一种稳定性好的检测幽门螺杆菌抗原试剂盒的制备方法与流程

本发明涉及一种体外诊断试剂盒，具体涉及一种采用胶乳免疫比浊法定量检测幽门螺杆菌抗原的试剂盒。本发明属于生物检测技术领域。

背景技术：

幽门螺杆菌（helicobacterpylori，hp）是一种呈现螺旋形态的轻微厌氧菌，需要非常严格的生长条件。1983年，它首次成功地从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中分离出来，是目前研究中所知的唯一可以在动物胃中存活的一类微生物。

幽门螺杆菌属于革兰氏阴性杆菌，种类丰富，包括胃螺杆菌、拉普尼螺杆菌、犬幽门螺杆菌、黑氏螺杆菌和萨洛莫尼螺杆菌等类型。幽门螺杆菌生活在人体胃幽门处，是最常见的细菌病原体之一。幽门螺杆菌感染所导致的病症包括胃炎、消化道溃疡和淋巴增生性胃淋巴瘤等，严重的会发生病变，最终形成胃癌。2017年10月27日，国际癌症研究机构（iarc）将幽门螺杆菌添加至致癌物清单中，胃癌是癌症死亡的第二大原因。世界上有一半以上的人曾经或正在经受幽门螺杆菌的侵袭，而在某些国家90%的公民几乎都感染过这种病菌。50%左右0-5岁的人都会感染幽门螺杆菌，最初会导致人体发生慢性胃黏膜炎性病变，随后引起胃溃疡和胃萎缩，严重的则会发展成胃癌。幽门螺杆菌寄生于胃粘膜组织中，95%的十二指肠溃疡和67%-80%的胃溃疡是由其引起的。因此，专家认为，尽早发现幽门螺杆菌感染并治疗对预防胃癌具有重要意义。

随着医疗技术的不断发展，诞生了多种检测幽门螺杆菌的方法。主要包括以下方法。

一、侵入性检测方法

这种检测方法主要是依赖胃镜提取活组织进行检查，包括组织学检查、细菌培养、快速尿素酶试验（rut）、幽门螺杆菌基因检测，如聚酶链式反应（pcr）、寡核苷酸探针杂交等。

二、非侵入性检测方法

与侵入性检测方法相比，这种检测方法不需要采集胃活检组织，避免了因其所导致的感染及给患者带来的疼痛，临床应用比较广泛，具有快速、廉价、易操作等优点，但是检测的精确度容易受到多种因素的影响。非侵入性检测方法包括¹³c或¹⁴c尿素呼气试验（ubt）、粪便幽门螺杆菌抗原检测、血清学检查等。

传统幽门螺杆菌的检测方法自动化程度低且耗时长。因此，提供一种简便快捷且能特异性检测人体中幽门螺杆菌的方法成为迫切需要。

技术实现要素：

鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于胶乳免疫比浊法原理的检测试剂盒以测定人体中幽门螺杆菌抗原含量。该试剂存放稳定性得到显著延长，并且适用于各种类型半自动和全自动生化分析仪，同时具有使用操作简便快捷、灵敏度高及特异性强的特点。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于测定幽门螺杆菌抗原的基于胶乳免疫比浊法原理的试剂盒，其特征在于包括：试剂r1、试剂r2和校准品，其中试剂r1包括缓冲液、稳定剂、表面活性剂、电解质、反应增强剂和防腐剂，作用是提供本发明试剂与样本反应的最佳环境。试剂r2包括被幽门螺杆菌抗体包被的胶乳颗粒、缓冲液、防腐剂和稳定剂，作用是为胶乳颗粒提供一个稳定的反应环境。校准品包括幽门螺杆菌抗原、缓冲液、防腐剂和稳定剂。

所述试剂r1中反应缓冲液选自：tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液、mes缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、mopso缓冲液或dipso缓冲液中的一种，优选mes缓冲液，缓冲液的ph为6.0-9.0之间，优选ph为7.3，缓冲液的浓度在100-300mmol/l之间，优选200mmol/l。

