一种金刚石纳米晶的细胞内组装方法及其应用

1.本发明属于金刚石纳米晶技术领域，尤其涉及一种金刚石纳米晶的细胞内组装方法及其应用。


背景技术：

2.活细胞内的细胞器在特定位置会发生吸热和放热，所以检测活细胞内的温度对研究细胞内的行为和相互作用非常重要。为了实现细胞内的测温，可使用温度敏感材料进行测量，例如量子点、有机染料和纳米凝胶等，其中量子点和有机染料虽然易吞入细胞内，但由于其荧光闪烁所产生的荧光具有不稳定性，并且对局部环境(例如ph值、压力和离子浓度等)有很大的依赖性，因此测温效果较差；而纳米凝胶可以测量整个细胞的温度，但很难测量细胞特定位置的温度。
3.而嵌入氮空位(nv
‑
)的金刚石纳米晶具有高度的生物兼容性、稳定的荧光特性和灵敏的温度传感特性，且纳米金刚石尺寸小，易于进入细胞内部，但单个金刚石纳米晶微粒的荧光强度较弱导致其信号探测困难，为了提高金刚石纳米晶的检测能力，需要将其组装为金刚石纳米晶颗粒的形式。现有金刚石纳米晶的组装方法有多种，但每种方法都存在其缺陷和不足。例如，自组装虽然是一种低成本且简单的方法，但受限于热力学难以形成稳定胶体结构；声学或磁学辅助方法适用于大面积的组装，难以在单细胞内实现实施；基于金膜的光热组装方法可实现单颗粒的操控和组装，但是依赖于金膜的热转换限制了在单细胞内应用。
4.因此，希望提出更为有效、可靠、稳定的金刚石纳米晶的组装方法。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种金刚石纳米晶的细胞内组装方法及其应用。采用该方法能够充分发挥金刚石纳米晶易于进入细胞内部的特性，在细胞内部实现金刚石纳米晶的组装过程；经组装后的金刚石纳米晶微球不会发生解体，且具备优良的荧光强度，可被用于测量细胞内不同位置的温度。
6.本发明提供了一种金刚石纳米晶的细胞内组装方法，包括以下步骤：
7.(1)将金刚石纳米晶与细胞培养液混合，得到金刚石纳米晶溶液；
8.(2)将所述金刚石纳米晶溶液杀菌消毒后与细胞一起孵育，孵育完成后，去除细胞外多余的金刚石纳米晶，得到含有金刚石纳米晶的细胞；
9.(3)向所述含有金刚石纳米晶的细胞施加光势阱，组装得到金刚石纳米晶微球；
10.所述光势阱的光功率为30
‑
200mw，所述光势阱的作用时间为60
‑
200s，所述金刚石纳米晶微球的直径为0.3
‑
2μm。
11.本发明通过将金刚石纳米晶和细胞混合进行孵育，使金刚石纳米晶通过胞吞作用进入细胞内。再通过施加一个至多个光势阱，对金刚石纳米晶进行捕获和移动，并在细胞内的不同位置处(如不同细胞器所在处)组装形成金刚石纳米晶微球；通过设置光势阱阵列的
方式，不仅可组装成金刚石纳米晶微球，并能形成图案化阵列。本发明采用光势阱实现了金刚石纳米晶在细胞内的排列和组装，可在细胞内任意位置对分散的金刚石纳米晶组装形成金刚石纳米晶微球，并可使金刚石纳米晶的荧光强度变强，提高了其温度传感性能，实现在细胞内不同位置处的温度测量。
12.由于在进行温度检测时持续施加光势阱会影响到测定准确性，因此需保证组装得到的金刚石纳米晶微球在撤去光势阱时也能保持稳定而不发生解体现象。本发明通过试验得出，在上述光功率和作用时间下，能够组装得到颗粒大且稳定的金刚石纳米晶微球。
13.优选的，步骤(1)还包括对所述荧光纳米金刚石溶液进行超声震荡。为了使荧光纳米金刚石在溶液中充分分散，可采用超声震荡促进其分散。
14.更优选的，所述超声震荡的频率为20
‑
80khz。
15.优选的，步骤(1)还包括对所述金刚石纳米晶溶液进行杀菌消毒。由于金刚石纳米晶需在细胞体内进行组装，因此进行杀菌消毒可避免潜在微生物的不利影响。
16.更优选的，所述杀菌消毒为紫外光处理。
17.优选的，步骤(2)所述孵育的时间为3
‑
6h。
18.本发明还提供了上述金刚石纳米晶的细胞内组装方法在测定细胞温度中的应用。
19.本发明还提供了一种细胞温度测定方法，采用上述金刚石纳米晶的细胞内组装方法后，再通过紫外
‑
可见光
‑
近红外分光光度计对细胞内组装得到的金刚石纳米晶微球进行测定，以测量细胞温度。
