使用透射带电粒子显微镜对样本进行成像的方法与流程

使用透射带电粒子显微镜对样本进行成像的方法
1.说明书本发明涉及使用透射带电粒子显微镜对样本进行成像的方法，所述方法包括提供样本和提供带电粒子束，以及将所述带电粒子束引导到所述样本上，用于生成一定通量的透射穿过样本的带电粒子。
2.带电粒子显微法，特别是呈电子显微法的形式是众所周知且日益重要的微观物体成像技术。从历史上看，电子显微镜的基本种类已演变成数个众所周知的设备类型，例如透射电子显微镜（tem）、扫描电子显微镜（sem）和扫描透射电子显微镜（stem），且还演变成各种子类型，例如所谓的“双束”设备（例如，fib
‑
sem），其另外采用聚焦离子束（fib），从而允许支持例如离子束铣削或离子束诱导沉积（ibid）的活动。技术人员将熟悉不同类型的带电粒子显微法。
3.在tem中，用于照射样本的电子束被选择为具有足够高的能量以穿透样本（为此目的，样本通常将比在sem样本的情况中更薄）；然后，可使用从样本中发出的透射电子的通量来创建图像。当这类tem以扫描模式操作（因此变成stem）时，所讨论的图像将在电子束和样本的相对扫描运动期间累积。
4.透射电子显微法（tem）中存在几种用例，其中电子束在样本上方移动或扫描。
5.一个实例是单粒子分析（spa）。在此工作流程中，样本含有带有许多圆形孔的网格，每个圆形孔都含有一块冰箔，上面有要成像的生物颗粒的拷贝。每个冰箔的直径约为2 μm，并且这些箔的间距约为5 μm。载物台移动到孔的中心，使用2到6个不同的大约0.5 μm的束
‑
图像偏移来获取2到6张图像，每张图像覆盖大约0.5x0.5 μm2的面积。在这种情况下，束
‑
图像偏移意指样本上方的照射束和样本下方的图像束的组合偏转，使得在两次偏转之后，束在样本下游的成像系统中在同轴上，并且使得不在同轴上一部分样本成像。然后，工作台移动到下一个孔（通常相距5 μm），并重复该程序。该过程可以重复数百次甚至数千次，从而生成多个图像。
6.在单粒子分析（spa）中，从该多个图像重构如蛋白质或病毒的生物颗粒的3d结构，其中每个单个图像可含有该相同生物颗粒的数十个拷贝。该过程中的步骤之一涉及识别并定位多个图像中的颗粒。这些颗粒的对比度（非常）低，因为该颗粒和它们嵌入其中的冰都由轻元素（n、c、o、h）组成。这使得难以识别和鉴定图像中的颗粒。
7.增强对比度的传统方法是散焦（ctf理论教导这会增加低空间频率的传递）或应用相位板。第一种方法的缺点是，它减少了高分辨率下的信息。后者的缺点是，实际上，所有可用的相位板都会在一定程度上阻挡束强度的一部分。
8.因此，本发明的目的是提供用于增加在透射带电粒子显微镜中获得的图像的对比度的方法。
9.为此目的，本发明提供根据权利要求1所定义的使用透射带电粒子显微镜对样本进行成像的方法。
10.如本文所定义的方法的特征在于，其包括以下步骤：生成并记录第一能量过滤通量的透射穿过样本的带电粒子，其中所述带电粒子的第一能量过滤通量基本上由未散射和
弹性散射的带电粒子组成。带电粒子的第一能量过滤通量增强了样本中不同区域的对比度，例如颗粒和与它们嵌入其中的冰之间的对比度。
11.如本文所定义的方法的特征进一步在于，其包括以下步骤：生成并记录第二能量过滤通量的透射穿过样本的带电粒子，其中所述带电粒子的第二能量过滤通量基本上由非弹性散射的带电粒子组成。由于不同区域之间在非弹性散射的带电粒子与未散射或弹性散射的带电粒子的比率方面的差异很小但明显，所以带电粒子的第二能量过滤通量含有关于样本中不同区域的信息，例如颗粒和它们嵌入其中的冰的信息，并且这可用于进一步提高用该方法获得的图像的对比度。