所述试剂r1中稳定剂选自：小牛血清、牛血清白蛋白、蔗糖、edta或丙三醇中的一种，优选牛血清白蛋白，稳定剂质量浓度在0.2%-5.0%之间，优选1.0%。

所述试剂r1中表面活性剂选自：tween20、tween80、span40、span80、tritonx-100中的一种，优选tween80，质量浓度在0.1%-5.0%之间，优选1.0%。

所述试剂r1中电解质选自：氯化钠、氯化钾或碳酸钠中的一种，优选氯化钾，电解质质量浓度在1.0%-10.0%之间，优选3.0%。

所述试剂r1中反应增强剂选自：peg-4000、peg-6000、peg-8000、peg-10000中的一种，优选peg-6000，反应增强剂质量浓度在1.0%-10.0%之间，优选2.0%。

所述试剂r1中防腐剂选自：叠氮钠、叠氮锂、亚硝酸钠中的一种，优选叠氮钠，质量浓度在0.02％-0.5％之间，优选0.1％。

所述试剂r2中反应缓冲液选自：tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液、mes缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、mopso缓冲液或dipso缓冲液中的一种，优选mes缓冲液，缓冲液的ph为6.0-9.0之间，优选ph为7.5，缓冲液的浓度在100-300mmol/l之间，优选200mmol/l。

所述试剂r2中胶乳颗粒是具有核壳结构的聚苯乙烯纳米微球。

所述试剂r2中胶乳颗粒粒径在50-200nm之间，优选130nm。

所述试剂r2中胶乳颗粒质量浓度在0.1%-0.5%之间，优选0.3％。

所述试剂r2中幽门螺杆菌抗体选自：幽门螺杆菌全菌体蛋白抗体、热休克蛋白（hspb）、幽门螺杆菌黏附素（hpaa）、细胞毒素相关蛋白（caga）、尿素酶b亚单位（ureb）、空泡毒素（vaca）、鞭毛蛋白a亚单位（flaa）和b亚单位（flab）中的一种，优选尿素酶b亚单位（ureb)。

所述试剂r2中幽门螺杆菌抗体浓度在50-500mg/l之间，优选100mg/l。

所述试剂r2中稳定剂选自：小牛血清、牛血清白蛋白、蔗糖、edta或丙三醇中的一种，优选牛血清白蛋白，稳定剂质量浓度在0.2%-5.0%之间，优选0.5%。

所述试剂r2中防腐剂选自：叠氮钠、叠氮锂、亚硝酸钠中的一种，优选叠氮钠，质量浓度在0.02％-0.5％之间，优选0.1％。

所述校准品中缓冲液选自：tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液、mes缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、mopso缓冲液或dipso缓冲液中的一种，优选mes缓冲液，缓冲液的ph为6.0-9.0之间，优选ph为7.3，缓冲液的浓度在20-100mmol/l之间，优选50mmol/l。

所述校准品中稳定剂选自：小牛血清、牛血清白蛋白、蔗糖、edta或丙三醇中的一种，优选牛血清白蛋白，稳定剂质量浓度在0.2%-5.0%之间，优选1.0%。

所述校准品中防腐剂选自：叠氮钠、叠氮锂、亚硝酸钠中的一种，优选叠氮钠，质量浓度在0.02％-0.5％之间，优选0.1％。

所述校准品中至少包含两个浓度的幽门螺杆菌抗原，例如包含至少5个浓度的幽门螺杆菌抗原，包括但不限于1.5ng/ml、3ng/ml、6ng/ml、24ng/ml、48ng/ml。

