在500nm附近有最大吸收值。而黄芩中的主要黄酮类化合物为黄芩苷，遇到该显色剂时并不显红色，不宜采用该方法。内蒙古大学2011年生物工程学科一篇名为“黄芩总黄酮的超声提取工艺及其抗氧化活性研究”的硕士论文就采用了该检测方法，结果黄芩总黄酮含量测定最高值仅为2.88％，远低于药典中规定的黄芩中黄芩苷不得少于9％的质量要求。

另外一些研究，如《广州中医药大学学报》2020年4月第37卷第4期“黄芩原药材、药渣的黄芩苷含量测定及体外抗菌活性研究”、《化学分析计量》2008年第17卷第5期“紫外分光光度法测定黄芩中黄芩苷含量”、《安徽农学通报》2021年第18卷第19期“不同型号大孔树脂对黄芩苷纯化工艺的研究”等文章中使用黄芩苷为对照品，直接在黄芩苷的最大吸收波长278nm附近测定吸光度值。但是，黄芩提取物成分复杂，直接在278nm处测定，受杂质组分干扰较大，这种方法往往会得到偏大的结果。

还有一些研究人员使用铝盐络合法测定黄芩总黄酮含量，如《中成药》杂志2006年11月第28卷第11期“黄芩总黄酮提取及纯化工艺的研究”一文中，使用三氯化铝溶液显色，在290nm处测定吸光度值；《安徽农业科学》杂志2008年第36卷11期“黄芩总黄酮·黄芩苷提取及纯化工艺研究”一文，使用三氯化铝溶液显色，在283nm处测定吸光度值。这些研究所使用的检测方法虽然使用铝盐络合显色，但选择的测定波长与278nm较为接近，依然无法摆脱杂质干扰的命运。

即便分光光度法受其他组分干扰的可能较大，但其仪器价格便宜、操作简单、使用过程中能够尽量避免使用有毒的有机试剂，通过合适的方法也能够尽可能消除杂质组分的干扰，这些优点使得分光光度法在黄芩总黄酮含量测定中依然占有重要地位。本专利就旨在降低杂质组分的干扰，建立一种准确、快速的测定黄芩总黄酮含量的分光光度法。

技术实现要素：

本发明所要解决的问题是，针对上述现有技术中的缺点，提出创新方案，尤其是一种能够有效降低杂质组分的干扰，准确、快速的测定黄芩总黄酮含量的分光光度法的方案。

为解决上述问题，本发明采用的方案如下：一种准确、快速测定黄芩药材及其制品中总黄酮含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)黄芩提取液制备：准确称取黄芩粉m(g)，然后加入乙醇水溶液提取，提取结束后过滤，滤渣重复提取0～2次，合并所有滤液并定容至v0(ml)备用；

(2)黄芩苷标准溶液配制：准确称取m1(mg)黄芩苷标准品，使用乙醇水溶液溶解并定容至v1(ml)，制得浓度为m1/v1(mg/ml)的黄芩苷标准品溶液；

(3)黄芩苷标准曲线建立：移取v2、v3···vx(ml)的黄芩苷标准品溶液于vy(ml)容量瓶中，x为2、3、4、5···，分别加入等量的弱酸性铝盐溶后，使用乙醇溶液稀释定容，形成一系列浓度梯度的黄芩苷标准品溶液，摇匀避光放置20～60min后，以试剂为空白，经紫外可见分光光度计测定吸光度值，最后以黄芩苷标准品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制出标准曲线y＝ax+b，其中，y为吸光度值，x为黄芩苷标准品浓度：x＝(1000vx(m1/v1))/vy，(μg/ml)，a为系数，b为截距；

(4)样品总黄酮含量测定：移取vz(ml)的黄芩提取液于vy(ml)容量瓶中，按步骤(3)中方法显色并测定吸光度值a，最后按下列公式计算黄芩总黄酮含量：

式中：a为黄芩提取液的吸光度值；b为黄芩苷标准曲线截距；n为稀释倍数，n＝v0/vz；v为显色的溶液体积，即vy(ml)；a为黄芩标准曲线系数；m为步骤(1)中称取黄芩粉质量g。

