一种整体免疫后双固定包埋制样法

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1.本发明属于透射电子显微镜领域，具体涉及一种整体免疫后双固定包埋制样法。


背景技术：

2.透射电子显微镜是现有分辨率最高的显微镜。利用透射电镜不仅可以观察组织的超微结构，结合酶定位、离子定位、免疫纳米金标记技术，则可以得知预期的酶、特定离子、抗原(多数时候是蛋白)在细胞器中的分布情况。
3.透射电子显微镜要求样品非常薄，且不含水，所以生物组织通常需要经历醛固定
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四氧化锇固定
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脱水
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包埋
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超薄切片
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重金属染色的过程才能放入透射电子显微镜中观察。常规的免疫标记技术，则是在超薄切片制成后用一抗结合抗原，再用含有纳米金颗粒的二抗结合一抗。金颗粒成像为黑圆点与组织成像结果不同，从而可以得到抗原在细胞中的分布情况(标记抗原得到其定位信息)。因为醛基固定液中的戊二醛及四氧化锇会使抗原完全变性，无法与一抗结合，所以后续需要做免疫金标记的样品在制备过程中，往往不使用戊二醛及四氧化锇这两种固定剂，通过牺牲组织结构的固定效果来保证抗原活性。但是固定是样品制备中非常关键的步骤，目的是终止细胞的生化过程，稳定细胞物质成分，保持生活细胞原来的微细构造，避免细胞自溶和因外界微生物的入侵而产生腐败，造成假像出现，以及在一些组分的分子之间以化学反应或物理反应建立交联，以提供一个骨架来稳定各种细胞器的空间构型，而且固定剂四氧化锇还可以提高图像反差效果。由于只使用多聚甲醛这种固定剂，所以免疫标记的样品通常固定不好，最后呈现出来的组织结构差，甚至有抗原非常敏感容易变形，整个实验流程下来组织结构和抗原活性都得不到良好的保存。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种抗原活性保存和组织结构保存都完好的整体免疫后双固定包埋制样法。
5.本发明的整体免疫后双固定包埋制样法，其是在透射电子显微镜样品常规制样(醛固定
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四氧化锇固定
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脱水
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包埋)的前面，先让一抗二抗结合抗原，然后再进行透射电子显微镜样品制样。
6.优选，是在一抗二抗结合抗原之前用离析酶和/或triton
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100处理固定后的材料，使得材料的细胞壁和细胞膜上打开通道。
7.优选，所述的在一抗二抗结合抗原之前用离析酶和/或triton
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100处理固定后的材料的具体步骤为：将组织切成块，固定，磷酸缓冲液清洗后的材料置于离析酶酶解液中消化，然后清洗，再置于tritonx
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100溶液中处理，再用磷酸缓冲液清洗。
8.进一步优选，所述的离析酶是质量分数0.15％离析酶，所述的tritonx
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100溶液是质量分数0.1％～0.2％的tritonx
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100溶液。
9.优选，具体步骤为：
10.a、将组织切成块，用质量分数4％的多聚甲醛固定，再用质量分数0.15％离析酶酶
解液消化细胞壁，质量分数1％脱脂奶粉浸泡封闭材料，然后先后进行一抗、二抗的孵育；
11.b、孵育后的材料先后用含质量分数2％的多聚甲醛和质量分数2.5％戊二醛的溶液固定、质量分数1％的四氧化锇固定，固定后的材料经清洗后，再经脱水、过渡、渗透、包埋、聚合，得到环氧树脂包埋块。
12.环氧树脂包埋块经超薄切片、染色后就可以用透射电镜观察。
13.进一步优选，具体步骤为：
14.a、第一次固定：组织切成小块，最大厚度不大于500微米，放置于质量分数4％的多聚甲醛的磷酸缓冲液溶液抽气保存2小时，4℃；
15.b、第一次清洗：将固定后的材料用磷酸缓冲液清洗5次，每次5min，4℃；
16.c、消化细胞壁：磷酸缓冲液配置含质量分数0.15％离析酶酶解液，将步骤b的组织块置于酶解液中，室温消化材料45min，之后用4℃下磷酸缓冲液清洗3次每次5min；
17.d、膜渗透：将步骤c的材料置于含质量分数0.1％～0.2％tritonx
