用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及属于微流控免疫荧光检测技术领域，更具体地说，它涉及一种用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液及其制备方法与应用。


背景技术：

2.微流控技术是一种在微米尺度空间对流体进行操控为主要特征的科学技术，其技术核心是微流控芯片。微流控芯片具有检测速度快、高通量、灵敏度高、试剂消耗少等优势，近年来迅速发展。20世纪90年代，a.mans等采用芯片提出了微全分析系统(微流控芯片)的概念，在该系统中，分析样品的进样、预处理、化学反应、分离和检测等功能实现了装备的微型化、自动化和一体化。
3.微流控免疫荧光检测芯片的检测原理为：全血通过检测卡上的过滤膜，将血细胞与血浆分离后，血浆流入检测卡中的混合区，其中血浆中的抗原或抗体通过与混合区中荧光标记抗体发生免疫反应，随后荧光抗体与血浆中的抗原或抗体随反应液流入微结构的流道中被固定在流道中的另一抗体捕获，通过测定其荧光强度计算待测物质的浓度。进样和对过滤膜前处理是微流控芯片工作的前两个环节。
4.高灵敏度是微流控芯片的主要优势之一，但也是最大的挑战之一。市面上对许多项目的检测都有极高的灵敏度需求，如bnp检测下限为5pg，ctni检测下限为50pg等，这对微流控芯片工作的每个环节都有极高要求。为提高检测微流控检测的灵敏度，研究者们主要从改变抗体交联体系和荧光材料等方面入手。过滤膜承担着对样本前处理这一重要环节，目前普遍所用过滤膜仅发挥着从过滤红细胞和促进血浆流动两个作用。实验室前期的研究表明，过滤膜前处理的配方对项目的检测灵敏度起关键影响，对于检测阈值较高的项目如myo的检测，通过优化交联体系等方法使用普通过滤膜仅能达到要求，但对于检测灵敏度较高的项目使用普通过滤膜则稍显不佳，因此，研制其处理配方至关重要。


技术实现要素：

5.为了提高微流控芯片检测的灵敏度，本发明提供一种用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液。
6.一种用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液，包括溶剂和溶质，所述溶剂为缓冲液tris
‑
hcl，所述tris
‑
hcl的浓度为50mm/l
‑
100mm/l，所述溶质包括2g/l
‑
6g/l的表面活性剂，1g/l
‑
5g/l的pvp，3g/l
‑
6g/l的peg6000，20g/l
‑
60g/l的糖类，30g/l
‑
60g/l的惰性蛋白，1mg/l
‑
5mg/l的异噬性抗体，1mg/l
‑
5mg/l抗红细胞抗体，0.5g/l
‑
1g/l的防腐剂。
7.通过采用上述技术方案，缓冲液tris
‑
hcl提供血浆中的抗原抗体与芯片底板上包被的抗体抗原抗体免疫反应最佳的ph,离子强度；表面活性剂和pvp促进血浆流动，有利于荧光物质分散；peg6000和糖类物质均能增强抗原抗体反应灵敏度；惰性蛋白能够对过滤膜起到封闭作用，减少非特异性吸附，增强抗原抗体反应灵敏度；异噬性抗体减少对非特异性
抗原产生的反应；抗红细胞抗体提高红细胞过滤效率，减少红细胞破裂后物质对检测产生的干扰；防腐剂可提高前处理液各种成分的保存时间。
8.优选的，所述表面活性剂为triton x
‑
100、tween20、s10、s11中的一种或者多种。
9.通过采用上述技术方案，triton x
‑
100、tween20、s10、s11中的一种或者多种都能控制血浆流动速度，但是triton x
‑
100的效果最佳。
10.优选的，所述糖类物质为葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖的一种或多种。
11.通过采用上述技术方案，葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖的一种或多种都能增强抗原抗体反应灵敏度，但是葡萄糖的使用效果最佳。
12.优选的，所述惰性蛋白为bsa、酪蛋白、脱脂奶粉等的一种或多种。
13.通过采用上述技术方案，bsa、酪蛋白、脱脂奶粉等的一种或多种都能对过滤膜起到封闭作用，减少非特异性吸附，增强抗原抗体反应灵敏度，但是bsa的使用效果最佳。
14.优选的，所述防腐剂为pc300、叠氮化钠中的一种或者多种。
15.通过采用上述技术方案，pc300、叠氮化钠中的一种或者多种都能起到防腐剂的作用，但是pc300的使用效果最佳。
16.优选的，所述糖类为葡萄糖，所述惰性蛋白为bsa，所述葡萄糖：peg6000：bsa的比值为10：1：10。
17.通过采用上述技术方案，bsa、peg6000和葡萄糖三种物质的组合能够显著提高对血浆中的抗原抗体检测灵敏度，当海藻糖：peg6000：bsa的比值为10：1：10时，效果最佳。
18.优选的，所述溶质包括：6g/l的triton x
‑
