用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统及其检测方法

1.本发明属于传感检测技术领域，具体涉及一种用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统及其检测方法。


背景技术：

2.核酸适配体(aptamer)是通过指数富集的配体进化技术(selex)从随机的单链核酸序列中筛选的寡核苷酸序列或者短的多肽，一般是单链dna或者rna序列，并对靶标物质具有高特异性和高亲和力。核酸适配体又被称为化学抗体，已广泛应用于传感器的构建。相比抗体而言，核酸适配体具有如下的优点：特异性和亲和性较好；核酸适配体易于合成、纯化及修饰，根据不同的传感器需求可灵活设计；并且其性质稳定，不易受外界环境影响，易于保存。
3.急性心肌梗塞(ami)是全世界发病率和死亡率的主要原因之一。心脏标记物的灵敏检测作为一种有用的诊断工具，对于准确诊断患有ami症状的患者非常重要。ami的最佳标志物包括肌钙蛋白i(ctni)或肌红蛋白(mb)。一些常规方法已被用于检测肌钙蛋白i或肌红蛋白，例如质谱，液相色谱，电化学和表面等离振子共振(spr)等。这些方法大多数都显示出高灵敏度，但是这些方法既耗时又需要昂贵的设备，因此无法应用于即时检验(poc)测试。
4.现有的基于适配体的石英晶体微天平生物传感器大多使用表面镀金的石英晶体，一方面由于石英晶片容易损耗，成本增加；另一方面，晶体的质量灵敏度与晶体的基频的平方成正比，而基频与晶体的厚度成反比，因此在裸石英面上镀金在一定程度上降低了石英晶体的灵敏度。此外，大多数的基于适配体的石英晶体微天平生物传感器是通过dna杂交、酶催化底物、磁珠富集等技术进行扩增来提高灵敏度的，但是对dna、酶这类物质参与的反应需要严格控制反应所需的条件如温度和ph，而基于增量法的磁珠富集技术需要增加清洗步骤以移除未结合的磁珠，增加了许多额外的时间，使其无法在短时间实时检测。
5.现有的基于适配体的石英晶体微天平生物传感器一般采用流动注射方式来增加反应发生的概率，从而尽可能对低浓度的待测物进行检测，然而流动注射方式对实验条件很严格，例如在检测中产生的气泡和流速变化都会对频率响应有着极大的影响从而导致检测失败，并且流动注射方式需要的消耗的待测物的量较大。而一些不使用流动注射方式的石英晶体微生物传感器的检测限有限，只能对高浓度的待测物进行检测，主要是因为生物分子在溶液中移动缓慢，大部分无法与晶体表面的受体结合。
6.本发明基于适配体检测肌钙蛋白i或肌红蛋白为例，利用高频单面无极石英晶体微天平实现对检测物实现灵敏的检测，再结合交变磁场增加待测物与探针的结合概率以及磁珠富集技术进一步提高灵敏度。此外，利用谐振场调幅法区分非特异性结合和特异性结合，建立了高灵敏度和高选择性生物传感器，从而能够高效快速的蛋白质检测。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种灵敏度高、生物选择性好和检测速度快的用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统及其检测方法。
8.本发明这种用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统，包括系统控制与数据采集装置、dds信号发生器、无极石英晶体启振耦合器，相敏检波检测器，温度控制装置、自动进样装置、以及高频单面无极适配体压电石英晶体传感器；系统控制与数据采集装置分别与温度控制装置、自动进样装置、dds信号发生器、相敏检波检测器相连；dds信号发生器与无极石英晶体启振耦合器互联；
