一种生物标志物TK1的Simoa试剂盒及其使用方法

一种生物标志物tk1的simoa试剂盒及其使用方法
技术领域
1.本发明涉及免疫检测技术和体外检测领域，特别是指一种生物标志物tk1的simoa试剂盒及其应用。


背景技术：

2.胸腺激酶(thymidine kinase 1,tk1)是癌变细胞dna合成过程中的一种重要的酶，与细胞分裂有着密切关系，正常人在细胞分裂时，其体液中tk1表达含量相当低，而在肿瘤患者体液中一般显著升高。肿瘤细胞在细胞分裂时能产生大量tk1并且进入血液导致肿瘤患者体液中含量高于良性肺部疾病患者和健康人群。因此，tk1可作为一种标志物检测用于肺部体外检测。另外，tk1对非小细胞肺癌的术后监测有着可靠的研究价值。有研究表明，非小细胞肺癌患者术后tk1的是升高会导致其生存期缩短，证明体液中tk1的含量可作为非小细胞肺癌患者术后生存期的预测因子。
3.目前临床上使用的tk1检测方法主要是免疫印迹分析法、化学发光免疫分析法、酶活性分析法。其中，免疫印迹分析法是最常见的一种方法。但是该方法灵敏度较低，耗时长，样本量需求大，不利于对病情的持续观察。其它两种方法可以快速、灵敏地检测出结果，但是这些方法重复性差，变异系数大。
4.单分子阵列(single molecule array,simoa)技术又称为数字elisa，是基于磁珠的蛋白质超灵敏检测方法。在双抗体夹心elisa中，酶
‑
底物反应的荧光产物扩散至约50
‑
100μl的大体积，需要依赖数百万酶标记的免疫复合物在背景之上产生可测量的荧光信号。在数字elisa中，酶
‑
底物反应的荧光产物被限制在46飞升(fl)大小的微孔中，其被称为单分子阵列(simoa)。使用该方法，可以检测单个酶分子的存在。在simoa免疫测定中，将抗体包被的捕获珠过量加入含有低浓度靶蛋白分子的样品中。基于泊松分布原理，一个或零个目标蛋白质分子将与每个磁珠结合。结合多于一个蛋白质分子的磁珠可以忽略不计。然后将磁珠与生物素化的检测抗体和链霉亲和素
‑
β
‑
半乳糖苷酶一起孵育，形成酶标记的免疫复合物。接着，将磁珠载入到46fl的微孔阵列上，其中每个孔仅能够容纳一个磁珠。用荧光底物填充微孔并用全氟油密封。含有单一免疫复合物的珠子将导致许多底物分子经酶催化产生大量荧光产物。由于荧光产物被限制在约46fl的极小体积，结合荧光显微成像技术即可实现单个微孔的荧光成像，从而实现单个蛋白分子的检测。以这种方式，simoa可以使用数字读数模式定量蛋白质浓度，并实现超过4个数量级的检测范围。
5.因此，基于simoa技术开发一种高灵敏度、自动化程度高、快速、准确性好且适合推广的tk1检测方法，对快速检测生物标志物tk1具有重大的意义。