12.该方法结合了来自所述第一和第二记录的能量过滤通量的信息，用于以增加的对比度对所述样本进行成像。由此，实现了本发明的目的。
13.将在下文描述另外实施例和优点。
14.本文所定义的方法基于这样的见解：在样本中的不同区域之间，非弹性散射的带电粒子与没有散射或弹性散射的带电粒子的比率存在很小但明显的差异。例如，spa样本中的冰和颗粒之间就是这种情况。这里，非弹性散射意指束中的带电粒子，当在样本上散射时，不仅由于动量传递而将其部分动能传递给样本（在带电粒子为电子的情况下，其不足道地小，因为样本中的电子和原子之间存在巨大的质量差异），而且由于样本中的电子或原子的内部激发而传递能量。这类内部激发可以包括（按减少的能量传递顺序）所谓的芯损失（这在样品中原子的核壳中的束缚电子被激发到外壳或真空中时发生），或等离激元激发（这是价电子的集体激发），或带隙跃迁（当价带的电子被激发到导电带时）或声子激发（这是样本中原子的集体振动）。与这些过程相关联的典型能量传递是：芯为100 ev
……
2000 ev，等离激元激发为10 ev
……
40 ev，带隙跃迁为2 ev
……
6 ev，以及声子激发为0.01 ev
……
0.2 ev。
15.与此相反，弹性散射意指束中的带电粒子，当在样本上散射时，不会引起样本中的电子或原子的任何内部激发。可注意到，对于通常用于透射电子显微镜的薄样本（10 nm
……
30 nm），照射束中的大多数电子不会随样本而散射或弹性散射。只有一小部分（通常为5%
……
20%）的电子发生非弹性散射，而这些非弹性散射事件中的大多数是等离激元激发。
16.通常，未散射的带电粒子和弹性散射的带电粒子的组合通量被称为弹性信号或弹性通量或弹性图像。
17.此外，该方法采用光谱设备来分析带电粒子在与样本相互作用时传递或损失的能量，并且具体地说，来仅使用经历了特定能量损失的带电粒子来创建样本的图像。在电子显微法的背景下，这类设备通常被称为在电子能量损失光谱分析（eels）模块。
18.第一能量过滤通量可以是所谓的零损失峰（zlp）过滤图像，其中，在样本中引发一些能量损失的所有电子都从图像中滤除。现有技术的理解是，由于能量不同，这些已经引发能量损失的电子（非弹性散射电子）在图像中失焦，并且该失焦信号在图像中给出了模糊的背景，这种模糊的背景降低了信噪比并因此降低了冰中颗粒的可见度。根据这种现有技术的理解，zlp过滤将提高其中发生显著非弹性散射（比方说>50%）的厚样本（例如，>100 nm）的对比度，但对于其中仅发生少量非弹性散射（比方说<20%）的薄样本（例如，<30 nm）并不如此。然而，发明人发现，即使对于非常薄的样本（<30 nm），zlp过滤也可以改善对比度。正
如稍后将要展现的，通过zlp过滤获得的spa对比度的提高并非来自去除模糊背景，而是来自颗粒与颗粒嵌入其中的周围冰之间的非弹性散射的显著差异。
19.第二能量过滤通量可以是所谓的零损失峰（zlp）阻挡的图像。发明人发现，zlp阻挡的图像确实携带一些有力的信息。例如，在spa中，颗粒位置处的非弹性信号较高。信号的这种增加可以用于增强图像的对比度。逻辑上，非弹性信号强度的这种增加伴随着弹性信号强度的对应降低。这种降低的强度（以及高频信息）使得颗粒在zlp过滤图像中可识别。
