C/EBPβ在制备诊断或辅助诊断急性缺血性脑卒中产品中的应用

c/ebp
β
在制备诊断或辅助诊断急性缺血性脑卒中产品中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学领域中c/ebpβ在制备诊断或辅助诊断急性缺血性脑卒中产品中的应用。


背景技术：

2.转录因子ccaat/增强子结合蛋白β(ccaat/enhancer binding protein beta,c/ebpβ)是属于c/ebp家族成员的一个重要的转录因子，该家族的成员与神经变性病或脑损伤的炎症反应相关，这些转录调节活化的小胶质细胞基因，结合多种细胞因子或促炎基因的启动子区、增强子区。c/ebpβ在正常生理状态下参与调节细胞生长、分化等功能，而在脑损伤及神经变性病的病理过程中，c/ebpβ主要表达于小胶质细胞中，可介导小胶质细胞失调并引发炎症反应，在加快神经系统疾病的病程进展中起着重要作用。
3.由于血管危险因素的负担日益加重以及突出的人口老龄化问题，导致神经血管疾病的发生越来越普遍。其中，急性缺血性脑卒中占到所有卒中比例的87％，因其发病率高、复发率高、死亡率高、致残率高，是世界公认严重威胁人类健康的重大疾病。超早期或早期(发病6小时内)、个体化治疗对于急性脑卒中患者的预后至关重要。目前存在以下几个问题：(1)急性缺血性脑卒中是通过临床评估和神经影像学诊断的，需要的时间较长；(2)许多短暂性缺血发作的患者在到达医院时已经无症状，无法进行准确的神经功能评估；(3)即使患者在卒中时的基本特征相似，预后也可能存在较大差异。这些因素都会延误对患者的诊断和针对性的治疗，导致错过最佳的治疗时间。虽然血液生物标志物已经在其它血管疾病的诊断中使用了很多年，但是尚未见有关于卒中的生物标志物应用于临床，而目前报道的生物标志物的准确性远远低于临床实践的要求。
4.所以，开发快速、便捷的急性缺血性脑卒中患者血液生物标志物诊断指标对于卒中的早期诊断及后续治疗具有重要的提示作用。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是如何诊断或辅助诊断急性缺血性脑卒中。
6.为解决上述技术问题，本发明提供了诊断或者辅助诊断哺乳动物急性缺血性脑卒中的生物标志物，所述生物标志物为转录因子ccaat/增强子结合蛋白β(c/ebpβ)。
7.本发明还提供检测样品中上述生物标志物含量的物质的下列任一应用：
8.u1、在制备诊断或辅助诊断哺乳动物急性缺血性脑卒中产品中的应用；
9.u2、在制备预测哺乳动物急性缺血性脑卒中预后的产品中的应用；
10.u3、在制备筛查或辅助筛查哺乳动物急性缺血性脑卒中患者产品中的应用。
11.上述应用中，所述样品是外周血浆。
12.上述应用中，所述检测样品中上述c/ebpβ含量的物质可包括检测上述c/ebpβ含量的试剂和/或仪器，如通过elisa的方法检测上述c/ebpβ含量所需的试剂和仪器。
13.为解决上述技术问题，本发明还提供了产品，其为下列任一产品：
14.v1、诊断或辅助诊断哺乳动物急性缺血性脑卒中产品；
15.v2、预测哺乳动物急性缺血性脑卒中预后的产品；
16.v3、筛查或辅助筛查哺乳动物急性缺血性脑卒中患者的产品；
17.所述产品包含检测上述生物标志物含量的试剂和/或仪器。
18.上述产品中，所述样品是外周血浆。
19.上述任一所述哺乳动物可为人或小鼠。
20.发明人首次发现，c/ebpβ蛋白在健康人和急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,ais)患者外周血浆中表达，且血浆中c/ebpβ蛋白的表达水平可以提高传统模型对卒中患者的3个月预后和治疗效果的预测能效。
附图说明