进一步，一种准确、快速测定黄芩药材及其制品中总黄酮含量的方法，其特征在于，所述弱酸性铝盐溶液为硝酸铝溶液、氯化铝溶液其中的一种，所述弱酸性铝盐溶液的溶剂为水或乙醇溶液，所加弱酸性铝盐溶液的浓度为10％，体积为5ml。

进一步，一种准确、快速测定黄芩药材及其制品中总黄酮含量的方法，其特征在于，步骤(3)中避光放置20min，使用紫外-可见分光光度计测定吸光度值时，检测波长为330nm。

优选的提供一种准确、快速测定黄芩药材及其制品中总黄酮含量的方法，具体采用以下步骤：

(1)黄芩提取液制备

准确称取1g黄芩粉末于具塞三角瓶中，然后加入20ml55％(v/v)乙醇溶液。加塞密封后提取，提取结束后过滤，滤渣重复提取0～2次，合并所有滤液并定容至100ml备用。

(2)黄芩苷标准溶液配制

准确称取16.5mg黄芩苷标准品，使用70％(v/v)乙醇溶液溶解并定容至50ml，得到浓度为0.33mg/ml的黄芩苷标准品溶液。

(3)黄芩苷标准曲线建立

分别移取0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5ml黄芩苷标准品溶液于6个25ml容量瓶中，然后分别加入5ml10％硝酸铝溶液，定容至25ml后摇匀避光放置20min，接着以试剂为空白，在330nm处测定吸光度值(所有实验重复三次，取平均值)，最后以黄芩苷标准品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制出标准曲线y＝ax+b(y为吸光度值，x为黄芩苷标准品浓度(μg/ml)，a为系数，b为截距)。

(4)样品总黄酮含量测定

移取0.1～0.2ml黄芩提取液与25ml容量瓶中，然后按(3)中方法进行显色和测定吸光度值a，最后按下列公式计算黄芩总黄酮含量：

式中：a为黄芩提取液的吸光度值；b为黄芩苷标准曲线截距；n为稀释倍数(移取黄芩提取液为0.1ml时，n＝1000，移取0.2ml时，n＝500)；v为显色的溶液体积，即25ml；a为黄芩标准曲线系数；m为步骤(1)中称取黄芩粉质量g。

本发明的技术效果如下：本发明通过向黄芩提取液中加入铝盐溶液，使黄芩总黄酮与铝离子络合，黄芩提取液的最大吸收波长向长波长方向移动。然后扫描了黄芩提取液及杂质组分的光谱图后发现黄芩提取液经铝盐显色后在330nm处有强吸收，而杂质组分在330nm处无明显吸收，因此选择330nm为检测波长，克服了现有技术受杂质干扰大的问题。

本发明对该方法进行了一系列重复性、精密度、加标回收率、稳定性等方法学验证，证明该方法是稳定可行的，并且该方法与高效液相色谱法测定结果差距较小，测定结果比较准确。

附图说明

图1为黄芩提取液和黄芩苷标准溶液的光谱图。

图2为大孔树脂流出液光谱图。

图3为黄芩提取液和黄芩苷标准溶液显色后的光谱图。

图4为黄芩苷标准曲线。

图5为黄芩苷标准溶液液相色谱图。

图6为黄芩提取液液相色谱图。

图7为直接测定法标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1一种准确、快速测定黄芩药材及其制品中总黄酮含量的方法：

1黄芩提取液制备

准确称取1g黄芩超微粉于具塞三角瓶中，然后加入20ml70％(v/v)乙醇溶液。加塞密封后提取20min，过滤后，滤液定容至100ml备用。

2黄芩苷标准溶液配制

准确称取16.5mg黄芩苷标准品，使用70％(v/v)乙醇溶液溶解并定容至50ml，得到浓度为0.33mg/ml的黄芩苷标准品溶液。

3未经显色的黄芩提取液和黄芩苷标准溶液光谱扫描

分别移取0.2ml黄芩提取液和1ml黄芩苷标准溶液于两个25ml容量瓶中，使用70％(v/v)乙醇定容后摇匀，然后在200～500nm范围内扫描光谱图，结果见图1，黄芩苷标准品溶液与黄芩提取液均在279nm处有最大吸收波长。