20.在实施例中，在生成并记录所述带电粒子的第一能量过滤通量的步骤期间，使用第一剂量。
21.所述第一剂量可以等于样本在失去结构完整性之前可以承受的最大剂量，例如40个电子/
å2。
22.在实施例中，在生成并记录所述带电粒子的第二能量过滤通量的步骤期间，使用第二剂量。第二剂量可以与第一剂量不同，但是在实施例中也可以相等。
23.在实施例中，首先执行生成并记录带电粒子的第一能量过滤通量的所述步骤，并且稍后执行生成并记录带电粒子的第二能量过滤通量的所述步骤。
24.这里，可设想的是，第二剂量至少等于所述第一剂量，例如，至少40 e/
å2。
25.所述记录的带电粒子的第二能量过滤通量可用于在样本内定位所关注的区域。倘若样本含有多个样品颗粒，则所关注的区域可以是样品颗粒。例如，样品颗粒可以嵌入冰中。
26.在实施例中，该方法可以包括从所述记录的带电粒子的第一能量过滤通量中减去记录的带电粒子的第二能量过滤通量的步骤。这可以包括以下步骤：形成第一和/或带电粒子的第二能量过滤通量的图像，和减去该图像。也可设想其它减去方式。
27.在减去期间，可以在所述记录的带电粒子的第二能量过滤通量上使用比例因子。
28.如前所述，样本可以包括多个样品颗粒。在实施例中，该方法包括形成样品颗粒的三维（3d）重构的步骤，其中使用所述带电粒子的第一和第二能量过滤通量。
29.根据一方面，提供了如权利要求13所定义的光谱设备。如本文所定义的光谱设备包括：色散装置，用于接收一定通量的带电粒子并且根据其能量损失来色散所述通量的带电粒子；以及检测系统，用于检测色散通量的带电粒子的至少一部分。
30.如本文所定义，光谱设备被布置成用于：
‑ꢀ
生成并记录带电粒子的第一能量过滤通量，该带电粒子的第一能量过滤通量基本上由未散射和弹性散射的带电粒子组成；和
‑ꢀ
生成并记录带电粒子的第二能量过滤通量，该带电粒子的第二能量过滤通量基本上由非弹性散射的带电粒子组成。
31.第一能量过滤通量和所述第二能量过滤通量可用于创建样品的图像。在实施例中，所述光谱设备可以被布置成创建这类图像。
32.由此，如上所述，可以增加从检测到的通量中创建的图像中样品中的颗粒与其周围环境之间的对比度。
33.光谱设备可以包括一个或多个狭缝元件，用于生成所述第一和/或带电粒子的第二能量过滤通量。
34.根据一方面，提供了透射带电粒子显微镜。所述透射带电粒子显微镜包括：
‑ꢀ
带电粒子束源，用于发射带电粒子束；
‑ꢀ
样本固持器，用于固持样本；
‑ꢀ
照射器，用于将从带电粒子束源发射的带电粒子束引导到样本上；和
‑ꢀ
控制单元，用于控制透射带电粒子显微镜的操作。
35.如本文所定义，透射带电粒子显微镜被布置成用于：
‑ꢀ
生成并记录带电粒子的第一能量过滤通量，该带电粒子的第一能量过滤通量基本上由弹性散射的带电粒子组成；和
‑ꢀ
生成并记录带电粒子的第二能量过滤通量，该带电粒子的第二能量过滤通量基本上由非弹性散射的带电粒子组成。
36.透射带电粒子显微镜可包括如本文所定义的光谱设备。
37.现在将基于示例性实施例和所附的示意图更详细地阐明如本文所定义的方法、检测器和显微镜，其中：图1示出带电粒子显微镜的纵向截面视图；图2示出了处于非过滤设置中的如本文所定义的光谱设备的详细视图；图3示出处于如本文所定义的第一能量过滤设置中的图2的光谱设备；图4示出处于如本文所定义的第二能量过滤设置中的图2的光谱设备；图5a
‑
5c示出在对应的不同设置下，用图2
‑