21.图1为本发明实施例1中elisa检测小鼠外周血浆中c/ebpβ蛋白表达水平。检测对象分别为正常小鼠的外周血浆，以及mcao模型小鼠脑缺血后3天的外周血浆。所示数据表示为平均值
±
标准差，***代表脑缺血后3天的小鼠与正常小鼠比较显著性分析结果为p<0.001。
22.图2为本发明实施例2中elisa检测健康人和ais患者血浆中c/ebpβ蛋白的表达水平。ais患者为急性缺血性脑卒中患者。所示数据表示为平均值
±
标准差，*代表ais患者与健康人比较显著性分析结果为p<0.05。
23.图3为本发明实施例2中ais患者以mrs≤2二分类比较两组患者外周血浆中c/ebpβ蛋白表达水平。所示数据表示为平均值
±
标准差，**代表mrs>2与mrs≤2的ais患者比较显著性分析结果为p<0.01。
24.图4为本发明实施例3中健康人和ais患者血浆外泌体中检测c/ebpβ蛋白表达。图4的a图为外泌体的纳米颗粒示踪分析。图4的b图为透射电镜的外泌体形态鉴定，标尺＝200nm。图4的c图为westernblot检测外泌体蛋白标志物；分别表示阳性对照及血浆中提取出的外泌体。图4的d图为westernblot检测健康人和ais患者外泌体中c/ebpβ蛋白表达水平。
具体实施方式
25.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
26.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
27.以下实施例中的c57bl/6j雄性小鼠为标准品系，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：scxk(京)2019
‑
0009。
28.以下实施例中的定量试验，结果取平均值。
29.实施例1、脑缺血小鼠外周血浆中c/ebpβ蛋白表达变化
30.实验对象：将c57bl/6j雄性小鼠(10～12周龄，体重为22～24g，清洁级别为无特定
病原体级(specific pathogen free，spf级)随机分为mcao模型小鼠组和正常对照小鼠组，每组10只，具体各组处理如下：
31.mcao模型小鼠组：小鼠手术前一晚禁食，但不禁水，利用线栓法制作小鼠大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion，mcao)。具体手术如下：小鼠称重后用4％恩氟烷诱导麻醉，应用小动物呼吸机麻醉机，1％～2％恩氟烷混合70％n2o和30％o2维持麻醉。术中监测肛温、血糖、血气，保证各项指标维持在正常范围。模型制作过程中，用激光多普勒(perimed，pf5001)监测小鼠大脑中动脉分布区的血流量。将小鼠仰卧于手术台上，取颈部正中切口，分离出右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。分别电凝切断右侧甲状腺动脉和枕动脉。在颈外动脉结扎两条9/0尼龙线，其中近心端不做紧密结扎，远心端做紧密结扎后将远心端血管电凝切断。在颈总动脉的近心端结扎缝合线，不做紧密结扎。颈内动脉的远心端用小鼠动脉夹夹闭血管用以阻断血流。用显微剪在颈外动脉的两结扎处之间剪一小口，插入头端直径0.19mm的线栓(701956pk5re；doccol corporation)，松开近心端的结扎线，使线栓经颈内动脉进入大脑中动脉直至遇到轻微阻力，进栓深度约10～12mm。拉紧颈外动脉近心端的结扎线以固定线栓，解开颈总动脉上的缝合线恢复血流。缝合皮肤后将小鼠侧卧放到一个新的饲养笼中，45min后再次将小鼠麻醉，拔出线栓实现血流再灌注后缝合皮肤，放入饲养中正常饲养3天后进行小鼠外周血浆的分离。
32.正常对照小鼠组：不做手术，其余处理同mcao模型小鼠组。
