一种动物性食品中残留杀菌剂的检测方法与流程

1.本发明属于检测技术领域，具体涉及一种动物性食品中残留杀菌剂的检测方法。


背景技术：

2.动物源性食品是人民日常生活消费的重要组成部分，主要包括各种可食用的动物组织及蛋和生乳等。而随着人民生活水平的提高，动物源性食品在人们生活水平中的比重日益增大，动物源性食品安全问题成为全球会关注的焦点，其中生乳的质量直接影响乳制品安全。
3.随着科技的发展，规模化管理养殖、质量控制、技术装备等方面均能达到质量安全的要求，真正影响动物源性安全的因素多来自生产养殖环节，一方面如故意在养殖过程中加入一些本不应加入的物质甚至是有害物质，如一些违禁使用兽药等。另一方面，养殖区环境是否存在污染等因素，饲料是否已受到农药残留污染，都决定着动物源性的质量与安全。
4.杀菌剂是一般指用于防治由各种病原微生物引起的植物病害的农药，主要施用作物果树和经济作物。病害的抗性发展要求不断开发新的作用位点的杀菌剂，杀菌剂已成为近年来农药研发的热点之一，随着越来越多品种的开发及使用，其残留物可随着谷物及饲料的消耗转移至动物组织中，继而可能存在于生乳、动物肌肉等动物源产品中，最终可通过食物链对人类健康产生危害。为此，非常有必要针对动物源性食品中杀菌剂残留检测方法进行深入研究，对其残留量进行监测，以确保消费者身体健康。
5.gb 2763
‑
2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》，2020年2月15日已正式实施。规定了356种(类)食品中483种农药共有杀菌剂有140项，其中涉及动物源性食品的有28项，16项没有相应检测标准，其余部分为参照标准包含基质范围少，动物肌肉中农药包含范围少；或参照水果和蔬菜、蜂蜜的检测标准，不太适用。gb/t 20772
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2008动物肌肉中461种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱
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串联质谱法、gb/t 19650
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2006动物肌肉中478种农药及相关化学品残留量的测定气相色谱
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质谱法、gb/t 20771
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2008蜂蜜中486种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱
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串联质谱法、gb 23200.8
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2016食品安全国家标准水果和蔬菜中500种农药及相关化学品残留量的测定气相色谱
‑
质谱法、gb/t 20769
‑
2008水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱
‑
串联质谱法。
6.上述标准只有4项检测方法基质适用于生乳和动物肌肉检测，其余大都参照水果蔬菜、蜂蜜等农产品的检测，主要使用气相质谱、液相色谱质谱联用，前处理通过使用乙腈提取，弗罗里硅藻土或者氨基spe柱固相萃取净化，反复氮吹浓缩等方法，并没有一个方法针对性用来检测杀菌剂这一类农药残留。现行有效的标准检测方法中《gb/t 22979
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2008牛奶和奶粉中啶酰菌胺残留量的测定气相色谱
‑
质谱法》检测项目过于单一局限，而《gb/t 23210