4的光谱设备获得的图像；图5d示出在图5b
‑
5c中获得的图像的组合，其中将图5c添加到图5b中；图6示出包括冰层和嵌入其中的颗粒的样本内的总的弹性的和非弹性的信号的示意性概图；图7示出在图5b
‑
5c中获得的图像的组合，其中从图5b中减去了图5c。
38.在图中，在相关时，对应部分使用对应参考符号表示。应注意，一般而言，附图未按比例绘制。
39.图1是透射带电粒子显微镜m的实施例的高度示意性描绘，在这种情况下，所述透射带电粒子显微镜m是tem/stem（但是，在本公开的上下文中，其可妥当地是例如基于离子的显微镜或质子显微镜）。在图1中，在真空外壳e内，电子源4（例如肖特基发射器）产生横穿电子光学照射器6的电子束（b），用于将其引导/聚焦到样本s的所选部分（其可例如（局部）薄化/平坦化）上。这一照射器6具有电子光轴b'，且通常将包括各种静电/磁透镜、（扫描）偏转器d、校正器（例如象散校正装置（stigmator））等；通常，其还可包括聚光器系统（整个物件6有时称为“聚光器系统”）。
40.样本s固持在样本固持器h上。如这里所说明，这一固持器h的部分（外壳e内部）安装在托架a'中，所述托架a'可通过定位装置（载物台）a在多个自由度上定位/移动；例如，托架a'可（尤其）在x、y和z方向上可移动（参见所描绘的笛卡尔坐标系），且可围绕平行于x的纵向轴线旋转。这类移动允许样本s的不同部分由沿着轴线b'行进的电子束照射/成像/检测（和/或例如允许扫描运动作为束扫描[使用（一个或多个种）偏转器d]的替代方案执行，和/或允许通过（未描绘）聚焦离子束来加工样本s的选定部分）。
[0041]
沿着轴线轴线行进的（聚焦）电子束b将与样本s相互作用，使得各种类型的“受激”辐射从样本s放射，包含（例如）二次电子、背散射电子、x射线和光学辐射（阴极发光）。如果需要，可借助于检测器22来检测这些辐射类型中的一个或多个，所述检测器22可以是例如
组合的闪烁体/光电倍增管或edx（能量色散x射线光谱法）模块；在这种情况下，可使用与sem中基本相同的原理来构造图像。然而，替代地或另外，可以研究横穿（穿过）样本s，从其中发出（放射）并继续沿着轴b'传播（基本上，尽管一般具有一些偏转/散射）的电子。这种透射电子通量进入成像系统（组合物镜/投影透镜）24，其通常将包括各种静电/磁透镜、偏转器、校正器（例如象散校正装置）等。
[0042]
在正常（非扫描）tem模式下，这一成像系统24可将透射电子通量聚焦到荧光屏26上，如果需要，所述荧光屏26可缩回/撤回（如由箭头26'示意性地指示），以便使其离开轴b'的路径。样本s（的部分）的图像（或衍射图）将由成像系统24在屏幕26上形成，且这可通过位于外壳e的壁的合适部分中的查看端口28来观察。屏幕26的缩回机构可例如在本质上是机械的和/或电的，且这里未描绘。
[0043]
作为查看屏幕26上的图像的替代方案，可替代地利用以下事实：从成像系统24出现的电子通量的聚焦深度通常相当大（例如，约为1米）。因此，可在屏幕26的下游使用各种类型的感测装置/分析设备，例如：
‑ꢀ
tem相机30。在相机30处，电子通量可形成静态图像（或衍射图），所述静态图像可由控制器c处理且显示于显示装置（未描绘）上，所述显示装置例如平板显示器。当不需要时，相机30可缩回/撤回（如箭头30'示意性所示），以使其脱离轴线b'。
[0044]
‑ꢀ