33.小鼠外周血浆的分离：mcao模型小鼠组和正常对照小鼠组分别通过腹主动脉穿刺采外周血。具体方式如下：用水合氯醛麻醉小鼠后以仰卧放在解剖板上，将四肢充分伸展并固定。沿腹中线剪开皮肤与腹膜，充分暴露腹腔。用滤纸轻轻推移肠管，可见腹主动脉与腹主静脉。选择腹主动脉分成左右额动脉分叉处的向心端1～3mm处为穿刺点，用12号注射针头斜面朝下刺入，深度约5mm左右，抽取500μl外周血后，将其轻轻打入含edta
‑
k2抗凝剂的离心管中，轻轻颠倒8～10次混匀。采血后1h内分离血浆，将血液样品用800g室温离心10min，收集上清至新的ep管中，4℃16,000g离心10min，收集上清至新的ep管，收集得到的mcao模型小鼠外周血浆和正常对照小鼠外周血浆用于后续实验。
34.外周血浆c/ebpβ蛋白(genebank gene id:12608，更新于2021年5月9日)表达水平的检测：采用elisa的方法按照说明书进行检测。elisa检测试剂盒采用上海双赢生物科技有限公司生产的小鼠(mouse)ccaat增强子结合蛋白β(c/ebpβ)elisa检测试剂盒(sy
‑
m09127)。
35.mcao模型小鼠外周血浆和正常对照小鼠外周血浆进行elisa检测，结果如图1所示，与正常对照小鼠相比，mcao模型小鼠脑缺血后3天血浆中c/ebpβ蛋白的表达水平显著降低。
36.实施例2、ais患者外周血浆中c/ebpβ的表达变化，以及其对传统模型预测卒中患者预后效果的影响
37.实验对象：本研究以首都医科大学宣武医院神经内科为研究基地，神经内科常年收治急性缺血性脑卒中(ais)患者，并建立标本库，能为本研究提供丰富的病例资料。研究患者的血液来源于2015年至2019年间在首都医科大学宣武医院接受治疗的ais患者。正常对照血液样本均来源于首都医科大学宣武医院健康体检人群。本实施例所有标本均获得患者或其委托人签署知情同意，所有涉及人体标本的研究均获得首都医科大学宣武医院伦理
委员会批准。
38.临床资料采集：临床资料的收集主要分ais患者和正常人两部分，均需包含一般资料：包括患者的姓名、性别、年龄、职业、既往病史、家族史、女性月经史以及婚育史等。ais患者主要由住院资料整理而来。主要包括上述一般资料外，还包括临床特征，如血常规的检查、mri检测、mrs评分、nihss评分、sich评分，以及常规辅助检查等资料。同时获得所有人的随访同意，检查结果资料完善保存。
39.本实施例中，ais患者的入选标准为：
①
年龄18岁
‑
80岁；
②
临床考虑为为缺血性卒中：突发、局灶的、表现为神经功能缺失(主要症状包括言语障碍、运动不能、认知、凝视障碍、视野缺损和视觉忽视)的临床症状；
③
发病在4.5h内，且卒中症状持续至少30min，治疗前无明显改善；
④
临床表现为前循环梗死症状，nihss评分≥4分；
⑤
ct影像结果排除脑出血、脑肿瘤等其他脑血管病，且无大面积脑梗死早期征象；
⑥
患者(或者监护人或者直系亲属)签署知情同意书。
40.排除标准：
①
既往有颅内出血病史，近3个月有头颅外伤，近3周有胃肠或泌尿系出血，近2周有大的外科手术，近1周有不易压迫止血部位的动脉穿刺；
②
近3个月内脑梗死患者心梗，不包括陈旧性腔梗而未留神经缺损；
③
严重的心、肝、肾或糖尿病；
④
已口服抗凝药，inr>1.5；
⑤
血小板数<100
×
109/l，血糖<50mg/dl；
⑥
收缩压>185mmhg，或舒张压>110mmhg；
⑦
不能进行核磁共振检查者，如有幽闭恐惧症、心脏瓣膜置换术或者安置金属材质的义齿；
⑧
妊娠；
⑨
不愿签署知情同意、不愿接受随访或研究者认为不适合该项临床研究者。
41.健康人的入选标准为：年龄18岁～80岁，各项指标正常的人，男女不限。
42.ais患者外周血浆收集：血液的收集，每位ais患者入院后第一时间静脉采血一次(5ml/管)用于后续实验研究。血浆样本收集采血管为乙二胺四乙酸二钾(ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium,edta