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100磷酸缓冲液溶液中,4℃处理材料30min，之后磷酸缓冲液清洗5次每次5min；
18.e、封闭：4℃下用磷酸缓冲液溶解的质量分数1％脱脂奶粉浸泡封闭材料35min；
19.f、一抗：4℃下用磷酸缓冲液溶解的一抗溶液孵育材料1h；
20.g、二抗胶体金：4℃下用磷酸缓冲液清洗材料3次，每次5min；用磷酸缓冲液溶解的二抗胶体金溶液孵育材料1h，用磷酸缓冲液清洗材料5次，每次5min；
21.e、第二次固定：用含质量分数2％的多聚甲醛和质量分数2.5％戊二醛的磷酸缓冲液再次固定材料，放4℃冰箱过夜，待第2天进行脱水包埋；
22.h、第二次清洗：4℃的磷酸缓冲液洗掉样品中多余的固定液，15分钟4次，30分钟2次，共6次；
23.i、第三次固定：含质量分数1％的四氧化锇磷酸磷酸缓冲液，4℃固定4小时；
24.j、第三次清洗：4℃磷酸缓冲液洗掉样品中多余的固定液，15分钟4次30分钟2次，共6次；
25.k、脱水：按体积分数计，30％乙醇20分钟
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50％乙醇20分钟
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70％乙醇过夜4℃
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80％乙醇20分钟
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90％乙醇20分钟
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100％乙醇30分钟
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100％乙醇30分钟
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环氧丙烷30分钟2次，常温；逐步处理样品进行脱水；
26.l、过渡：用环氧丙烷与ep812树脂体积比为3:1，30分钟1次，常温；1:1，1小时1次，常温；1:3，2小时1次，常温的混合液逐步处理样品；
27.m、渗透：用epon812树脂浸泡样品，3小时1次，常温；再用epon812树脂浸泡样品，15小时1次，常温；再用纯ep812树脂浸泡样品，7小时1次，常温；
28.n、包埋：把样品放置在纯ep812树脂中，15小时1次；
29.o、聚合：烘烤包埋块，60℃，共60小时，使之固化，得环氧树脂包埋块块，待切片。
30.本发明是在常规制样的前面，先让一抗二抗结合抗原，则无需再担心抗原的活性问题，通过离析酶和triton
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100，在细胞壁和细胞膜上打开通道，解决了抗原和一抗二抗的接触不好的难题，提高标记的成功率，后面的步骤可以按照生物组织块的制样流程使用戊二醛及四氧化锇，从而解决了抗原活性保存和组织结构保存难以兼容的问题。
附图说明：
31.图1是对比例的常规制样获得的样品的透射电镜图；
32.图2是膜渗透中用磷酸缓冲液溶液(含质量分数0.1％tritonx
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100)处理的制得的样品；
33.图3是膜渗透中用磷酸缓冲液溶液(含质量分数0.2％tritonx
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100)处理的制得的样品。
具体实施方式：
34.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
35.实施例1：
36.样品信息：百脉根根瘤
37.整体免疫后双固定包埋制样流程：
38.1、第一次固定：组织切成小块，最大厚度不大于500微米，放置于质量分数4％的多聚甲醛的磷酸缓冲液溶液抽气保存2小时，4℃；
39.2、第一次清洗：将固定后的材料用磷酸缓冲液清洗5次，每次5min，4℃；
40.3、消化细胞壁：磷酸缓冲液配置的酶解液(含终浓度为质量分数0.15％离析酶macerozyme,2mm mes,ph5.0)，将步骤2的组织块置于酶解液中，室温消化材料45min，之后用4℃下磷酸缓冲液清洗3次每次5min；
41.4、膜渗透：将步骤3的材料置于磷酸缓冲液溶液(含质量分数0.1％tritonx
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100或0.2％tritonx
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100)中,4℃处理材料30min，之后磷酸缓冲液清洗5次每次5min；
42.5、封闭(blocking)：4℃下用磷酸缓冲液溶解的质量分数1％(终浓度)脱脂奶粉浸泡封闭材料35min；
43.6、一抗：4℃下用磷酸缓冲液溶解的一抗gfp溶液孵育材料1h；
44.7、二抗胶体金(blocking)4℃：4℃下用磷酸缓冲液清洗材料3次每次5min；用磷酸缓冲液溶解的二抗胶体金溶液孵育材料1h，用磷酸缓冲液清洗材料5次每次5min；
45.8、第二次固定：用含质量分数2％的多聚甲醛和质量分数2.5％戊二醛的磷酸缓冲液再次固定材料，放4℃冰箱过夜，待第2天进行脱水包埋；