stem记录器32。来自记录器32的输出可记录为束b在样本s上的(x,y)扫描位置的函数，且可构建图像，所述图像是来自记录器32的作为x、y的函数的输出的“地图”。记录器32可包括具有例如20 mm的直径的单个像素，而不是特征性地存在于相机30中的像素矩阵。此外，记录器32通常将具有比相机30（例如，每秒102个图像）高得多的采集速率（例如，每秒106个点）。再次，当不需要时，记录器32可缩回/撤回（如由箭头32'示意性地指示），以便使其离开轴b'的路径（但这种缩回在例如环形环状暗场记录器32的情况下将不是必需的；在这种记录器中，当记录器不在使用中时，中心孔将允许束通过）。
[0045]
‑ꢀ
作为使用相机30或记录器32来成像的替代方案，还可调用光谱设备34，其可以是例如eels模块。
[0046]
应注意，物件30、32和34的顺序/方位不是严格的，且可设想许多可能的变型。举例来说，光谱设备34也可集成到成像系统24中。
[0047]
注意，控制器（其可以是组合的控制器和处理器）c经由控制线（总线）c'连接到各种说明的组件。控制器可连接到计算机屏幕51，所述计算机屏幕51可配备有用户界面（ui）。这一控制器c可提供各种功能，例如同步动作、提供设定值、处理信号、进行计算和在显示装置（未描绘）上显示消息/信息。应理解，（示意性地描绘的）控制器c可（部分地）在外壳e内部或外部，且可视需要具有一体式或组合式结构。本领域技术人员将理解，外壳e的内部不必保持在严格的真空下；例如，在所谓的“环境tem/stem”中，将给定气体的背景气氛有意地引入/保持在外壳e内。本领域技术人员还将理解，在实践中，可能有利的是限制外壳e的体积，使得在可能的情况下，其基本上紧靠轴线b'，采取小管（例如，直径约为1cm）（所采用的电子束穿过所述小管）的形式，但加宽以容纳如源4、样本固持器h、屏幕26、相机30、记录器32、光谱设备34等的结构。
[0048]
如本文所定义，透射带电粒子显微镜m包括：
‑ꢀ
带电粒子束源4，用于发射带电粒子束b；
‑ꢀ
样本固持器h，用于固持样本s；
‑ꢀ
照射器6，用于将从带电粒子束源4发射的带电粒子束b引导到样本s上；和
‑ꢀ
控制单元c，用于控制透射带电粒子显微镜m的操作。
[0049]
如本文所定义的透射带电粒子显微镜m被布置成用于生成并记录第一和第二能量过滤通量的透射穿过样本的带电粒子，如将在下文更详细地论述。如本文所定义的透射带电粒子显微镜m可以包括光谱设备34，其被布置成用于生成所述带电粒子的第一和第二能量过滤通量。
[0050]
现在转向图2，示出了这种光谱设备34的细节。图2示出了图1中的光谱设备34的实施例的放大且更详细的视图。在图2中。电子通量1（其已穿过样本s和成像系统24）示出为沿着电子光学轴线b'传播。这一通量1进入色散装置3（“电子棱镜”），在所述色散装置3处其色散（扇出）成沿着色散方向分布的光谱子束的能量分解（能量微分）阵列5；出于说明的目的，这些子束中的三个在图2中标记为5a、5b和5c。
[0051]