‑
k2)抗凝管，样本在2h内完成血浆的分离及冻存，分装(1ml/管)后放入
‑
80℃冰箱长期保存。
43.外周血浆c/ebpβ蛋白(genebankgene id:1051，更新于2021年5月18日)表达水平的检测：采用elisa的方法按照说明书进行检测。elisa检测试剂盒采用上海双赢生物科技有限公司生产的人(human)ccaat增强子结合蛋白β(c/ebpβ)elisa检测试剂盒(sy
‑
ela07329)。
44.(1)ais患者后外周血浆中c/ebpβ蛋白表达变化
45.分离ais患者(257例)外周血浆进行elisa检测，结果如图2所示，与健康人(88例)外周血浆相比，ais患者血浆c/ebpβ蛋白的表达水平显著降低。
46.(2)ais患者外周血浆中c/ebpβ的表达对传统模型预测患者预后效果的影响
47.通过对300例ais患者按3个月后的mrs评分进行分类(179例为mrs≤2的ais患者，121例为mrs>2的ais患者)外周血浆c/ebpβ的蛋白表达水平分别与mrs神经功能评分以及传统临床模型预测风险效能等进行统计学分析。结果如表1、图3所示，ais患者按3个月后mrs≤2二分类作基线特征表，分别对两组患者的人口学特征、既往病史、卒中特点及治疗、临床生物学特征、结果评价、生物学评价以及c/ebpβ的蛋白表达水平进行比较。与mrs≤2的ais患者相比，mrs>2的ais患者外周血浆中c/ebpβ表达水平显著降低。表2提示ais患者外周血浆中c/ebpβ表达水平可以单独或联合预测患者不良结局风险，其中，不良结局是指患者3个
月后mrs>2。即当ais患者入院时外周血浆中c/ebpβ蛋白表达水平较高时，则该患者3个月后mrs>2的风险较低，表明神经功能较好。表3表明，对比传统的临床模型，加入外周血浆c/ebpβ蛋白水平表达因素后，能够显著提升对ais患者的诊断效能(auc:78.3vs.82.8；p<0.05)。
48.表1ais患者按3个月mrs二分类作基线特征表
49.[0050][0051]
表2ais患者外周血浆中c/ebpβ可以单独或联合预测患者不良结局(3个月mrs>2)风险
[0052][0053]
注：model 1是指单独用患者血浆中c/ebpβ蛋白水平估算患者不良预后or值；model 2是指纳入年龄、入院nihss评分、高血压、淋巴细胞计数、甘油三酯和血浆中c/ebpβ白水平估算患者不良预后or值。纳入模型的变量由lasso回归筛选得到(&,连续变量；#,分类变量)。
[0054]
模型构建步骤：考虑到临床变量间存在的共线性，采用lasso回归对基线资料中的自变量系数进行惩罚，最后得出纳入变量年龄、入院nihss评分、高血压、淋巴细胞计数、甘油三酯水平能够在共线性较小的情况下得到较高的aic值，故将这些变量纳入到临床模型中。
[0055]
其中两种预测患者3个月不良结局风险应用方法(患者外周血浆中c/ebpβ水平作为一个与患者3个月不良预后的负相关因子)：
[0056]
①
当ais患者入院时外周血浆中c/ebpβ水平每升高一个单位，那么患者3个月不良预后(mrs>2)风险增加0.988倍(即降低1.012倍)；
[0057]
②
当ais患者入院时外周血浆中c/ebpβ<51.26pg/ml，那么该患者3个月不良预后(mrs>2)风险较c/ebpβ>51.26pg/ml的患者增加1.679倍。
[0058]
以上两种模型均提示：当ais患者入院时外周血浆中c/ebpβ蛋白表达水平较高时，则该患者3个月后mrs>2的风险较低，即神经功能表现较好。
[0059]
表3ais患者外周血浆中c/ebpβ提高传统临床模型预测患者的不良预后风险效能