100，5g/l的pvp,6g/l的peg6000，60g/l的葡萄糖糖，60g/l的bsa，5mg/l的异噬性抗体,5mg/l抗红细胞抗体,1g/l的pc300。
19.通过采用上述技术方案，当各种溶质的浓度是上述浓度时，此时对血浆中的抗原抗体的检测结果最佳。
20.一种用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液的制备方法，包括以下步骤：调节tris的ph使得ph值为7.8
‑
8.2，将溶质表面活性剂pvp,peg6000，糖类，惰性蛋白，异噬性抗体,抗红细胞抗体与tris混合搅拌，直至溶解。
21.通过采用上述技术方案，先将tris的ph值进行调节，ph过高或过低都会降低检测信号，然后通过混合搅拌制备出前处理液。
22.一种用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液的应用，包括以下步骤：在前处理液中放入过滤膜，浸泡5min
‑
10min，取出平置干燥，20
‑
40℃烘干12h
‑
24h后取出，密封保存备用。
23.通过采用上述技术方案，过滤膜在前处理液中进行浸泡，浸泡时间小于5min，过滤膜未完全均匀吸收溶液，导致同批次过滤膜间差异较大，影响检测重复性；浸泡时间大于10min过滤膜过分吸收溶液膨胀，部分溶解于溶液中，影响过滤膜形状，使其形状不适用于底板；烘干后进行保存，经过前处理液的过滤膜的增强了微流控芯片检测的灵敏度，使得血浆中的抗原抗体的检测更加精准。
24.综上所述，本发明具有以下有益效果：
25.1.本发明通过采用tris
‑
hcl为溶剂，溶质包括：表面活性剂，pvp，peg6000，糖类，惰性蛋白，异噬性抗体，抗红细胞抗体防腐剂；缓冲液tris
‑
hcl提供抗血浆中的待测抗原抗体与芯片底板上包被的抗原抗体反应最佳的ph,离子强度；表面活性剂和pvp促进血浆流
动，有利于荧光物质分散；peg6000和糖类物质均能增强抗原抗体反应灵敏度；惰性蛋白能够对过滤膜起到封闭作用，减少非特异性吸附，增强抗原抗体反应灵敏度；异噬性抗体减少对非特异性抗原产生的反应；抗红细胞抗体提高红细胞过滤效率，减少红细胞破裂后物质对检测产生的干扰；防腐剂可提高前处理液各种成分的保存时间。
26.2.本发明中葡萄糖：peg6000：bsa的比值为10：1：10，bsa、peg6000和葡萄糖三种物质起协同作用能够显著提高检测灵敏度，当葡萄糖：peg6000：bsa的比值为10：1：10时，效果最佳；
27.3.本发明中的前处理液应用时，将过滤膜放入前处理液中，浸泡5min
‑
10min，取出平置干燥，20
‑
40℃烘干12h
‑
24h后取出，密封保存备用，经过浸泡后的过滤膜提高了过滤膜检测的稳定性。
具体实施方式
28.现免疫荧光检测常用过滤膜仅发挥着促进样本流动的作用，忽视了其前处理环节对检测可发挥的潜在价值。本发明旨在对市面上免疫荧光检测产品所用以玻璃纤维为原材料的过滤膜研制了一种过滤膜前处理液配方，经所述处理液处理的过滤膜使用在微流控芯片上能够提高靶标物的检测灵敏度；降低玻璃纤维对靶标物的吸附，减少非特异性吸附，降低检测cv；促进血浆流动速度缩短检测时长；高效过滤红细胞减少其对检测的影响。
29.以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
30.本发明原料来源均为市售。
31.实施例
32.实施例1
‑733.以下实施例1为例进行说明，用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液的制备方法，包括以下步骤：
34.(1)配制浓度为50mm/l的缓冲液tris
‑
hcl，用4m/l的盐酸调节ph值；
35.(2)称取表面活性剂pvp，peg6000，糖类，惰性蛋白，异噬性抗体,抗红细胞抗体于干净的烧杯中；
36.(3)然后将缓冲液tris
‑
hcl加入步骤(2)的烧杯中，在磁力搅拌器上以300
‑
500rpm搅拌速度搅拌20min至物质全部溶解，定容至100ml后继续搅拌10min。
37.实施例1
‑
6的溶剂浓度、溶剂ph值以及各溶质浓度的取值参见表1、表2以及表3。
38.表1为实施例1
‑
5的溶剂浓度、溶剂ph值以及各溶质浓度表
[0039] 实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5缓冲液ph7.87.988.18.2tris
‑
hcl(mm/l)50607080100triton x
‑
100(g/l)23456pvp(g/l)12345peg6000(g/l)33.5456葡萄糖(g/l)2030405060bsa(g/l)3040455060异噬性抗体(g/l)12345
抗红细胞抗体(g/l)12345pc300(g/l)0.50.60.80.91
[0040]
表2为实施例6的溶剂浓度、溶剂ph值以及溶质浓度表