20.相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
21.与其他温度敏感材料相比，金刚石纳米晶具有高度生物兼容和荧光稳定特性。本发明提出采用光势阱可实现在单细胞内不同位置处组装和图案化排列金刚石纳米晶微球，并可控制所形成微球的直径，有效提高了金刚石纳米晶的荧光强度和温度探测精度，可用于测定细胞内不同位置的温度情况。同时，本发明所组装得到的金刚石纳米晶微球还具有高度稳定性，在撤去光势阱时也不会发生解体。
附图说明
22.图1为在细胞内组装和图案化排列金刚石纳米晶的实验装置图；激光器1，声光偏转2器，扩束器3，二向色镜4，滤光片5，水浸物镜6，载物台7，移动平台8，照明光源9，rgb
‑
led光源10，透镜11，滤光片12，二向色镜13，高速ccd摄像机14；
23.图2为本发明中使用光势阱组装和图案化排列金刚石纳米晶微球的实验结果图；其中a为不同直径的金刚石纳米晶微球的共聚焦显微成像图；b为不同直径的金刚石纳米晶微球的的荧光图片；c为不同直径的金刚石纳米晶微球的扫描电子显微图片；d为在水溶液中将金刚石纳米晶微球排列为“nano”字母图案的光学成像图片；e为将金刚石纳米晶微球排列为“nano”图案固定在载玻片上，在546nm激光激发下的暗场荧光图片；
24.图3为使用光势阱组装金刚石纳米晶微球的实验数据统计图；其中a表示在一定时间下，组装金刚石纳米晶微球直径随激光功率变化的实验结果曲线图；b表示在固定捕获功率下，组装金刚石纳米晶微球直径随组装时间变化的实验结果曲线图；c表示不同直径金刚石纳米晶微球的荧光光谱图；
25.图4为金刚石纳米晶微球的稳定状态与捕获激光功率和捕获时间的关系；其中a表
示开启激光作用20s时所形成的金刚石纳米晶微球；b
‑
d表示开启激光作用一定时间，再关闭激光后金刚石纳米晶微球的稳定性状况；e表示在不同激光功率下维持微球稳定状态所需的时间；
26.图5为在不同单细胞内组装和图案化排列金刚石纳米晶微球的实验结果图；其中a表示不同肿瘤细胞的共聚焦显微图像；b表示使用光势阱阵列在空间排列成不同图案的示意图；c表示使用光势阱阵列在不同单细胞内组装和图案化排列金刚石纳米晶微球的荧光图；
27.图6是采用光势阱在细胞内组装金刚石纳米晶微球后，在不同位置进行细胞内温度探测的实验图；其中a表示人脑微血管内皮细胞(hmec
‑
1)的共聚焦显微镜图；b表示对人脑微血管内皮细胞(hmec
‑
1)的线粒体染色的暗场荧光图；c表示金刚石纳米晶在hmec
‑
1中不同位置组装并形成图案的荧光图像；d表示在不同温度溶液中纳米金刚石的荧光光谱图，插图为20
‑
60℃时荧光光谱的零声子线(zpls)的随温度升高进而红移的放大图；e表示在20
‑
60℃的每个温度下校准zpl的实验曲线图；f表示测量hmec
‑
1的细胞核膜和细胞膜附近金刚石纳米晶微球的荧光光谱图。
具体实施方式
28.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
29.以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
30.实施例1
31.本实施例是对金刚石纳米晶进行组装和图案化排列的实验。图1所示为对金刚石纳米晶颗粒进行组装实验所用到的装置，如图1所示，波长为1064nm的激光器1(激光波长：1064nm)发出的激光束通过声光偏转器2(可调控光势阱的位置和强度；阱位分辨率：0.01nm)，经扩束器3扩束，再经二向色镜4向上反射后，经过滤光片5进入水浸物镜6(放大倍数60倍；数值孔径：1.0)后焦距到移动平台上8(移动精度：60
±
5nm，可实现三维移动)的载物台7上形成光势阱。rgb
‑
led光源的光束10(中心波长：546nm)经滤光片12后通过二向色镜13耦合到显微镜的光路中，然后经水浸倒物镜6聚焦到载物台7上作为激发光，观察样品所用背景光由照明光源9提供，实验过程由高速ccd摄像机14拍摄，并在计算机屏幕上实时监控。
32.室温下，将直径大小平均为100
±