9.高频单面无极适配体压电石英晶体传感器包括有检测池、固定在检测池内的加热装置和固定在检测池内修饰高频单面无极压电石英晶体，以及位于检测池外的磁场发生装置；检测池上开设有进样口和出样口，进样口与自动进样装置相连，加热装置与温度控制装置连接，修饰高频单面无极压电石英晶体的激励线圈与无极石英晶体启振耦合器相连，接收线圈与相敏检波检测器相连；磁场发生装置与系统控制与数据采集装置相连；
10.检测过程中，系统控制与数据采集装置使dds信号发生器产生激励信号，激励信号通过无极石英晶体启振耦合器作用于修饰高频单面无极压电石英晶体，由于修饰高频单面无极压电石英晶体在检测时发生反生，导致信号发生改变，改变信号通过相敏检波检测器检测到信号，输送至系统控制与数据采集装置，即可获得该表的信号；
11.自动进样装置控制进样量和进样时间，温度控制装置控制检测时的温度，磁场发生装置用于保证修饰高频单面无极压电石英晶体与检测样品的反应过程。
12.本发明这种用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感器系统的检测方法，包括以下步骤：
13.1)修饰高频单面无极压电石英晶体；
14.2)制备适配体
‑
磁珠复合物；
15.3)制备标准曲线：将步骤1)中修饰的高频单面无极压电石英晶体固定在检测池中，开启传感系统，调节dds信号发生器的电压为1v，通过自动进样装置向检测池中注入缓冲液，获得平稳的基线后，排出缓冲液；再接着通入设定浓度的心梗标志物和步骤2)的适配体
‑
磁珠复合物，通过磁场发生器产生交变磁场增加反应结合概率，反应时间为30min，关掉交变磁场待频率，稳定后，记录此时的频率f0；通过dds信号发生器增加电压至10v，使晶体表面振动加剧，除去非特异性物质，稳定后，记录此时的频率f1；然后通过dds信号发生器增加电压至20v，在20v的高压力下出现频率大幅度增加，键发生断裂，频率稳定后，记录键断裂后的谐振频率f2；计算频差δf＝f2‑
f1，获得对应的传感信号，改变心梗标志物的浓度，然后建立浓度与频差δf的标准曲线；
16.4)按照步骤4)中的方法检测未知浓度的心梗标志物，得到频差δf，然后根据标准曲线即可获得其浓度。
17.所述的心梗标志物为肌钙蛋白i或肌红蛋白。
18.所述步骤1)中，修饰高频单面无极压电石英晶体的方法有3种。
19.所述修饰高频单面无极压电石英晶体的具体方法，包括以下步骤：
20.a
‑
1取高频单面无极压电石英晶体于无水乙醇中清洗后氮气吹干，放于紫外照射清洗机中照射8～12min，取出后再用无水乙醇和超纯水彻底冲洗电极，氮气吹干；得到处理
后的晶片；
21.a
‑
2向经过步骤a
‑
1中处理过的晶片滴15～25μl链霉亲和素溶液于3～5℃过夜孵育，得到链霉素修饰的晶片；
22.a
‑
3向经过步骤a
‑
2中链霉素修饰的晶片上滴加15～25μl适配体i溶液，反应2～4h，得到适配体修饰后的晶片，其中：适配体ⅰ溶液的浓度为1.5～2.5μm，适配体i为生物素修饰的肌钙蛋白ⅰ适配体或者肌红蛋白适配体；生物素修饰肌钙蛋白ⅰ适配体的序列为5
’‑
biotin
‑
cgtgcagtacgccaacctttctcatgcgctgcccctctta
‑3’
；生物素修饰肌红蛋白适配体序列为5
’‑
biotin
‑
atccagagtgacgcagcacaacgtgcaaattatacctgttttccccttttcctacaagtgctatggacacggtggcttagt
‑3’
；
23.a
‑
4用缓冲溶液i冲洗步骤a
‑
3中适配体修饰后的晶片，接着滴加15～25μl封闭剂，并进行封闭反应0.5～1.5h，封闭完毕后，缓冲溶液i，双蒸水分别清洗，得到修饰探针的高频单面无极压电石英晶体，然后置于4℃下保存备用；其中：缓冲溶液i为pbs缓冲液，ph为7.4，浓度为10mm；封闭剂为0.1wt％的牛血清蛋白溶液。
24.所述修饰高频单面无极压电石英晶体的具体方法，包括以下步骤：
25.b
‑