在色散装置3的下游，子束阵列5遇到后色散电子光学器件9，例如在该处其被放大/聚焦，并最终引导/投射到检测器11上，以对能量过滤通量的透射穿过样本s的带电粒子进行成像。可以通过调节光学器件9使得光谱设备入口处的平面中的图像成像在检测器11上来完成这类成像。这是能量过滤透射电子显微法（eftem）。替代地，可以通过调节光学器件9来更间接地完成这种成像，使得色散的（扇出的）光谱子束的图像被成像在检测器上，从而形成电子束在样本中的相互作用的电子能量损失光谱（eels）。通过在样品上扫描聚焦束并在每个位置记录eels光谱，可以从记录的后验光谱中重构能量过滤图像。这种替代方法称为扫描透射电子显微法（stem）eels。然而，发明人发现eftem模式更易于使用，因为它不需要仔细调节和聚焦照射束。图2和3及4中的各种设置均适用于eftem模式。应当注意，检测器11是本领域技术人员已知的，并且乳本文所定义的显微镜和/或方法原则上不限于使用特定的检测器。在eftem模式下，光谱设备34包括用于生成能量过滤通量的带电粒子的狭缝。狭缝可以包括一个或多个狭缝元件7、8（也称为狭缝边缘或狭缝刀）。在图2所示的实施例中，光谱设备34包括两个狭缝元件7、8，其可用于过滤子束5a、5b、5c的部分通量。也可设想使用单个狭缝元件，或者使用多于两个狭缝元件。在所示的实施例中，两个狭缝元件7、8可在第一方向d
s
上移动，其中第一方向d
s
至少具有垂直于子束阵列5的传播方向的分量，或者基本上垂直于其。两个狭缝元件7、8可以一起移动，但在实施例中，两个狭缝元件7、8中的每一个可以独立地移动。狭缝元件7、8允许精确选择要成像在检测器11上的子束5a、5b、5c。在如本文所定义的方法中，生成并记录带电粒子的第一和第二能量过滤通量。尽管可以这种方式使用狭缝元件7、8，但是也可设想实现类似结果的其它方式，如将对于本领域技术人员而言是显而易见的。
[0052]
在图2中，狭缝元件7、8移开，因此不对子束5a
‑
5c中的任何一个进行过滤，并且可以使用后色散电子光学器件9中的光学元件在检测器11上形成包括所有光谱信息的图像。
[0053]
现在转向图3和图4，其示出了如何在eftem模式下生成并记录带电粒子的第一和第二能量过滤通量。
[0054]
在图3中，狭缝元件7、8在对应的第一位置中移动，用于生成带电粒子的第一能量过滤通量。在这种情况下，子束5a被过滤（即穿过），而其它子束5b、5c被阻挡。后色散电子光学器件9中的光学元件用于形成仅含有子束5a的光谱信息的图像。这样，生成并记录了带电
粒子的第一能量过滤通量。
[0055]
在图4中，狭缝元件7、8移动到对应的第二位置，用于生成带电粒子的第二能量过滤通量。在这种情况下，子束5a被阻挡，而其它子束5b、5c被穿过到检测器11。
[0056]
如本文所定义，如图3所示，带电粒子的第一能量过滤通量基本上由未散射和弹性散射的带电粒子组成。在所示的实施例中，生成并记录带电粒子的第一能量过滤通量的步骤包括所谓的零损失峰（zlp）过滤，其中带电粒子的第一能量过滤通量包括未散射和弹性散射的带电粒子。由此，获得对比度增加的样本s的图像。
[0057]
如本文所定义，如图4所示，带电粒子的第二能量过滤通量基本上由非弹性散射的带电粒子组成。在所示的实施例中，狭缝元件7、8被定位成使得它们阻挡子束5a（zlp子束）。因此，该方法可以包括所谓的零损失峰（zlp）阻挡的步骤。借助带电粒子的第二能量过滤通量获得的图像也可用于增加样本的对比度。可以使用第一和第二记录的能量过滤通量来以增加的对比度对所述样本s进行成像。要注意的是，如果需要，狭缝元件8仍可在子束之一内移动。举例来说，狭缝元件8可以被设置成阻挡子束5c或子束5的阵列的其它部分。
[0058]
发明人发现，即使对于非常薄的样品（<30 nm），如参考图3所述的zlp过滤也改善了对比度。这与一般的理解所教的不符。通过zlp过滤获得的spa对比度的提高并非来自去除模糊背景，而是来自颗粒与颗粒嵌入其中的周围冰之间的非弹性散射的显著差异。