4大孔树脂柱色谱分离

取适量黄芩提取液减压浓缩除去乙醇后，用适量清水稀释，然后加入到ab-8大孔吸附树脂柱内吸附过夜，收集树脂柱底部流出液体，取少量液体加入硝酸铝溶液混匀后溶液没有变为黄色，说明流出液内没有黄芩苷，主要为非黄酮类成分，然后扫描流出液的光谱图，如图2所示，说明黄芩中非黄酮类组分在200～355nm内均有吸收，会对直接测定结果产生影响。

5显色后的黄芩提取液和黄芩苷标准溶液光谱扫描

分别移取0.2ml黄芩提取液和1ml黄芩苷标准品溶液于两个25ml容量瓶中，加入5ml10％硝酸铝溶液后，使用70％(v/v)乙醇定容后摇匀，然后在200～500nm范围内扫描光谱图，结果见图3，黄芩苷标准品溶液与黄芩提取液经硝酸铝显色后均有290nm和330nm两个最大吸收波长，与图2对比可至，黄芩非黄酮组分在290nm处有较大吸收，而在330nm处吸光度值较小，仅为0.037，所以选择330nm为检测波长，能够有效减轻黄芩非黄酮组分对测定结果的影响。

6黄芩苷标准曲线建立

分别移取0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5ml黄芩苷标准品溶液于6个25ml容量瓶中，然后向每个容量瓶中加入5ml10％硝酸铝溶液，定容后摇匀避光放置20min，接着以试剂为空白，在330nm处测定吸光度值(所有实验重复三次，取平均值)，最后以黄芩苷标准品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制出标准曲线(图4)y＝0.04084x-0.0074，r²＝0.99986，在浓度范围2.64～19.8μg/ml内线性良好。

7检测方法重复性验证

按1中方法制备6份黄芩提取液，分别移取0.2ml提取液于25ml容量瓶中，然后按6中方法进行显色和测定吸光度值，结果如表1所示，6份提取液的测定结果相对偏差较小，仅为0.84％，说明该方法重复性良好。

表1检测方法重复性验证

8检测方法精密性验证

从同一份黄芩提取液中移取6份0.2ml提取液于6个25ml容量瓶中，然后按6中方法进行显色和测定吸光度值，结果如表2所示，同一提取液中6份样品的测定结果相对偏差较小，仅为0.33％，说明该方法精密性良好。

表2检测方法精密性验证

9检测方法加标回收率实验

从同一份黄芩提取液中移取5份0.1ml提取液于5个25ml容量瓶中，然后分别向各个容量瓶中加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml黄芩苷标准溶液，按6中方法进行显色和测定吸光度值，所有实验重复三次，结果如表3所示，该方法平均加标回收率为100.11％，测定结果准确。

表3加标回收率实验

10检测方法稳定性实验

分别移取0.2ml黄芩提取液和1ml黄芩苷标准溶液于2个25ml容量瓶中，然后按6中方法进行显色，分别在显色20min、40min、60min时测定一次吸光度值，结果如表4所示，该显色方法在20～60min内显色稳定，吸光度值没有显著变化。

表4显色20～40min内的吸光度值变化

11样品总黄酮含量测定

移取0.1ml黄芩提取液于25ml容量瓶中，然后按6中方法进行显色和测定吸光度值，计算黄芩超微粉中总黄酮含量为20.26％。

12与其他检测方法对比

液相色谱法：参考《中国药典》2015版中检测黄芩中黄芩苷的方法，图5、图6分别为黄芩苷标准品和黄芩提取液的色谱图，配制浓度范围0.0132～0.132mg/ml的黄芩苷标准溶液进行色谱分析，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线为y＝6.76032e6x+70462.78571(r²＝0.99987)，计算黄芩超微粉中黄芩苷含量为14.06％。本实施例中所用黄芩超微粉是由陕西商洛产的四年生黄芩制成，根据文献“田甜.不同产地和生长年限黄芩质量评价及药理作用研究[d].浙江理工大学.”陕西商洛四年生黄芩中黄芩苷含量约占总黄酮含量的76％，由此推测本实验样品中总黄酮含量为18.5％。本实施例中黄芩苷含量比文献描述中略高，可能是由于超微粉碎使黄芩中黄芩苷更容易溶出。