1将高频单面无极压电石英晶体于piranha酸处理10～20min，取出后再用无水乙醇和超纯水彻底冲洗电极，氮气吹干，得到处理过的晶片；其中：piranha酸为浓硫酸:30％h2o2＝3:1；
26.b
‑
2向经过步骤b
‑
1处理过的晶片滴加15～25μl的3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)溶液中固定1～2h；得到aptes修饰的晶片；其中：3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷溶液的浓度为2～5wt％，溶剂为无水甲苯；
27.b
‑
3用缓冲溶液i冲洗步骤b
‑
2中aptes修饰的晶片，接着在晶片上滴加15～25μl戊二醛溶液进行反应0.5～2h；得到戊二醛处理的晶片；其中戊二醛溶液浓度为2.5～5wt％；
28.b
‑
4用缓冲溶液i冲洗步骤三戊二醛处理的晶片，接着在晶片滴20μl2μm适配体i溶液，反应2～4h，得到适配体修饰后的晶片，其中：适配体ⅱ溶液的浓度为1.5～2.5μm，适配体ⅱ为氨基修饰的肌钙蛋白ⅰ适配体或者肌红蛋白适配体，氨基修饰的肌钙蛋白ⅰ适配体的序列为5
’‑
nh2(ch2)6‑
cgtgcagtacgccaacctttctcatgcgctgcccctctta
‑3’
；氨基修饰肌红蛋白适配体序列为5
’‑
nh2(ch2)6‑
atccagagtgacgcagcacaacgtgcaaattatacctgttttccccttttcctacaagtgctatggacacggtggcttagt
‑3’
；
29.b
‑
5用缓冲溶液i冲洗b
‑
4中适配体修饰后的晶片，再接着滴加15～25μl封闭剂，并进行封闭反应0.5～1.5h，封闭完毕后，缓冲溶液i，双蒸水分别清洗，得到修饰探针的高频单面无极压电石英晶体，然后置于4℃下保存备用；其中：缓冲溶液i为pbs缓冲液，ph为7.4，浓度为10mm；封闭剂为0.1wt％的牛血清蛋白溶液。
30.所述修饰高频单面无极压电石英晶体的具体方法，包括以下步骤：
31.c
‑
1将高频单面无极压电石英晶体浸入1.5～2.5wt％3
‑
氨基丙基甲基二乙氧基硅烷(3
‑
apdes)溶液中，在惰性环境下浸泡2～4h，得到3
‑
氨基丙基甲基二乙氧基硅烷处理的晶片；其中：3
‑
apdes的溶剂为无水乙醇；
32.c
‑
2将步骤c
‑
1中3
‑
氨基丙基甲基二乙氧基硅烷处理的晶片按照乙醇，乙醇/丙酮(1：1(v/v))和丙酮的顺序依次浸出到上述溶剂中，每组溶剂中都进行超声处理1～2min；接着在晶片上滴加15～20μl的100mm琥珀酸酐溶液，然后用去离子水冲洗并干燥，得到琥珀酸
酐修饰的晶片；
33.c
‑
3将步骤c
‑
2中琥珀酸酐修饰的晶片加入15～25μl含3mg/ml的(1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)进行活化，得到活化后的晶片；
34.c
‑
4用缓冲溶液i冲洗步骤c
‑
3的活化后的晶片，接着向晶片滴15～25μl2μm适配体i溶液，反应2～4h，得到适配体修饰的晶片，其中：缓冲溶液ⅲ为pbs缓冲液，ph为7.4，浓度为10mm；适配体ⅲ为氨基修饰的肌钙蛋白ⅰ适配体或者肌红蛋白适配体，氨基修饰的肌钙蛋白ⅰ适配体的序列为5
’‑
nh2(ch2)6‑
cgtgcagtacgccaacctttctcatgcgctgcccctctta
‑3’
；氨基修饰肌红蛋白适配体序列为5
’‑
nh2(ch2)6‑
atccagagtgacgcagcacaacgtgcaaattatacctgttttccccttttcctacaagtgctatggacacggtggcttagt
‑3’
；
35.c
‑
5用缓冲溶液i冲洗步骤c
‑
4的适配体修饰的晶片，再滴加15～25μlbsa进行封闭，并进行封闭反应0.5～1.5h，得到封闭后的晶片，其中：bsa浓度为0.1wt％；