[0041][0042][0043]
表3为实施例7的溶剂浓度、溶剂ph值以及溶质浓度表
[0044] 实施例6缓冲液ph8.2tris
‑
hcl(mm/l)100triton x
‑
100(g/l)6pvp(g/l)5peg6000(g/l)6葡萄糖(g/l)60脱脂奶粉(g/l)60异噬性抗体(mg/l)5抗红细胞抗体(mg/l)5pc300(g/l)1
[0045]
实施例1
‑
6中的表面活性剂可以替换成triton x
‑
100、tween20、s10、s11中的一种
或者多种；糖类物质可替换成葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖的一种或多种；惰性蛋白可替换成bsa、酪蛋白、脱脂奶粉等的一种或多种。
[0046]
对比例
[0047]
对比例1
‑2[0048]
与实施例1的不同之处在于：溶剂浓度、溶剂ph值以及溶质浓度取值不同。对比例1
‑
2的溶剂浓度、溶剂ph值以及溶质浓度的取值参见表4。
[0049]
表4为对比例1
‑
2的溶剂浓度、溶剂ph值以及溶质浓度表
[0050] 对比例1对比例2缓冲液ph79tris
‑
hcl(mm/l)20200triton x
‑
100(g/l)110pvp(g/l)0.510peg6000(g/l)110葡萄糖(g/l)10100bsa(g/l)10100异噬性抗体(mg/l)0.510抗红细胞抗体(mg/l)0.510pc300(g/l)0.15
[0051]
对比例3
[0052]
常规的前置液的配方为0.1％
‑
2％的表面活性剂，该对比例中采用的配比为1％的表面活性剂。
[0053]
用于提高免疫荧光检测灵敏度的过滤膜前处理液的应用，包括以下步骤：将实施例1
‑
7以及对比例1
‑
3制备得到的前处理液中放入过滤膜，浸泡5
‑
10min；然后将过滤膜取出平置干燥，在20
‑
40℃烘干12h
‑
24h后取出，密封保存备用。实施例1
‑
7以及对比例1
‑
3的浸泡时长、烘干温度以及时长见表5。
[0054]
表5实施例1
‑
7以及对比1
‑
3的浸泡时长、烘干温度以及时长表
[0055]
[0056]
性能检测试验
[0057]
将在实施例1
‑
7以及对比例1
‑
3的前制备液中放入过滤膜，浸泡5min
‑
10min，取出平置干燥，20
‑
40℃烘干12h
‑
24h后取出，然后将过滤膜放置在微流控芯片上进行检验，检验结果见表6。
[0058]
表6多个过滤膜检验结构表
[0059][0060][0061]
根据表6，可以看出经过实施例1
‑
7与对比例3的前处理液处理的过滤膜的检测结果：荧光信号增强，背景信号减弱，荧光物质也没有团聚，流动时长也相对较短，经过本发明处理过的过滤膜不仅能提高血浆的流动速度，还能提高微流控芯片检测的灵敏度。
[0062]
根据表6，经过对比例1
‑
2与实施例1
‑
7的前处理液处理的过滤膜的检测结果相比，当前处理液的ph大于8.2或小于7.8，缓冲液的浓度小于50mm/l或者大于100mm/l，pvp的浓度小于1g/l或者大于5g/l，peg6000的浓度小于3g/l或者大于6g/l，糖类的浓度小于20g/l或者60g/l，惰性蛋白的浓度小于30g/l或者大于60g/l，异噬性抗体的浓度小于1ng/l或者大于5ng/l，抗红细胞抗体的浓度小于1ng/l或者大于5ng/l，防腐剂的浓度小于0.5g/l或者大于1g/l时，检测结果显示荧光信号减弱，背景信号增强，荧光物质团聚，流动时长增加。
[0063]
根据表1和表2可知，实施例5与实施例6相比，除了将葡萄糖替换成海藻糖以外，其他条件相同，根据表6可知，经过实施例6与实施例5的前处理液处理的过滤膜的检测结果相比，荧光信号减弱，背景信号增加。
[0064]
根据表1和表3可知，实施例5与实施例7相比，除了将bsa替换成脱脂奶粉以外，其
他条件相同，根据表6可知，经过实施例7与实施例5的前处理液处理的过滤膜的检测结果相比，荧光信号减弱，背景信号增加。
[0065]
所以当前处理液中的糖类为葡萄糖，惰性蛋白为bsa时，检测结果最佳，主要原理是因为葡萄糖与bsa以及peg6000发生协同作用，共同提高了过滤膜的检测效果。
[0066]
根据表6可知，实施例1
‑
3与实施例4
‑
5的检测结果相比，葡萄糖：peg6000：bsa的浓度比值为10：1：10时，荧光信号最佳。
[0067]
根据表6可知，实施例1
‑
5各溶质的原料相同，但当溶质是以下配比：6g/l的triton x
‑
100，5g/l的pvp,6g/l的peg6000，60g/l的葡萄糖糖，60g/l的bsa，5mg/l的异噬性抗体,5mg/l抗红细胞抗体,1g/l的pc300时，检测结果显示荧光信号最强，背景信号最低，荧光物质未团聚，流动时长较低，此时的配比是本发明的最佳配比。
[0068]
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。