46.9、第二次清洗：0.1m磷酸缓冲液(ph7.2，4℃)洗掉样品中多余的固定液，15分钟4次，30分钟2次，共6次；
47.10、第三次固定：含质量分数1％的四氧化锇、ph7.2的0.1m磷酸磷酸缓冲液，4℃固定4小时；
48.11、第三次清洗：0.1m磷酸缓冲液(ph7.2，4℃)洗掉样品中多余的固定液，15分钟4次30分钟2次，共6次，4℃；
49.12、脱水：按体积分数计，30％乙醇20分钟
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50％乙醇20分钟
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70％乙醇过夜4℃
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80％乙醇20分钟
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90％乙醇20分钟
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100％乙醇30分钟
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100％乙醇30分钟
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环氧丙烷30分钟2次常温；逐步处理样品进行脱水；
50.13、过渡：用环氧丙烷与ep812树脂体积比为3:1(30分钟1次，常温)、1:1(1小时1次，常温)、1:3(2小时1次，常温)的混合液逐步处理样品；
51.14、渗透：用epon812树脂浸泡样品，3小时1次常温；再用epon812树脂浸泡样品，15
小时1次常温；再用纯ep812树脂浸泡样品，7小时1次，常温
52.15、包埋：把样品放置在纯ep812树脂中，15小时1次；
53.16、聚合：烘烤包埋块，60℃，共60小时，使之固化，得环氧树脂包埋块块，放置一周后，待切片；
54.17、超薄切片：切片厚度70nm；
55.18、染色：4％醋酸铀染色15分钟。
56.19、用透射电镜进行观察。
57.透射电镜结果如图2和图3所示。
58.对比例：常规制样
59.本对比例步骤：
60.1.固定：冰浴操作，4℃保存；0.1m ph＝7.2磷酸钠缓冲液配置的质量分数4％多聚甲醛及质量分数0.5％戊二醛固定液中快速切小样品，样品体积必须要小于1mm3，抽气，固定2h；
61.2.清洗：冰浴操作，4℃保存；0.1m ph＝7.2磷酸钠缓冲液清洗4次；每次间隔15min
62.3.脱水：冰浴操作；体积分数30％乙醇30min，4℃保存；体积分数50％乙醇1h，
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20℃保存；体积分数70％乙醇1h，
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20℃保存；100％乙醇2次，每次1h，
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20℃保存；
63.4.渗透：冰浴操作，
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35℃保存；100％乙醇：lowicryl k4m(1:1v/v)1小时；100％乙醇：k4m 1:2v/v 1小时；纯k4m两次，每次一个半小时。
64.5.包埋：用纯k4m包埋样品；厌氧密封处理；
65.6.聚合：
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35℃紫外照射48h后，弱紫外线照射下慢慢恢复至常温。
66.7.超薄切片：样品切70nm
67.8.封闭：4℃下用磷酸缓冲液溶解的质量分数1％(终浓度)脱脂奶粉浸泡封闭超薄切片5min；
68.9.一抗：4℃下用磷酸缓冲液溶解的一抗gfp溶液孵育超薄切片1h；
69.10.二抗胶体金：4℃下用磷酸缓冲液清洗超薄切片3次每次5min；用磷酸缓冲液溶解的二抗胶体金溶液孵育超薄切片1h，再磷酸缓冲液溶解的质量分数1％(终浓度)脱脂奶粉浸泡封闭超薄切片两次每次5min；接着用磷酸缓冲液清洗超薄切片2次每次5min；ddh2o清洗超薄切片2次每次5min；
70.11.染色：4％醋酸双氧铀溶液浸泡超薄切片5min；
71.12.清洗：ddh2o清洗超薄切片4次每次5min；晾干
72.13.透射电镜上机观察。
73.透射电镜结果如图1所示。
74.效果说明：图1为对比例所得结果：超薄切片有破损，样品组织结构差，未见明显的标记(金颗粒)；图2为实验例中triton
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100含量为0.1％的结果：超薄切片平整完好，样品组织结构良好，菌膜完好，内含物致密饱满，抗原活性保存良好，金颗粒分布明确，细腻不抱团；图3为实验例中triton
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100含量为0.2％的结果：超薄切片平整完好，样品组织结构较为良好，菌膜基本完好，内含物稍有丢失，抗原活性尚可，金颗粒分布明确，但稍有抱团。(备注：金颗粒为黑色圆形致密黑点)。