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2008牛奶和奶粉中511种农药及相关化学品残留量的测定气相色谱
‑
质谱法》和《gb/t 23211
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2008牛奶和奶粉中493种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱
‑
串联质谱法》也主要涉及常规农药残留检测，对于杀菌剂的检测也极少涉及。


技术实现要素：

7.针对上述现有技术的缺点，本发明提供一种动物性食品中残留杀菌剂的检测方法。本发明所述检测方法可同时检测对动物性食品中21中杀菌剂的残留量，且所述检测方法的检测结果精密度、稳定性和重现性高。
8.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种动物性食品中残留杀菌剂的检测方法，包括如下步骤：
9.s1：将动物性食品、分散剂和氯化钠混合震荡后，离心取上清液a；
10.s2：离心后的沉淀用分散剂重复震荡离心，取上清液与上清液a混合，得到溶液a；
11.s3：将溶液a经过固相萃取柱处理，得到待测液；
12.s4：制备目标杀菌剂的标准溶液，使用液相色谱
‑
质谱联用仪检测目标杀菌剂的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以标准溶液的质量浓度为横坐标，相应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到目标杀菌剂的线性方程；
13.s5：结合标准曲线，将s3的待测样中的目标杀菌剂使用液相色谱
‑
质谱联用仪进行定性定量的测定。
14.本发明通过将动物性食品、分散剂和氯化钠溶剂提取过程与固相萃取净化相结合对动物性食品进行净化前处理，采用液相质谱联用仪同时检测动物性食品21中杀菌剂的残留量。本发明所述目标杀菌剂的浓度在0.5～20μg/l范围线性良好，方法检出限在0.7μg/kg，方法定量限2.0μg/kg，相关系数均大于0.995，平均回收率为70.0％～119.7％，相对偏差小于10.0％。
15.作为本发明的优选实施方式，所述分散剂为乙腈、含0.2％vol甲酸和80％vol乙腈的水溶液、含0.1％
‑
1％vol甲酸的乙腈溶液中的一种。
16.本发明经过大量实验探究上述5中分散剂能够提高动物性食品中杀菌剂的回收率。
17.作为本发明的优选实施方式，所述分散剂为含0.2％vol甲酸的乙腈溶液。
18.本发明经过大量实验探究，分散剂为含0.2％vol甲酸的乙腈溶液时，对动物性食品中杀菌剂提取的回收率最高。
19.作为本发明的优选实施方式，所述s1中动物性食品、氯化钠与分散剂的配比为1g
‑
5g：1g
‑
10g：2ml
‑
20ml；所述s1中的分散剂与s2中分散剂的添加量相同。
20.作为本发明的优选实施方式，所述目标杀菌剂为吡唑醚菌酯、醚菌酯、嘧菌酯、苯醚甲环唑、丙环唑、氟硅唑、三唑醇、三唑酮、丙硫菌唑、苯并烯氟菌唑、吡噻菌胺、吡唑萘菌胺、氟吡菌胺、咪鲜胺、嘧菌环胺、嘧霉胺、嗪氨灵、苯菌酮、嘧霉胺
‑5‑
羟基、脱硫丙硫菌唑、苯醚甲环唑醇。
21.采取本发明所述检测方法可以同时对动物性食品中21种以下杀菌剂进行定性和定量检测。
22.采取本发明所述检测方法可以同时对动物性食品中21种杀菌剂进行定性和定量检测。
23.作为本发明的优选实施方式，所述动物性食品为生牛乳、牛肉、奶粉、纯牛奶等动物性食品。
24.更优选地，所述动物性食品为生牛乳、牛肉、奶粉或纯牛奶。
25.作为本发明的优选实施方式，所述s1中，动物性食品为奶粉时，将奶粉加入水中浸泡后再与分散剂和氯化钠混合震荡；动物性食品为牛肉时，将牛肉匀浆后再与分散剂和氯化钠混合震荡。
26.将奶粉用水浸泡溶解后再与分散剂和氯化钠混合震荡提取，可以避免奶粉直接与分散剂和氯化钠混合出现结块现象，而且将奶粉用水浸泡溶解后再与分散剂和氯化钠混合震荡提取，可以将动物性食品中杀菌剂提取的回收率提高20％。