36.c
‑
6用缓冲溶液i，双蒸水分别清洗步骤c
‑
5封闭后的晶片，并用氮气吹干，得到修饰探针的高频单面无极压电石英晶体，然后置于4℃下保存备用。
37.所述的步骤2)中制备适配体
‑
磁珠复合物的具体方法，包括以下步骤：
38.步骤一、活化带羧基的磁珠：取带羧基的纳米磁珠原液于ep管中，加入缓冲液ii清洗，再用缓冲溶液ii配置的(1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶液来活化磁珠表面上的羧基基团来活化磁珠表面上的羧基基团，震荡以加速活化，得到活化后的磁珠溶液；
39.步骤二、将步骤一中活化后的磁珠溶液进行磁分离清洗：将ep管边缘放置一块磁铁，在磁场的作用下，纳米磁珠沉积在ep管的管壁上，用移液枪将溶液吸出，要注意不要碰到管壁，再加入缓冲溶液ii，重复上述的步骤三次；
40.步骤三：向步骤二处理过的磁珠溶液中加入适配体ⅳ溶液，将混合溶液在室温下轻微震荡进行孵育，重复磁分离清洗操作三次，除去未被结合到nmbs上的适配体i，最后将结合适配体的磁珠悬浮于200μl缓冲溶液i中。
41.所述的缓冲液ii为mes缓冲液，ph为5～6，浓度为25～100mm；步骤一中的纳米磁珠粒径为200～300nm，浓度为5mg/ml；步骤二中(1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)浓度为5～10mm；步骤三中：孵育的时间为4～6h；所述的适配体ⅳ的序列与适配体i～ⅲ是相关的：
42.当适配体ⅰ～ⅲ的序列为生物素或者氨基修饰的肌钙蛋白ⅰ适配体时，对应的适配体ⅳ的序列为5
’‑
nh2(ch2)6‑
cgcatgccaaacgttgcctcatagttccctccccgtgtcc
‑3’
；
43.当适配体ⅰ～ⅲ的序列为生物素或者氨基修饰的肌红蛋白适配体时，对应的适配体ⅳ的序列为5
’‑
nh2(ch2)6‑
ccctcctttccttcgacgtagatctgctgcgttgttccga
‑3’
。
44.所述步骤3)中，每次进样量为50μl；检测温度为25～37℃；设定浓度为0～500ng/ml，根据需要在该浓度之间进行选择，至少选择5个浓度；磁场强度为b＝
‑
0.3～0.3t。
45.本发明的原理：本发明采用谐振场调幅技术采用直接数字频率合成(dds)技术，按照预定频率和正弦波振幅对石英晶体振子进行扫描激励，扫描过程中逐渐增加激励电压，使得修饰后的晶片的振荡逐渐加剧，晶片表面的弱结合物质先一步被除去，当晶片的振荡到一定程度，即表面达到最大位移，产生足够的机械能促使晶片表面的特异性结合的物质
分离，从而实现生物传感器的高特异性。
46.本发明中磁场反生装置可以产生交变磁场用于提高灵敏度，其是通过在磁场反生装置产生交变磁场，磁场作用下修饰磁珠的适配体会移动到晶体表面从而结合晶体表面的受体，当磁场方向反向时，那些未成功结合的适配体会离开表面，空出的结合位点会等待下一轮的结合，增加了结合的概率，解决了缓慢移动的生物分子在与表面结合受体的反应过程中遭受运输限制的问题。
47.本发明的有益效果：
48.(1)本发明提出一种高频单面无极适配体压电石英晶体传感器用于检测心梗标志物，本方法使用单面无极石英晶片，以肌钙蛋白i或肌红蛋白适配体为探针，通过链霉亲和素
‑
生物素或硅烷化固定将该探针固定在晶片上捕获肌钙蛋白i或肌红蛋白，再以5端修饰氨基的肌钙蛋白i或肌红蛋白适配体耦联表面修饰羧基的磁珠，形成探针
‑
目标物
‑
磁珠复合结构。利用减薄晶体来提高石英晶体的基频的高频单面无极石英晶体微天平实现对检测物高灵敏的检测，再结合交变磁场下的磁珠富集技术进一步提高灵敏度。此外，利用谐振场调幅法区分非特异性结合和特异性结合，实现对肌钙蛋白i和肌红蛋白的高灵敏和高选择性的快速检测。