与现有采用一步法制备的胶乳免疫比浊法的试剂盒相比，本发明采用换液法对试剂r2进行配制，使其具有更优的稳定性与特异性，操作步骤如下：

步骤1：以mes缓冲液分散胶乳颗粒，之后用edc活化15min，形成带有羧基官能团的胶乳颗粒；

步骤2：以12000rpm/min进行离心，15min后收集沉淀，分散胶乳颗粒，以上步骤重复3次；

步骤3：加入幽门螺杆菌抗体，37℃搅拌反应1h；

步骤4：加入封闭液，继续搅拌反应1h；

步骤5：以10000rpm/min进行离心，20min后收集沉淀，去除上清液，以储存液进行洗涤分散，即得包被幽门螺杆菌抗体的胶乳颗粒。

步骤1中，所述缓冲液为ph5.0-7.0的mes缓冲液，优选ph为6.0，浓度为20mmol/l-100mmol/l，优选50mmol/l；所述edc浓度为0.1-5.0mg/ml，优选1.0mg/ml；所述胶乳颗粒为粒径是130nm的聚苯乙烯纳米微球，质量浓度为0.3％。

步骤2中，所述分散剂为ph6.0-10.0的mes缓冲液，优选ph为8.5，浓度为100-300mmol/l，优选200mmol/l。

步骤3中，所述幽门螺杆菌抗体在溶液中的浓度为100mg/l。

步骤4中，所述封闭液为ph6.0-8.0的牛血清白蛋白缓冲液，优选ph为7.5，质量浓度为0.1%-10.0%，优选5.0%。

步骤5中，所述储存液为ph=7.5含有质量浓度为0.5％牛血清白蛋白、0.1％叠氮钠和200mmol/l的mes缓冲液的混合物。

本发明的测定原理是胶乳免疫比浊法，主要过程为：幽门螺杆菌抗体吸附于胶乳颗粒上，通过孵育使稀释的人粪便中的特异性抗原与抗体结合，产生浊度，经孵育后，吸光度变化量与检测样本中的特异性抗原浓度成正比。

本发明所述试剂盒为液体双试剂，采用胶乳免疫比浊法定量测定幽门螺杆菌抗原的含量，适用于各种类型半自动和全自动生化分析仪，并且存放稳定性得到显著延长，使用简单快速、灵敏度高、特异性强，具有广泛的应用前景。更重要的是，粪便幽门螺杆菌抗原检测是非侵入性检测，适用于任何患者，尤其是婴幼儿及患有精神性疾病的患者。此外，相对于幽门螺杆菌抗体检测，幽门螺杆菌抗原检测更为准确，具有更高的临床价值。

附图说明

图1为稳定性实验检测结果。

具体实施方式

下面通过实施例进一步阐述本发明的技术手段、优点及功效，以下实施例旨在说明本发明，但并不限定本发明的范围，本领域的技术人员在没有背离本发明的主旨和范围内，可对实施例进行修改，但这些修改均在本发明保护范围内。下述实验方法及实验材料若无特别说明，均为常规方法，并可容易地从商业公司获取。

实施例

实施例1：幽门螺杆菌抗原检测试剂盒的制备。

1.制备试剂r1。

所述试剂r1由摩尔浓度为200mmol/l的mes缓冲溶液（ph=7.3）、质量浓度为1.0％的牛血清白蛋白、质量浓度为3.0％的氯化钠、质量浓度为0.1％的叠氮钠、质量浓度为2.0%的peg-6000和质量浓度为1.0％的tween80组成，将上述组分按质量比例搅拌均匀即得试剂r1。

2.制备试剂r2。

所述试剂r2由被幽门螺杆菌抗体包被的胶乳颗粒、缓冲液、防腐剂和稳定剂组成，通过以下步骤制备。

准备一定量粒径为130nm的聚苯乙烯胶乳微球，使其在溶液中的质量浓度为0.3%，以ph为6.0的mes缓冲液（50mmol/l）分散胶乳微球，定容至9.9ml，再加入0.1ml浓度为1.0mg/mledc活化15min，使其形成带有羧基官能团的胶乳颗粒。

活化完成后，以12000rpm/min离心15min，收集沉淀，以10mlph为7.5的mes缓冲液（200mmol/l）分散胶乳颗粒，以上步骤重复3次。

加入一定量幽门螺杆菌抗体，使其在溶液中的浓度为100mg/l，进行偶联反应，在37℃下搅拌反应1h。

偶联完成后，加入质量浓度为5.0%、ph为7.5的牛血清白蛋白缓冲液4ml进行封闭，37℃继续搅拌反应1h。

反应完成后，以10000rpm/min离心20min，去除上清液，以ph=7.5含有质量浓度为0.5％牛血清白蛋白、0.1％叠氮钠和200mmol/l的mes缓冲液洗涤分散并定容至10ml，即得试剂r2。