27.作为本发明的优选实施方式，所述目标杀菌剂的标准溶液的制备方法，具体为：(1)将目标杀菌剂用乙腈溶解配置成质量浓度为100mg/l的储备液；(2)将储备液使用乙腈稀释为质量浓度为10mg/l的混合标准储备液；(3)使用空白基质溶液将混合标准储备液稀释成目标杀菌剂的质量浓度分别为0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml的目标杀菌剂的标准溶液；所述空白基质溶液为不含有杀菌剂的动物性食品经过步骤s1
‑
s3处理后的待测液。
28.作为本发明的优选实施方式，所述液相色谱
‑
质谱联用仪的检测条件为：
29.柱温：40℃；样品室温度：4℃；进样体积：10μl；流速：0.3ml/min；
30.流动相采用流动相a为含0.1％vol甲酸和2mmol/l乙酸铵的水溶液，流动相b为乙腈进行梯度洗脱；
31.所述梯度为：0min，95％流动相a，5％流动相b；2min，95％流动相a，5％流动相b；4min，0％流动相a，100％流动相b；7min，0％流动相a，100％流动相b；7.1min，95％流动相a，5％流动相b；8min，95％流动相a，5％流动相b；
32.电喷雾正离子模式(esi+)，电喷雾电压2.8kv，多反应监测模式(mrm)采集，离子源温度为150℃，脱溶剂温度为500℃，脱溶剂气流量为800l/h，锥孔气流量50l/h。
33.作为本发明所述动物性食品中残留杀菌剂的检测方法的优选实施方式，所述目标杀菌剂使用液相色谱
‑
质谱联用仪进行定性测定，主要有以下步骤组成：
34.s3的待测样中经液相色谱
‑
质谱联用仪测定的色谱峰的保留时间与相应的标准溶液色谱峰的保留时间误差在
±
2.5％内，且在扣除背景后的待测样质谱图中，出现目标杀菌剂的离子对，即判定待测样中存在目标杀菌剂。
35.作为本发明所述动物性食品中残留杀菌剂的检测方法的优选实施方式，所述目标杀菌剂使用液相色谱
‑
质谱联用仪进行定量测定，主要有以下步骤组成：
36.根据s3的待测样使用液相色谱
‑
质谱联用仪测定的相应的色谱峰面积，代入s4中的各目标杀菌剂的线性方程中，得到各目标杀菌剂的含量。
37.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过将动物性食品、分散剂和氯化钠混合的溶剂提取过程与固相萃取净化相结合对动物性食品进行净化前处理，采用液相质谱联用仪同时检测动物性食品21中杀菌剂的残留量。本发明所述目标杀菌剂的浓度在0.5～20μg/l范围线性良好，方法检出限在0.7μg/kg，方法定量限2.0μg/kg，相关系数均大于0.995，平均回收率在70.0％～119.7％之间，相对偏差小于10.0％，且所述检测方法得到的检测结果精密度、稳定性和重复性好。因此，本发明限定的检测方法，可以为gb 2763
‑
2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中涉及动物源性食品中杀菌剂，提供相应配套检测方法。为食品安全国家标准提供新的技术支持和数据支撑，可为国家标准提供相应的配套检测标准，进一步保护消费者的利益。
附图说明
38.图1为本发明所述动物性食品中残留杀菌剂的检测方法的流程示意图；
39.图2为实施例2所述分散剂测定生牛乳中7种杀菌剂的回收率；
40.图3为实施例2所述分散剂测定奶粉中7种杀菌剂的回收率；
41.图4为实施例2所述分散剂测定牛肉中7种杀菌剂的回收率。
具体实施方式
42.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
43.本发明实施例1
‑
3所述液相色谱
‑
质谱联用仪的检测条件为：
44.柱温：40℃；样品室温度：4℃；进样体积：10μl；流速：0.3ml/min；
45.流动相采用流动相a为含0.1vol％甲酸和2mmol/l乙酸铵的水溶液，流动相b为乙腈梯度洗脱；
46.所述梯度为：0min，95％流动相a，5％流动相b；2min，95％流动相a，5％流动相b；4min，0％流动相a，100％流动相b；7min，0％流动相a，100％流动相b；7.1min，95％流动相a，5％流动相b；8min，95％流动相a，5％流动相b；