30nm，且单个金刚石纳米晶中色心数不少于300个的金刚石纳米晶配置成金刚石纳米晶溶液，并放置在超声震荡机中，以60khz的频率震荡2min，使金刚石纳米晶在去离子水中处于分散的状态。取上述0.5ml金刚石纳米晶溶液(金刚石纳米晶浓度为2.7
×
105/ml)滴在载玻片上，再放置于移动平台8上，使用上述装置在该样品上设置一个光势阱，使金刚石纳米晶颗粒受到光力作用而被捕获到势阱中心。如图2中a(a1
‑
a3)所示，在功率为60mw的条件下，随着捕获激光1064nm的持续作用，更多的金刚石纳米晶颗粒逐渐被捕获并组装形成稳定的微球结构，在光势阱作用时间分别为5s、7s和30s
时，分别组装出直径为0.8μm、1.5μm和2μm的金刚石纳米晶微球。以上结果表明，金刚石纳米晶微球的大小可以通过改变捕获激光的功率和时间进行调整。
33.图2中b(b1
‑
b3)和c(c1
‑
c3)分别为上述经组装得到的金刚石纳米晶微球的荧光图片和扫描电子显微图片。随着组装微球直径增大，组装微球的荧光强度随之增强，证明了该组装方法可增强金刚石纳米晶的荧光强度。
34.如图2中的d所示，通过由声光偏转器所控制的光势阱，将其设置为光势阱阵列，能够实现多个纳米金刚石微球的组装，并形成图案化排列。在溶液中设置光势阱阵列，捕获和收集纳米金刚石形成字母“nano”图案，并通过在z方向上移动光势阱阵列的位置，向载玻片方向逐渐靠近并贴近载波片，由于微球和载玻片之间的范德华力作用使得组装微球固定在载玻片上。如图2中e所示，在546nm激光照射下，在暗场下可观察到“nano”字母荧光图像。
35.图3所示为采用光势阱对金刚石纳米晶进行组装的实验数据统计图。其中，图3中a表示在一定时间下，组装金刚石纳米晶微球直径随激光功率变化的实验结果曲线图，结果表明，所组装微球随着捕获光功率的增大，其直径变大；图3中b表示在固定捕获功率下，组装金刚石纳米晶微球直径随组装时间变化的实验结果曲线图，结果表明，随着时间的增长，组装得到的金刚石纳米晶组装微球的直径发生增大；图3中c表示不同直径的金刚石纳米晶微球的荧光光谱图，结果表明，沿箭头前进的方向，所表示的金刚石纳米晶微球的直径发生增大，此时荧光强度也随之增加。
36.为了验证金刚石纳米晶微球的稳定状态与捕获激光功率和捕获时间的关系，使用波长为1064nm，功率为50mw的激光，作用20s时形成直径为2μm的金刚石纳米晶微球(图4中a所示)。然后测试在不同激光作用时间后关闭光势阱，并观察微球的分散情况。如图4中b和c所示，在作用时间分别为第30s、第40s时关闭光势阱，则微球发生分散，此时的组装微球处于不稳定状态；如图4中d所示，当激光作用时间达到50s时，即使是撤掉光势阱，该微球依然保持稳定球状结构。而图4中e给出了在不同激光功率下维持微球稳定状态所需的时间，结果表明，激光功率越大，维持微球稳定状态所需的时间越短。
37.在细胞内部，在使用功率为60mw的1064nm激光捕获分散金刚石纳米晶形成稳定状态的微球后，保持激光作用时间达到100s，然后撤掉激光，组装后的微球依旧维持稳定状态。
38.实施例2
39.本实施例是在不同单细胞内对金刚石纳米晶进行组装和图案化排列的实验。如图5中a所示，本实施例中所使用的细胞为较典型的肿瘤细胞，包括有4t1细胞(小鼠乳腺肿瘤)、c127细胞(小鼠乳腺肿瘤)和hela细胞(宫颈癌细胞)，上述肿瘤细胞分别在rpmi 1640、dmem和mem培养基中培养。培养基中添加10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素/链霉素溶液(p/s)。然后将这些细胞放入加湿培养箱中(温度：37℃；二氧化碳浓度：5％)，在24小时内增长到约70％的浓度，然后用pbs洗涤细胞三次，去除培养基。
40.再将金刚石纳米晶(100
±
30nm)与新鲜培养基配置成浓度约为30μg/ml的溶液。紫外线灭菌30分钟后，将溶液添加到细胞培养皿中，然后放入培养箱(温度：37℃；二氧化碳浓度：5％)中培养4小时，此时金刚石纳米晶由于胞吞作用进入到单细胞内。最后用完全培养基冲洗细胞，去除细胞外的金刚石纳米晶颗粒。然后用hoechst 33342染料(碧云天生物技术研究所，上海，激发光波长：350nm，发射光波长：461nm)染色30min(最终浓度：2mg/ml)，该