3.制备校准品。

在50mmol/lph=7.3的mes缓冲液中，分别加入1.5ng/ml、3ng/ml、6ng/ml、24ng/ml、48ng/ml浓度的幽门螺杆菌抗原，同时添加质量浓度为1.0％的牛血清白蛋白、质量浓度为0.1％的叠氮钠，搅拌均匀得到多点校准品。

实施例2：幽门螺杆菌抗原检测试剂的测定方法

1.本发明所述试剂盒的测定条件

分析方法：两点终点法

反应方向：上升反应

测定主波长：450nm

测定副波长：650nm

测定温度：37℃

样本量：10μl

r1用量：200μl

r2用量：50μl

2.测定方法

首先向200μl试剂r1中加入10μl待测样本，37℃下预孵育2min后加入50μl试剂r2，立即测定空白吸光度a1，继续孵育5min，测定反应吸光度a2。

所述样本为人粪便样本，通过采便管进行采样后处理。

实施例3：本发明试剂盒与酶联免疫法试剂盒及胶乳免疫比浊法试剂盒检测临床样本的相关性比较。

用本发明的试剂盒与市场常见的国家食品药品监督管理局认可的a公司的胶乳免疫比浊法试剂盒及b公司的酶联免疫法试剂盒对50例患者样本同时进行检测。

a公司的胶乳免疫比浊法试剂盒检测原理是：通过交联在胶乳微球上的抗体与处理过的样本中的特异性抗原结合而产生浊度，浊度的上升与抗原的浓度成正相关。与本发明所述试剂盒不同的是，该试剂是采用一步法制得的。

b公司的酶联免疫法试剂盒检测原理是：使抗体与某种酶相连成酶标抗体，在测定时，将吸附在固相载体上的待测标本与酶标记的抗体发生特异性结合，加入参与酶反应的底物后，酶催化底物生成有色产物，得到产物的量与标本中受检抗原的量成正相关，故可根据颜色变化的深浅对标本中相应的抗原进行定量分析。

样本检测通过全自动生化分析仪进行，参考值：＜0.5ng/ml为阴性标本，≥0.5ng/ml为阳性标本。

将本发明与a及b公司试剂盒检测临床样本的相关性进行比较。如表1和表2所示，本发明试剂盒与a公司、b公司试剂盒测试样本的阴阳性符合率为分别为90%和94％，说明本发明试剂盒特异性良好。

表1.本发明试剂盒和a公司的胶乳免疫比浊法试剂盒检测样本的相关性。

检测结果符合率：90%。

表2.本发明试剂盒和b公司酶联免疫法试剂盒检测样本的相关性。

检测结果符合率：94%。

实施例4：本发明试剂盒与a公司试剂盒的稳定性比较。

将本发明实施例1配制的试剂盒与a公司试剂盒分别均匀分装成r1体积为20ml、r2体积为5ml的13份，保存于2~8℃冰箱中12个月，在放置的第一天各取出一份对浓度为4.0ng/ml的质控品进行检测，在每月的最后一天同时各取出一份对浓度为4.0ng/ml的质控品进行检测，如图1所示。

由图1可看出，本发明实施例1检测试剂在2~8℃条件下保存12个月较a公司试剂更加稳定。

本发明试剂盒的配制方法与现有技术相比，具有如下特点。

首先，本发明试剂盒与现有的胶乳免疫比浊法的试剂盒相比，具有更优的稳定性，并且适用于各种类型半自动和全自动生化分析仪，使用简单、快速、灵敏度高、特异性强。此外，粪便幽门螺杆菌抗原检测是非侵入性检测，适用于任何患者，尤其是婴幼儿及患有精神性疾病的患者。相对于幽门螺杆菌抗体检测，幽门螺杆菌抗原检测更为准确，具有更高的临床价值。