47.电喷雾正离子模式(esi+)，电喷雾电压2.8kv，多反应监测模式(mrm)采集，离子源温度为150℃，脱溶剂温度为500℃，脱溶剂气流量为800l/h，锥孔气流量50l/h。
48.图1为本发明所述动物性食品中残留杀菌剂的检测方法的流程示意图，实施例1和实施例3按照图1的流程示意图对动物性食品中残留杀菌剂进行检测和加标回收。
49.实施例1
50.本发明所述动物性食品中残留杀菌剂的检测方法的实施例，具体如下：
51.s1：取3份含5g生牛乳基质的容器，向5g生牛乳基质中分别添加含21种杀菌剂的标准溶液，使21种杀菌剂含量均为浓度为10μg/kg，20μg/kg，40μg/kg，然后再向三个容器中均添加10ml 0.2％甲酸乙腈溶液和5g氯化钠涡旋振荡提取，离心分层取上清液a1、a2和a3，离心后的沉淀用10ml 0.2％甲酸乙腈溶液重复震荡离心，取上清液分别于与上清液a1、a2和a3混合，得到溶液a1、溶液a2和溶液a3；
52.将牛肉匀浆，向3个容器中均放置5g匀浆后的牛肉，然后分别添加含21种杀菌剂的标准溶液，使21种杀菌剂含量均为浓度为10μg/kg，20μg/kg，40μg/kg，然后再向三个容器中均添加10ml 0.2％甲酸乙腈溶液、5g氯化钠涡旋振荡提取，离心分层取上清液b1、b2和b3，离心后的沉淀用10ml 0.2％甲酸乙腈溶液重复震荡离心，取上清液分别与上清液b1、b2和b3混合，得到溶液b1、溶液b2和溶液b3；
53.取3份5g奶粉加5ml水混匀浸泡30min，分别添加含21种杀菌剂的标准溶液，使21种杀菌剂含量均为浓度为10μg/kg，20μg/kg，40μg/kg，然后均加入10ml 0.2％甲酸乙腈溶液和5g氯化钠涡旋振荡提取，离心分层取上清液c1、c2和c3，离心后的沉淀用10ml 0.2％甲酸乙腈溶液重复震荡离心，取上清液分别与上清液c1、c2和c3混合，得到溶液c1、溶液c2和溶液c3；
54.s2：将溶液a1、溶液a2、溶液a3、溶液b1、溶液b2、溶液b3、溶液c1、溶液c2和溶液c3分别经过固相萃取柱处理，接受全部流出液，经过0.22μm滤膜过滤，分别得到待测液a1、待
测液a2、待测液a3；待测液b1、待测液b2、待测液b3；待测液c1、待测液c2、待测液c3；
55.s3：将21种目标杀菌剂分别用乙腈溶解配置成质量浓度为100mg/l的储备液；再将储备液用乙腈配置成质量浓度为10mg/l的混合标准储备液；使用空白基质溶液将储备液稀释成目标杀菌剂的质量浓度为0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml的目标杀菌剂的标准溶液；所述空白基质溶液为xx；使用液相色谱
‑
质谱联用仪检测上述目标杀菌剂的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以标准溶液的质量浓度为横坐标，相应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到各目标杀菌剂的线性方程；
56.s4：结合标准曲线，使用液相色谱
‑
质谱联用仪对s2得到的9个待测液进行定性定量的测定。
57.21种杀菌剂的种类及质谱检测参数如表1中所示；待测液中21种杀菌剂的添加回收率及精密度如表2结果所示，表2中的各回收率及精密度结果均为6次平行实验的测试结果。
58.表1 21种杀菌剂的质谱检测参数
[0059][0060][0061]
注：*定量离子对。
[0062]
表2生牛乳、奶粉及牛肉中21种杀菌剂的添加回收率及精密度
[0063]
[0064]
[0065][0066]
从表2中可以看出，本发明所述动物性食品中残留杀菌剂的检测方法对动物性食品的21中杀菌剂的加标回收率达到70
‑
119.7％，而且rsd<10％。
[0067]
在最低添加回收水平下，本发明以3倍和10倍信噪比结合浓度外推法确定方法检出限(lod)和定量限(loq)。以满足方法学要求的最低添加浓度作为定量限，21种杀菌剂的定量限均为2.0μg/kg，检出限均为0.7μg/kg。
[0068]
实施例2
[0069]
本发明所述动物性食品中残留杀菌剂的检测方法的实施例，具体如下：
[0070]