直接检测法：参考《广州中医药大学学报》2020年4月第37卷第4期“黄芩原药材、药渣的黄芩苷含量测定及体外抗菌活性研究”中的方法，不添加显色剂直接在278nm处测定吸光度值，配制浓度范围2.64～19.8μg/ml的黄芩苷标准溶液测定吸光度值，以标准溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线见图7，y＝0.05994x+0.00208(r²＝0.999)。经计算，直接测定法测定黄芩中总黄酮含量为24.84％，比液相色谱法高6.34％，偏差34.27％。本专利方法与液相色谱法相差1.76％，偏差9.51％，这些结果表明本专利方法有效去除了杂质组分的干扰，结果更加准确。

实施例2一种准确、快速测定黄芩药材及其制品中总黄酮含量的方法：1黄芩提取液制备

准确称取1g黄芩粉末于具塞三角瓶中，然后加入20ml55％(v/v)乙醇溶液。加塞密封后提取10min，过滤后，滤液定容至100ml备用。

2黄芩苷标准溶液配制

准确称取16.5mg黄芩苷标准品，使用70％(v/v)乙醇溶液溶解并定容至50ml，得到浓度为0.33mg/ml的黄芩苷标准品溶液。

3黄芩苷标准曲线验证

黄芩苷标准曲线并非每次检测都要建立，一般每周使用黄芩苷标准溶液对标准曲线验证一次即可，具体做法是取1ml黄芩苷标准溶液于25ml容量瓶中，然后加入5ml10％硝酸铝溶液，定容后摇匀避光放置20min，接着以试剂为空白，在330nm处测定吸光度值，再根据原标准曲线计算黄酮含量，与实际值进行对比，偏差不超过1％即可。经验证，实施例1中的标准曲线依然准确，故依然采用实施例1的标准曲线进行计算。

4样品总黄酮含量测定

移取0.1ml黄芩提取液于25ml容量瓶中，然后按3中方法进行显色和测定吸光度值，根据公式1计算黄芩超微粉中总黄酮含量为21.17％。

实施例3一种准确、快速测定黄芩药材及其制品中总黄酮含量的方法：1黄芩提取物溶液配制

准确称取0.3g黄芩提取物粉末，用55％(v/v)乙醇溶液溶解后定容至100ml。

2黄芩苷标准曲线

采用实施例1的标准曲线进行计算。

4样品总黄酮含量测定

移取0.1ml黄芩提取物溶液于25ml容量瓶中，然后加入5ml10％硝酸铝溶液，定容后摇匀避光放置20min，接着以试剂为空白，在330nm处测定吸光度值，计算出0.3g黄芩提取物中总黄酮含量为0.274g，总黄酮纯度为91.33％。实施例4一种准确、快速测定黄芩药材及其制品中总黄酮含量的方法：

1四个药材供应商的黄芩提取液制备

将四个药材供应商的黄芩药材分别命名为黄芩1号，黄芩2号，黄芩3号和黄芩4号，粉碎后，分别称取这四种黄芩粉末各1g于4个具塞三角瓶中，然后加入20ml70％(v/v)乙醇溶液。加塞密封后提取20min，过滤后，滤液并容至100ml备用。

2黄芩苷标准曲线

采用实施例1的标准曲线进行计算。

4样品总黄酮含量测定

移取0.1ml各黄芩提取物溶液于4个25ml容量瓶中，然后加入5ml10％硝酸铝溶液，定容后摇匀避光放置20min，接着以试剂为空白，在33nm处测定吸光度值，计算出四种药材的总黄酮含量如表5所示。

表5四个药材供应商黄芩总黄酮对比

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。