染料是结合细胞核内的dna，用染料荧光强度表征细胞活性，标记后用pbs洗涤去除多余的染色试剂。
41.使用图1所示装置在三种不同细胞样品上分别设置如图5中b所示的线形(b1)、矩形(b2)和圆形(b3)的扫描光势阱阵列(1064nm)，所设置光势阱阵列的捕获光功率为60mw，光势阱阵列捕获分散在细胞质中的金刚石纳米晶组装成微球，并形成图案化的组装纳米金刚石微球阵列，如远离细胞核的线性，靠近细胞核的矩形和围绕细胞核的圆形阵列。用激发光(546nm)照射，得到如图5中c所示组装纳米金刚石微球的荧光图像，在细胞内组装成微球并形成相应的图案(c1
‑
c3所示)。实验中用350nm激光进行照射，可激发被hoechst 33342染料染色的细胞核，正常的活细胞呈圆形且dna应分布均匀。从图5中c可以看出，该细胞核中染料分布均匀，细胞核呈圆形表示细胞活性未受到影响。
42.实施例3
43.本实施例通过测量人脑微血管内皮细胞(hmec
‑
1)内不同位置组装的金刚石纳米晶微球的荧光光谱来实现细胞内温度检测。将hmec
‑
1细胞接种于直径为20mm的共聚焦培养皿中24h，生长至约70％的浓度，然后用pbs洗涤三次，去除培养基。然后将金刚石纳米晶(100
±
30nm)与新鲜培养基配置成浓度约为30μg/ml的溶液。紫外线灭菌30min后，将溶液添加到细胞培养皿中，然后放入培养箱(温度：37℃；二氧化碳浓度：5％)中培养4小时。最后用完全培养基冲洗细胞，去除细胞外的金刚石纳米晶，在共聚焦显微镜下细胞的观察结果如图6中a所示，细胞状态良好。
44.再使用mito
‑
tracker green(碧云天生物技术研究所，上海，激发光波长：490nm，发射光波长：516nm)对hmec
‑
1细胞中线粒体进行荧光染色30min，以确定线粒体在细胞内的分布位置，然后用培养基洗涤去除游离的染色试剂。培养结束后，用荧光显微镜分别在490nm和516nm的激发和发射波长下观察样品，结果如图6中b所示，线粒体大部分集中在细胞核周围。
45.使用图1所示装置在细胞内不同位置设置多个光势阱，以捕获和收集细胞质中分散的金刚石纳米晶，并组装形成金刚石纳米晶微球。将金刚石纳米晶微球排列于如图6中c所示的细胞核膜ⅰ和细胞膜ⅱ所在位置。
46.在进行细胞温度测量前，首先获得金刚石纳米晶的温度定标曲线。将金刚石纳米晶放置在水溶液中，使用精度为0.5℃的温控台控制水温，待水温稳定时，使用紫外
‑
可见光
‑
近红外分光光度计对不同温度溶液中金刚石纳米晶微球进行多次温度定标，记录20
‑
60℃时水温相对应金刚石纳米晶的荧光光谱，以及随水温变化的荧光峰位关系。如图6中d所示，nv色心产生了一个宽的发射带，峰值在685nm，且温度在20
‑
60℃区间内，其荧光强度的变化很小，而随着溶液温度的进一步升高，在637nm处电子跃迁的zpl(零声子线)呈现红移。如图6中e所示，通过在20℃到60℃的每5℃测量zpl来进行校准，线性拟合表明热位移为25℃/nm，由此获得金刚石纳米晶的温度定标曲线。
47.图6中f所示为使用紫外
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可将光
‑
近红外显微分光光度计(craic，20/30pv
tm
)测量靠近细胞核膜和细胞膜的金刚石纳米晶微球的荧光光谱结果。结果表明，zpl在靠近细胞核膜和靠近细胞膜处分别移动到637.8nm和637.9nm，与温度定标曲线对比，可获得细胞核膜i和细胞膜ii位置处的温度差为2.5℃，表明细胞核膜处的温度比细胞膜的温度高，这是因为由于正常细胞中产能线粒体通常都聚集在细胞核周围，因此细胞核处的温度应高于其他位
置，这与上述实际测量结果相符。以上结果表明，本发明组装得到的金刚石纳米晶微球可以在所需位置进行细胞内温度检测。
48.上面结合附图对本技术实施例作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。