49.(2)本发明重点突破了检测蛋白质对实际样本进行复杂的前处理以及反复洗涤过程和放大过程对重现性产生干扰的弊端，并且所需的待测物体积很少，为实际应用中的样品中的肌钙蛋白i和肌红蛋白的检测提供了一种新颖、快速、高灵敏度和高特异性的分析检测手段，对于医学即时检测以及现场快速检测具有重要应用价值。
附图说明
50.图1本发明中检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统的示意图；
51.图2本发明检测的流程示意图；
52.图3本发明检测技术原理图；
53.图4实施例2～4中的标准曲线图；
54.图5实施例5～7中的标准曲线图；
55.其中1
‑
系统控制与数据采集装置、2
‑
dds信号发生器、3
‑
无极石英晶体启振耦合器，4
‑
自动进样装置、5
‑
相敏检波检测器、6
‑
温度控制装置、7
‑
高频单面无极适配体压电石英晶体传感器；71检测池，72修饰高频单面无极压电石英晶体，73磁场发生装置，74加热器。
具体实施方式
56.实施例1
57.本发明这种检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统的组成如图1所示，包括系统控制与数据采集装置1、dds信号发生器2、无极石英晶体启振耦合器3，相敏检波检测器5，温度控制装置6、自动进样装置4、以及高频单面无极适配体压电石英晶体传感器7；系统控制与数据采集装置1分别与温度控制装置6、自动进样装置4、dds信号发生器2、相敏检波检测器相连5；dds信号发生器2与无极石英晶体启振耦合器互联3；
58.高频单面无极适配体压电石英晶体传感器7包括有检测池71、固定在检测池内的加热装置74和固定在检测池内修饰高频单面无极压电石英晶体72，以及位于检测池外的磁
场发生装置73；检测池上开设有进样口和出样口，进样口与自动进样装置相连，加热装置74与温度控制装置6连接，修饰高频单面无极压电石英晶体72的激励线圈与无极石英晶体启振耦合器3相连，接收线圈与相敏检波检测器5相连；磁场发生装置73与系统控制与数据采集装置1相连；
59.检测过程中，系统控制与数据采集装置1使dds信号发生器2产生激励信号，激励信号通过无极石英晶体启振耦合器3作用于修饰高频单面无极压电石英晶体72，由于修饰高频单面无极压电石英晶体在检测时发生反生，导致信号反生改变，改变信号通过相敏检波检测器5检测到信号，输送至系统控制与数据采集装置1，即可获得该表的信号；
60.自动进样装置4控制进样量和进样时间，温度控制装置6控制检测时的温度，磁场发生装置73用于保证修饰高频单面无极压电石英晶体72与检测样品的反应过程。
61.本发明中检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统检测的测试流程图如图3所示，原理如图3所示，以肌钙蛋白i或肌红蛋白作为心梗标志物，首先使用单面无极石英晶片，以肌钙蛋白i或肌红蛋白适配体为探针，通过链霉亲和素和或生物素系统将该探针固定在晶片上捕获肌钙蛋白i或肌红蛋白，再以5端修饰氨基的肌钙蛋白i或肌红蛋白适配体来耦联带羧基的磁珠从而与肌钙蛋白i或肌红蛋白结合，在外加交变磁场的作用下待测物的结合概率大大增加(a)，通过双适配体夹心法形成探针
‑
目标物
‑
磁珠复合结构。通过增加一定范围内的电压使晶体表面振动加剧，在低电压(10v)下频率小幅度的增加(b)，除去一些非特异性吸附，在较高电压(20v)下(c)，出现频率大幅增加，则特异性键发生断裂，从而实现利用谐振场调幅方法区分非特异性结合和特异性结合，再结合高频技术，根据所得的频率信号变化能够实现对实际样本中肌钙蛋白i或肌红蛋白的高灵敏和高选择性的快速检测。具体的探针修饰和检测步骤如实施例2～7所示。
62.实施例2
63.一、修饰高频单面无极压电石英晶体
64.a
‑
1取高频单面无极压电石英晶体于无水乙醇中清洗后氮气吹干，放于紫外照射清洗机中照射8～12min，取出后再用无水乙醇和超纯水彻底冲洗电极，氮气吹干；得到处理后的晶片；