[0059]
以上利用以下实验结果证明。使用电子显微镜m采集样本s的图像。使用嵌入无定形冰中的去铁铁蛋白颗粒作为样本s。如本领域技术人员所知，显微镜m被设置成spa采集的典型条件：将样本冷却到80 k（以保持冰的无定形结构，并将辐射损伤降到最低）、以直径500 nm、电子通量8个电子/
å2/秒进行平行照射，照射时间5秒。对于每个图像使用相同的光学设置，但是使用通过对狭缝元件7、8使用不同位置而获得的不同的能量过滤通量的带电粒子，来拍摄图像。使用图2至4的设置，并且对应的结果示于图5a
‑
5c中。
[0060]
在第一张图像（图5a）中，没有插入狭缝7、8，并且使用束中的所有电子（未散射的、弹性和非弹性的）制作了该图像。这对应于图2所示的设置。去铁铁蛋白颗粒a（其中一些用圆圈表示，以增加可读性）与冰冷区域i（其中一个表示增加的可读性）很难区分开。
[0061]
在第二张图像（图5b）中，将狭缝插入到用于zlp过滤的位置，仅使未散射和弹性散射的电子（
±
10 ev）通过。这对应于图3所示的设置。显然，zlp过滤（图5b）使去铁铁蛋白清晰可见。为了使清晰度最大化，对图像进行了处理，以去除所有超出1/2 nm的空间频率，但应注意，未经处理的图像也清楚地示出zlp过滤提高去铁铁蛋白的可辨识性。
[0062]
在第三张图像（图5c）中，上狭缝边缘8完全缩回，并且下狭缝边缘7移动到上边缘的原始位置。这阻挡了未散射和弹性散射的电子，并且仅使非弹性电子通过。这对应于图4所示的设置。冰冷区域i和去铁铁蛋白颗粒a在某种程度上也是可区分的。
[0063]
图5d示出了图5b和5c所示的图像的总和，即，zlp过滤图像和zlp阻挡图像的总和。正如预期的，zlp过滤图像和zlp阻挡图像的总和（图5d）非常类似于未过滤的图像（图5a），包含（几乎）不存在去铁铁蛋白和冰之间的对比度。因此，通过将zlp阻挡图像添加到zlp过滤图像中，可以使在zlp过滤图像中可很好识别的去铁铁蛋白变得不可识别。由此可以推断，zlp阻挡的图像还必须携带一些有力的信息。
[0064]
图5c揭示了此信息的性质：恰好在颗粒的位置，非弹性信号较高。逻辑上，非弹性信号强度的这种增加伴随着弹性信号强度的对应降低。这种降低的强度（以及高频信息）使
颗粒在zlp过滤图像中可识别（图5b）。图6示意性地描绘了去铁铁蛋白颗粒a处的非弹性信号的强度的这种增加，以及去铁铁蛋白颗粒a处的弹性信号（即，未散射和弹性散射的电子）的强度的对应的降低。因此，从图6可以推断出，弹性信号和非弹性信号都包括关于样本s中的特征的信息，在这种情况下，在冰层i中存在颗粒a。
[0065]
从eels光谱分析得知，非弹性信号主要受等离激元损失的影响，该等离激元损失发生在10 ev
……
40 ev能量损失左右。发明人从图5c得出结论，去铁铁蛋白中的等离激元相互作用必须强于冰中。等离激元是样本中价电子的集体振荡。根据egerton (egerton, r.f., 2011.《电子显微镜中的电子能量损失光谱分析（electron energy
‑
loss spectroscopy in the electron microscope. ）》 doi：10.1007/978
‑1‑
4419
‑
9583
‑