技术实现要素：

6.本发明提出一种生物标志物tk1的simoa试剂盒及其应用，以便解决现有技术中操作复杂、样本量需求大及灵敏度不足等技术问题
7.本发明的技术方案是这样实现的：
8.一种生物标志物tk1的simoa试剂盒，所述simoa试剂盒包括捕获抗体包被的磁珠、tk1标准品、生物素化的检测抗体、sbg溶液、荧光底物溶液和样本稀释液。
9.所述捕获抗体包被的磁珠的制备方法为：
10.(1)将捕获抗体通过超滤管进行换液处理；
11.(2)将2.7μm磁珠用edc进行活化；
12.(3)于4℃条件下，将步骤(1)处理的捕获抗体与步骤(2)活化的磁珠混合孵育2
‑
3h；
13.(4)经步骤(3)孵育的产物用pbst溶液洗两次后，用封闭液于37℃封闭，最后用磁珠稀释液洗两次，即获得捕获抗体包被的磁珠，于磁珠稀释液中储存。
14.所述步骤(1)中捕获抗体为单克隆抗体m86541；超滤使用的缓冲液是为50mmol/l吗啉乙磺酸缓冲液，ph＝6.2。
15.所述步骤(3)中捕获抗体的反应浓度为0.1
‑
0.2mg/ml；活化的磁珠的反应浓度为1.2
×
109/ml。
16.所述步骤(4)中pbst溶液为10mmol/l pbs+1％tween 20，ph＝7.4；封闭液为10mmol/l pbs+1％bsa，ph＝7.4；磁珠稀释液为50mmol/l tris
‑
hcl+10mmol/l edta+0.1％tween20+1％bsa，ph＝7.4。
17.所述生物素化的检测抗体的制备方法为：将检测抗体用pbs溶液通过超滤管进行置换缓冲液处理，于室温下加入nhs
‑
biotin或其衍生物，反应30min，得生物素化后的检测抗体，用超滤管进行纯化，即获得生物素化的检测抗体，其中检测抗体为单克隆抗体m86542。
18.所述检测抗体与nhs
‑
biotin或其衍生物的反应物质的量比为1:40；pbs溶液为10mmol/l磷酸盐缓冲液，ph＝7.4。
19.所述sbg溶液从原始浓度通过酶稀释液稀释到浓度为150pmol/l，其中酶稀释液为10mmol/l pbs+0.5％bsa+1mmol/l mgcl2，ph＝7.4；所述tk1标准品通过样本稀释液被配制成1ml，其余标准品可以根据需要自行稀释配制；其中样本稀释液为10mmol/l pbs+5mmol/l edta+0.1％tween20+2％bsa；荧光底物为试卤灵
‑
β
‑
半乳糖苷，荧光底物溶液的浓度为100μmol/l；
20.所述生物标志物tk1的simoa试剂盒在制备疾病诊断试剂中的应用。
21.所述生物标志物tk1的simoa试剂盒在检测人体液中tk1含量中的应用。
22.本发明具有以下有益效果：
23.本发明提供的基于simoa平台和双抗体夹心法检测人体液中tk1蛋白含量的simoa试剂盒，为以单克隆抗体m86541为捕获抗体，以单克隆抗体m86542检测抗体的一种人tk1双抗体夹心数字化elisa检测试剂盒，不仅可以定性还可以定量的检测人体液中tk1含量；具有高灵敏度、高通量、较低样本量可为25μl、自动化、花费时间短(1h)、操作简便、检测范围宽(0.3
‑
1000pg/ml)等特点，由附图1可知本技术的最低检测限可达0.05pg/ml。本发明可以作为一种无创伤性的诊断和监测癌症(尤其是肺癌)病程发展的方法。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现
有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1为本发明tk1 simoa试剂盒标准曲线图。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例
28.本发明提供的用于检测人体液中tk1含量的simoa试剂盒，包含捕获抗体包被的2.7μm磁珠、tk1标准品、生物素化的检测抗体、链霉亲合素
‑
β
‑
半乳糖苷酶(sbg)溶液、荧光底物溶液和样本稀释液，以及实验方法电子文件。
29.在本发明中，磁珠、捕获抗体、标准品、检测抗体、生物素化试剂、sbg和荧光底物的原始材料通过购买获得；其中捕获抗体为单克隆抗体m86541，检测抗体为单克隆抗体m86542。
30.在本发明的捕获抗体包被磁珠方案中，制备过程为：首先，储存的抗体通过超滤管进行换液处理，所使用的缓冲液是mes，所述mes为50mmol/l吗啉乙磺酸缓冲液，ph＝6.2。
31.然后，磁珠用edc进行活化，4℃环境下，捕获抗体和活化的磁珠孵育2h。接着，用pbst洗两次，再用封闭液37℃封闭，最后用磁珠稀释液洗两次，储存在磁珠稀释液中，即获得捕获抗体包被的磁珠。其中捕获抗体的反应浓度为0.1
‑
0.2mg/ml；活化的磁珠的反应浓度为1.2
×
109/ml。
32.所述pbst配方：10mmol/l pbs+1％tween 20，ph＝7.4；封闭液配方：10mmol/l pbs+1％bsa，ph＝7.4。磁珠稀释液配方：50mmol/l tris
‑
hcl+10mmol/l edta+0.1％tween20+1％bsa，ph＝7.4。
33.在本发明的生物素化检测抗体方案中，制备过程为：首先，原始储存的检测抗体用pbs通过超滤管进行缓冲液置换处理。然后，室温下加入nhs
‑
biotin或其衍生物，反应30min。最后，生物素化后的检测抗体用超滤管进行纯化，即获得生物素化的检测抗体。pbs配方：10mmol/l磷酸盐缓冲液(pbs)，ph＝7.4。其中检测抗体与nhs
‑
biotin或其衍生物的反应物质的量比为1:40。
34.酶和底物溶液的配制：sbg从原始浓度通过酶稀释液稀释到150pmol/l，底物用上述pbs稀释到100μmol/l；其中酶稀释液为：10mmol/l pbs+0.5％bsa+1mmol/l mgcl2，ph＝7.4。
35.上述最终浓度均是工作浓度，用于最终的成像。
36.所述底物为：试卤灵
‑
β
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半乳糖苷(rgp)
37.标准品溶液的配制：100ng/ml tk1标准品通过样本稀释液被配制成1ml。其余标准品可以根据需要自行配制，其中样本稀释液为：10mmol/l pbs+5mmol/l edta+0.1％tween20+2％bsa。
38.tk1 simoa试剂盒的使用方法：
39.首先，将实验方法电子文档导入quanterix生产的hd
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1/hd
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x simoa分析仪上，该实验方法电子文档包含了实验运行的方式。该实验方法电子文档上的方法，可以根据需求进行更改，以适合试剂盒的试剂用途。
40.此实验方法电子文档包括：磁珠、样本及检测抗体的反应时间(35min)，磁珠用量(25μl)，检测抗体的用量(20μl)，标准品和样品的用量(150μl)，sbg的用量(100μl)及反应时间(5min)。本发明默认反应时间设置为(35min
‑
5min)，默认方法是simoa 2.0两步法。标准品浓度可以被自定义设置，默认设置为(500，167，55.6，16.5，6.17，2.06，0.68，0pg/ml)。
41.然后，浓度为2
×
107/ml的磁珠，浓度为1μg/ml的检测抗体，浓度为150pmol/l的sbg，浓度为100μmol/l的荧光底物rgp和加有标准品和样本的96孔板装载到分析仪指定位置，同时扫描标签和设置位置参数。
42.最后，运行实验。待实验结束，导出实验结果，仪器自动拟合曲线和计算样本结果，见图1。
43.拟合方程为：四参数logistic曲线拟合方程：y＝(a
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d)/[1+(x/c)
^
b]+d。
[0044]
本技术的simoa试剂盒在检测人体液中tk1含量中的应用也属于本发明的保护范围。
[0045]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。