65.a
‑
2向经过步骤a
‑
1中处理过的晶片滴20μl 2mg/ml链霉亲和素溶液于4℃过夜孵育，得到链霉素修饰的晶片；
66.a
‑
3向经过步骤a
‑
2中链霉素修饰的晶片上滴加20μl 2μm适配体ⅰ，反应3h，得到适配体修饰后的晶片，其中：适配体ⅰ为生物素修饰的肌钙蛋白i适配体，具体序列为5
’‑
biotin
‑
cgtgcagtacgccaacctttctcatgcgctgcccctctta
‑3’
；
67.a
‑
4用缓冲溶液i冲洗步骤a
‑
3中适配体修饰后的晶片，接着滴加20μl封闭剂，并进行封闭反应1h，封闭完毕后，缓冲溶液i，双蒸水分别清洗，得到修饰探针的高频单面无极压电石英晶体，然后置于4℃下保存备用；其中：缓冲溶液i为pbs缓冲液，ph为7.4，浓度为10mm；封闭剂为0.1wt％的牛血清蛋白溶液。
68.二、适配体
‑
磁珠的制备
69.1)活化带羧基的磁珠：取带羧基的纳米磁珠原液(纳米磁珠粒径为200
‑
300nm，浓度为5mg/ml)于ep管中，加入缓冲液ii清洗(缓冲液ii为mes缓冲液，ph为5
‑
6，浓度为50mm)，再用配置的(1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺
(nhs)溶液(两者浓度均为3mm)来活化磁珠表面上的羧基基团，震荡以加速活化，得到活化后的磁珠溶液；
70.2)将步骤1)中活化后的磁珠溶液进行磁分离清洗：将ep管边缘放置一块磁铁，在磁场的作用下，纳米磁珠沉积在ep管的管壁上，用移液枪将溶液吸出，要注意不要碰到管壁，再加入缓冲溶液ii，重复上述的步骤三次；
71.3)：向步骤2)中处理过的磁珠溶液中加入20μl 2μm适配体ⅳ溶液(适配体ⅳ为5端修饰氨基的适配体，具体序列为5
’‑
nh2(ch2)6‑
cgcatgccaaacgttgcctcatagttccctccccgtgtcc
‑3’
)，将混合溶液在室温下轻微震荡进行孵育5h，重复磁分离清洗操作三次，除去未被结合到nmbs上的适配体ii，最后将结合适配体的磁珠悬浮于200μl缓冲溶液i中。
72.三、测试
73.将步骤一中修饰的高频单面无极压电石英晶体固定在检测池中，开启传感系统，调节dds信号发生器的电压为1v，设置检测温度为37℃，通过自动进样装置向检测池中注入缓冲液ⅰ，获得平稳的基线后，排出缓冲液；在接着通入50ul设定浓度的肌钙蛋白i溶液(浓度具体为0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0ng/ml)和步骤二的50ul适配体
‑
磁珠复合物，通过磁场发生器产生交变磁场(磁场强度为
‑
0.3～0.3t)增加反应结合概率，反应共30min，关掉交变磁场待频率稳定后，记录此时的频率f
0＝
99998325hz；通过dds信号发生器增加电压至10v，使晶体表面振动加剧，在低压区频率变化很小，除去非特异性物质，稳定后，记录此时的频率f1；通过dds信号发生器增加电压至20v，在较高压力下出现频率大幅度增加，则键发生断裂，稳定后，记录键断裂后的谐振频率f2。算频差δf＝f2‑
f1，获得对应的传感信号，改变心梗标志物的浓度，然后建立浓度与频差δf的标准曲线；具体可见图4中的a线；通过拟合，得到标准曲线的方程为：y＝168.26*x+1030r2＝0.989。
74.按照步骤上述标曲中的方法检测未知浓度的血清样品，得到频差δf为1131hz，然后根据标准曲线即可获得其肌钙蛋白i的浓度为0.60ng/ml。
75.实施例3
76.一、修饰高频单面无极压电石英晶体
77.b
‑
1将高频单面无极压电石英晶体于piranha酸处理15min，取出后再用无水乙醇和超纯水彻底冲洗电极，氮气吹干，得到处理过的晶片；其中：piranha酸为浓硫酸:30％h2o2＝3:1；