s1：将7种目标杀菌剂分别用乙腈溶解配置成质量浓度为100mg/l的储备液；再将储备液用乙腈配置成质量浓度为10mg/l的混合标准储备液；使用空白基质溶液将储备液稀释成目标杀菌剂的质量浓度为0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml的目标杀菌剂的标准溶液；所述空白基质溶液为xx；使用液相色谱
‑
质谱联用仪检测上述目标杀菌剂的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以标准溶液的质量浓度为横坐标，相应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到各目标杀菌剂的线性方程；
[0071]
s4：通过加标回收法，在空白基质中分别加入含7种杀菌剂的标准溶液，使7种杀菌剂的浓度均为20μg/kg，静置24h后分别加入20ml的分散剂，经过0.22μm滤膜过滤，结合标准曲线，使用液相色谱
‑
质谱联用仪对上述液体进行定性定量的测定；所述空白基质为5g生牛乳、5g匀浆后的牛肉或5g奶粉加5ml水混匀浸泡30min。
[0072]
所述7种杀菌剂为嘧菌酯、丙硫菌唑、吡唑萘菌胺、咪鲜胺、嘧菌环胺、嗪氨灵和苯菌酮。
[0073]
所述分散剂为乙腈、含0.2％vol甲酸和80％vol乙腈的水溶液、含0.2％vol甲酸的乙腈溶液、含0.1％vol乙酸的乙腈溶液或1％vol甲酸的乙腈溶液。
[0074]
表3分散剂对动物性食品中杀菌剂的回收率
[0075][0076]
图2
‑
4中80％乙腈(含0.2％甲酸)为含0.2％vol甲酸和80％vol乙腈的水溶液；1％甲酸乙腈为含1％vol甲酸的乙腈溶液；0.1％甲酸乙腈为含0.1％vol乙酸的乙腈溶液；0.2％甲酸乙腈为含0.2％vol甲酸的乙腈溶液。
[0077]
从表3以及图2
‑
4中可以看出，本发明所述的5种分散剂对动物性食品中杀菌剂的回收率为41.6％
‑
130.2％，而且含0.2％vol甲酸的乙腈溶液提取的回收率最高。
[0078]
实施例3
[0079]
本发明所述动物性食品中残留杀菌剂的检测方法的重复性。
[0080]
s1：向生牛乳基质中加入含21种杀菌剂的标准溶液，使21种杀菌剂含量均为20μg/kg，然后加入10ml 0.2％甲酸乙腈溶液和5g氯化钠涡旋振荡提取，离心分层取上清液a，离心后的沉淀用10ml 0.2％甲酸乙腈溶液重复震荡离心，取上清液与上清液a混合，得到溶液a；
[0081]
s2：将溶液a、经过固相萃取柱处理，接受全部流出液，经过0.22μm滤膜过滤，分别得到待测液a；
[0082]
s3：将21种目标杀菌剂分别用乙腈溶解配置成质量浓度为100mg/l的储备液；再将储备液用乙腈配置成质量浓度为10mg/l的混合标准储备液；使用空白基质溶液将储备液稀释成目标杀菌剂的质量浓度为0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml的目标杀菌剂的标准溶液；所述空白基质溶液为xx；使用液相色谱
‑
质谱联用仪检测上述目标杀菌剂的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以标准溶液的质量浓度为横坐标，相应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到各目标杀菌剂的线性方程；
[0083]
s4：结合标准曲线，使用液相色谱
‑
质谱联用仪对s2得到的待测液a进行定性定量的测定。
[0084]
所述21种杀菌剂的种类如表4中所示。
[0085]
本实施例分别称取5.1g、5.2g、5.3g、5.4g的同批次同产品的生牛乳按照实施例3的测试方法进行21种杀菌剂定性定量分析，分别计为1号、2号、3号和4号；测试结果如表4所示，表4中的各回收率结果均为6次平行实验的回收率结果。
[0086]
表4本发明所述生牛乳中杀菌剂回收率的重复性结果
[0087][0088][0089]
从表4结果可以看出，本发明所述生牛乳中杀菌剂回收率的重复性较好。
[0090]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。