4）“等离激元激发的基本要求是，参与电子可以彼此通信并共享它们的能量，一种这对于离域态带是满足的但对于类原子的核心层并不是满足的情况。”发明人假设，等离激元在无定形冰中比在颗粒中受激的可能性小，因为冰的疏松和不规则结构使电子彼此之间的通信不如颗粒中的好。
[0066]
第一和第二记录的能量过滤通量可以用于以增加的对比度对所述样本进行成像。鉴于上文，本发明的实施例通过以下操作来使用在zlp过滤图像中可获得的信息（即，高频信息和等离激元对比度）和在zlp阻挡图像中可获得的信息（即，等离激元对比度）：
‑ꢀ
首先，在大致样本在失去结构完整性之前可以承受的最大剂量（在300 kv束电势下，通常40 e/
å2）下记录zlp过滤图像；并且然后
‑ꢀ
其次，在同一位置，记录类似（或更高）剂量的zlp阻挡图像。
[0067]
zlp阻挡图像中的等离激元信号改善了能够定位颗粒（或更一般来说，样本中所关注区域）的准确性。这可以通过许多方式来完成。可设想的是，对等离激元图像进行处理，以例如定位颗粒，并使用该信息在zlp过滤图像中定位颗粒和/或增强zlp过滤图像。
[0068]
在另一个实施例中，从zlp过滤图像中减去等离激元图像。这类修改的实例在图7中示出。这里，从zlp过滤图像（图5b）中减去zlp阻挡图像（图5c）。这产生了高质量的图像，在颗粒和颗粒嵌入其中的冰之间具有更高的对比度。然后可以对该图像进行数字处理和/或分析以识别颗粒。在实施例中，进行成像和识别的颗粒可以用于形成所述样品颗粒的三维（3d）重构。这里，通过例如从zlp过滤图像中减去zlp阻挡图像，来使用所述带电粒子的第一和第二能量过滤通量。
[0069]
在减去之前，可将等离激元图像调整一个因子。可以针对最大对比度优化该因子。
[0070]
可以注意到，尽管针对样本的已经受到一定辐射损伤的部分记录了zlp阻挡图像，但这并不是限制性的，因为等离激元信号不需要（也不能）携带高频信息。因此，使用最大剂量来获得zlp过滤图像是可接受的。
[0071]
要注意的是，第一能量过滤通量原则上可以包括总谱的任何选定的子谱，只要它包含弹性散射的带电粒子即可。在实施例中，可设想的是，以优化图像结果的方式选择狭缝元件7、8之间的距离和位置。对于用于生成第二能量过滤通量的狭缝元件的距离和位置也是如此。换句话说，可以改变并凭经验确定zlp过滤图像和zlp阻挡图像之间的边界的最佳位置，以呈现最佳图像结果。倘若对未知的颗粒或样本进行成像，这将很有帮助。在这种情况下，在开始实际的spa采集之前，以不同狭缝宽度采集一小部分的图像可能很有帮助。
[0072]
生成并记录第二能量通量的带电粒子（如捕获例如zlp阻挡图像）花费额外的时
间，并且这会根据每个载物台移动所需的时间和每次曝光所需的时间而使吞吐时间增加一定倍数。对于一些样品，与2000个弹性图像相比，1000个弹性图像和1000个非弹性图像得到更好的重构，这一事实可以抵消这种影响。另外，在实施例中，当采集非弹性图像时可以提高束电流，这减少了非弹性图像的采集时间。对于小颗粒，传统的采集方法需要高质量的薄冰。网格筛查需要很长时间才能找到薄冰（如果存在的话）。利用非弹性图像中的信息，可以使用中等或较厚的冰，从而有效地增加吞吐量。最后要说明的是，当由于某种原因样品仅具有有限数量的颗粒（比方说，少于1000个）时，吞吐时间是不太相关的参数，在这种情况下，希望获得每个可用颗粒的所有信息，而不管吞吐时间如何。
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期望的保护由所附权利要求书确定。