78.b
‑
2向经过步骤b
‑
1处理过的晶片滴加20μl的3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)溶液中固定1h；得到aptes修饰的晶片；其中：3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷溶液的浓度为5wt％，溶剂为无水甲苯；
79.b
‑
3用缓冲溶液i冲洗步骤b
‑
2中aptes修饰的晶片，接着在晶片上滴加20μl戊二醇溶液进行反应1h；得到戊二醛处理的晶片；其中戊二醛溶液浓度为5wt％；
80.b
‑
4用缓冲溶液i冲洗步骤三戊二醛处理的晶片，接着在晶片滴20μl2μm适配体ⅱ溶液，反应3h，得到适配体修饰后的晶片，其中：适配体ⅱ溶液的浓度为2μm，适配体ⅱ为氨基修饰的肌钙蛋白ⅰ的适配体，具体的序列为：5
’‑
nh2(ch2)6‑
cgtgcagtacgccaacctttctcatgcgctgcccctctta
‑3’
；
81.b
‑
5用缓冲溶液i冲洗b
‑
4中适配体修饰后的晶片，再接着滴加20μl封闭剂，并进行封闭反应1h，封闭完毕后，缓冲溶液i，双蒸水分别清洗，得到修饰探针的高频单面无极压电
石英晶体，然后置于4℃下保存备用；其中：缓冲溶液i为pbs缓冲液，ph为7.4，浓度为10mm；封闭剂为0.1wt％的牛血清蛋白溶液。
82.二、适配体
‑
磁珠的制备
83.同实施例2
84.三.测试
85.测试方法同实施例2，获得的标准曲线为如图4中的b线，通过拟合，得到标准曲线的方程为：y＝188.69*x+1086.3r2＝0.983。
86.按照步骤上述标曲中的方法检测未知浓度的血清样品，得到频差δf为1199hz，然后根据标准曲线即可获得其肌钙蛋白的浓度为0.60ng/ml。
87.实施例4
88.一、修饰高频单面无极压电石英晶体
89.c
‑
1将高频单面无极压电石英晶体浸入2wt％3
‑
氨基丙基甲基二乙氧基硅烷(3
‑
apdes)溶液中，在惰性环境下浸泡3h，得到3
‑
氨基丙基甲基二乙氧基硅烷处理的晶片；其中：3
‑
apdes的溶剂为无水乙醇；
90.c
‑
2将步骤c
‑
1中3
‑
氨基丙基甲基二乙氧基硅烷处理的晶片按照乙醇，乙醇/丙酮(1：1(v/v))和丙酮的顺序依次浸出到上述溶剂中，每组溶剂中都进行超声处理1min；接着在晶片上滴加20μl的100mm琥珀酸酐溶液，然后用去离子水冲洗并干燥，得到琥珀酸酐修饰的晶片；
91.c
‑
3将步骤c
‑
2中琥珀酸酐修饰的晶片加入20μl含3mg/ml的(1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺进行活化，得到活化后的晶片；
92.c
‑
4用缓冲溶液i冲洗步骤c
‑
3的活化后的晶片，接着向晶片滴20μl 2μm适配体ⅲ溶液，反应3h，得到适配体修饰的晶片，其中：缓冲溶液i为pbs缓冲液，ph为7.4，浓度为10mm；适配体ⅲ为氨基修饰的肌钙蛋白ⅰ的适配体，具体的序列为：5
’‑
nh2(ch2)6‑
cgtgcagtacgccaacctttctcatgcgctgcccctctta
‑3’
；
93.c
‑
5用缓冲溶液i冲洗步骤c
‑
4的适配体修饰的晶片，再滴加20μlbsa进行封闭，并进行封闭反应1h，得到封闭后的晶片，其中：bsa浓度为0.1wt％；
94.c
‑
6用缓冲溶液i，双蒸水分别清洗步骤c
‑
5封闭后的晶片，并用氮气吹干，得到修饰探针的高频单面无极压电石英晶体，然后置于4℃下保存备用。
95.二、适配体
‑
磁珠的制备
96.同实施例2
97.三.测试
98.测试方法同实施例2，获得的标准曲线为；获得的标准曲线为如图4中的c线，通过拟合，得到标准曲线的方程为：y＝157.02*x+1037.1，r2＝0.990。