[0060][0061]
其中，clinical model是指患者年龄、高血压、淋巴细胞计数、甘油三酯，和入院nihss评分纳入分析，clinical model+c/ebpβ是指患者年龄、高血压、淋巴细胞计数、甘油三酯、入院nihss评分和c/ebpβ蛋白表达水平纳入分析。将ais患者3个月后mrs>2作为不良预后，auc表示预后风险效能。
[0062]
实施例3、ais患者血浆中外泌体中c/ebpβ蛋白的表达
[0063]
实验对象：健康人和ais患者，入组标准如实施例2所述。
[0064]
血浆外泌体的分离:采用exosupur试剂盒(恩泽康泰)，按照说明书通过排阻和超滤提取血浆中外泌体。
[0065]
外泌体生物学特征鉴定与分析:(1)外泌体的形态鉴定：取20μl外泌体重悬液滴于电镜专用铜网上，静置3min。样本固定后，用醋酸双氧铀负染，室温静置5min，用吸水滤纸吸干残留的多余液体，在60w白炽灯下静置2～3min，待样本干燥后，置于透射电镜(hitachi,h
‑
7650)下观察形态；(2)外泌体的颗粒直径鉴定：纳米颗粒示踪分析(nanoparticle tracking analysis,nta)检测外泌体粒径及浓度。将已知直径的荧光二氧化硅纳米颗粒与外泌体样本混合后，在zetaview纳米颗粒追踪分析仪(pmx
‑
110)上选用波长为532nm的激光器，检测通道为散射通道和pe荧光通道，对样本混合体系进行检测。以系列二氧化硅纳米颗粒的直径及散射光强度绘制出标准工作曲线，对外泌体的折射率差异进行校正，将外泌体的散射光强度转变为直径参数，并计算出外泌体的颗粒直径；(3)外泌体蛋白的鉴定分析：
外泌体悬液用bca蛋白定量试剂盒(thermoscientific,#23227)定量总蛋白，随后进行sds
‑
page电泳，湿转1.5h，5％bsa室温封闭2h，tbs
‑
t洗涤后孵育外泌体蛋白阳性标志物：cd9(proteintech,#60232
‑1‑
ig)、tsg101(absin,#abs115706)、cd63(santa cruz,#sc
‑
5275)，外泌体蛋白阴性标志物：calnexin(proteintech,#10427
‑2‑
ap)，以及目标蛋白c/ebpβ(cell signaling technology,#3087)，4℃孵育过夜。tbst缓冲液洗涤后加入相应二抗(cell signaling technology,#7074,#7076)，室温孵育1h，随后采用电化学发光仪(olympus,fluro chen 2.0)进行显影及拍照。
[0066]
分离并鉴定健康人及ais患者血浆外泌体，并检测外泌体中c/ebpβ蛋白的表达。结果如图4所示，从血浆中顺利提取出外泌体，平均粒径为94.3nm，透射电镜观察可见清晰囊泡形态结构，还顺利检测出外泌体表面蛋白标志物。此外，通过westernblot的方法检测到健康人和ais患者血浆中均表达c/ebpβ蛋白，在总蛋白上样量一致(15μg)的情况下，ais患者血浆中c/ebpβ蛋白表达水平显著低于健康人。
[0067]
通过以上研究结果发现，脑缺血小鼠以及ais患者急性期外周血浆中c/ebpβ蛋白表达水平相比正常生理状态时显著降低，且ais外周血浆中c/ebpβ表达水平可以单独或联合预测患者不良结局风险。对比传统的临床模型，加入外周血浆c/ebpβ蛋白表达水平因素后，能够显著提升的诊断效能。此外，c/ebpβ蛋白以外泌体的形式存在于血浆中。综上所述，血浆中c/ebpβ是判断ais患者预后效果的生物标志物。这种血液检查方法容易被受检者接受，更可成为ais患者的早诊、病情进展的判断以及预后评估的有效手段。
[0068]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。