99.按照步骤上述标曲中的方法检测未知浓度的血清样品，得到频差δf为1130hz，然后根据标准曲线即可获得其肌钙蛋白的浓度为0.59ng/ml。
100.实施例2～4测试的是同一的血清样品，三者从获得的浓度差异很小，说明本发明的方法可以用于血液中肌钙蛋白的检测。
101.实施例5
102.一、修饰高频单面无极压电石英晶体
103.本实施例中修饰高频单面无极压电石英晶体与实施例2的方法是相同的，区别点在于，适配体ⅰ为生物素修饰肌红蛋白的适配体，具体序列为5
’‑
biotin
‑
atccagagtgacgcagcacaacgtgcaaattatacctgttttccccttttcctacaagtgctatggacacggtggcttagt
‑3’
。
104.二、适配体
‑
磁珠的制备
105.本实施例中适配体
‑
磁珠同实施例2中的方法是相同的，区别点在于，适配体ⅳ的序列为：5
’‑
nh2(ch2)6‑
ccctcctttccttcgacgtagatctgctgcgttgttccga
‑3’
。
106.三、检测
107.本实施例的检测方法同实施例2，区别点在于，制备标曲的肌红蛋白溶液的浓度为0、25、75、100、200、300、400和500ng/ml。得的标准曲线为如图5中的a线，通过拟合，得到标准曲线的方程为：y＝14.157*x+1925.4，r2＝0.991。
108.按照步骤上述标曲中的方法检测未知浓度的血清样品，得到频差δf为4050hz，然后根据标准曲线即可获得其肌红蛋白的浓度为150.6ng/ml。
109.实施例6
110.一、修饰高频单面无极压电石英晶体
111.本实施例中修饰高频单面无极压电石英晶体与实施例3的方法是相同的，区别点在于，适配体ⅱ为氨基修饰的肌红蛋白适配体，具体序列为5
’‑
nh2(ch2)6‑
atccagagtgacgcagcacaacgtgcaaattatacctgttttccccttttcctacaagtgctatggacacggtggcttagt
‑3’
。
112.二、适配体
‑
磁珠的制备
113.同实施例5。
114.三、检测
115.本实施例的检测方法同实施例2，区别点在于，制备标曲的肌红蛋白溶液的浓度为0、25、75、100、200、300、400和500ng/ml。得的标准曲线为如图5中的b线，通过拟合，得到标准曲线的方程为：y＝13.073*x+1516.2r2＝0.993。
116.按照步骤上述标曲中的方法检测未知浓度的血清样品，得到频差δf为3470hz，然后根据标准曲线即可获得其肌红蛋白的浓度为149.5ng/ml。
117.实施例7
118.一、修饰高频单面无极压电石英晶体
119.本实施例中修饰高频单面无极压电石英晶体与实施例4的方法是相同的，区别点在于，适配体ⅲ为氨基修饰的肌红蛋白适配体，具体序列为5
’‑
nh2(ch2)6‑
atccagagtgacgcagcacaacgtgcaaattatacctgttttccccttttcctacaagtgctatggacacggtggcttagt
‑3’
。
120.二、适配体
‑
磁珠的制备
121.同实施例5。
122.三、检测
123.本实施例的检测方法同实施例2，区别点在于，制备标曲的肌红蛋白溶液的浓度为0、25、75、100、200、300、400和500ng/ml。得的标准曲线为如图5中的c线，通过拟合，得到标准曲线的方程为：y＝10.453
×
x+1941.1，r2＝0.991
124.按照步骤上述标曲中的方法检测未知浓度的血清样品，得到频差δf为3512hz，然后根据标准曲线即可获得其肌红蛋白的浓度为150.3ng/ml。
125.实施例5～7测试的是同一的血清样品，三者从获得的浓度差异很小，进一步采用
液相色谱法测试上述未知浓度的血清样品，得到肌红蛋白的浓度为150.1ng/ml，说明本发明的数据是准确的，因而本发明的方法可以用于血液中肌红蛋白的检测。