一种用于实时检测环境中新冠病毒的电化学传感器及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及一种实时检测环境中新冠病毒的电化学传感器，即将对新冠病 毒具有选择性识别能力的功能材料负载于电极制备电化学传感器，能够实时检 测各种环境中的新冠病毒，并可以再生后重复使用。


背景技术：

2.新型冠状病毒(sars
‑
cov
‑
2)导致的新型冠状病毒肺炎(covid
‑
19)疫情 在全球的蔓延已经波及绝大多数国家和地区，感染人数达数千万，为公共健康 和人类发展带来巨大灾难。除在人群中感染，在环境样品中检出新冠病毒的情 况逐渐增加，环境中新冠病毒再次感染人群的案例也越来越多，已经成为新冠 病毒传播的一种新的形式。因此，开展环境中新冠病毒的检测至关重要。
3.当前新冠病毒检测手段主要针对人体，包括核酸检测方法，免疫学检测方 法和病毒分离鉴定等。核酸检测准确率很高，在感染早期即可呈现阳性，相关 专利已有较多涉及，如专利“一种新冠病毒检测试剂盒及其检测方法 (cn112048574a)”设计了一系列检测新型冠状病毒的引物探针组。但该方法检 测程序复杂、费时，对于样品的保存、核酸提取、操作人员的熟练程度以及操 作环境都有较高的要求。酶联免疫吸附剂测定法是利用抗原与抗体特异性结合 进行免疫反应的定性和定量检测方法，如专利“一种新型冠状病毒蛋白的快速 免疫方法及其应用(cn202011529108.1)”公开了一种新型冠状病毒抗体检测试 剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括各自独立包装的试剂1与试剂2，试剂2至 少包括包被有新冠蛋白的胶乳微粒，用于与被测样本中的新型冠状病毒抗体发 生抗原抗体反应，以形成凝集使浊度改变并得到被测样本中的新型冠状病毒抗 体含量。但此类方法准确率受限且检测较慢，常不能实现早期诊断。病毒分离 方法需要数天培养，特异性和敏感性都会低于核酸检测法。而且，上述方法都 主要用于人体中新冠病毒的检测，而环境中因素复杂、影响因素众多，导致上 述方法的可用性进一步降低。开发一种简便、快速、识别能力强、灵敏度高， 适用于环境中新冠病毒检测的方法有着重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于制备一种可用于环境中新冠病毒检测的电化学传感器， 该电极能够选择性识别各种环境中的新冠病毒，可用于空气和水等环境中新冠 病毒的实时在线检测。
5.本发明提供的用于实时检测环境中新冠病毒的电化学传感器，包括玻碳电 极和玻碳电极表面均匀涂覆的功能材料，涂覆厚度为0.14
‑
1.4mm；其中功能材 料的结构为碳纳米管为基底，被聚丙烯酰胺包覆，聚丙烯酰胺表层镶嵌有新冠 病毒表面蛋白印迹；该传感器能够定量检测环境中新冠病毒的浓度，检测范围 达10ng/l
‑
100ug/l，准确率达84
‑
89％，该传感器能够再生后重复利用，重复利 用的准确率达88％
‑
93％。
6.本发明提供了该用于实时检测环境中新冠病毒的电化学传感器的制备方法： 将具有对新冠病毒具有选择性识别能力的材料负载于玻碳电极，制备新冠病毒 检测的电化学传感器，用于实时检测环境中新冠病毒，并在检测后对材料进行 再生利用，其方案如下：
7.1)将羧基化碳纳米管(cnts
‑
cooh)溶于水分散为稳定悬浊液，加入n
‑ꢀ
羟基琥珀酰亚胺(nhs)和碳二亚胺盐酸盐(edac)振荡后离心后清洗沉淀。 沉淀加入新冠病毒表面蛋白，振荡后离心，去离子水清洗沉淀。cnts
‑
cooh和 nhs的质量比在(3～12):1，cnts
‑
cooh和edac的质量比在(4～20):1；cnts
‑
cooh和新冠病毒表面蛋白的质量比在(25～100):1。
8.2)将步骤1)中的沉淀重悬后加入丙烯酰胺(aam)、n,n
’‑
亚甲基双丙 烯酰胺(nnmba)和过硫酸盐，振荡3
‑
6小时后离心，去离子水清洗沉淀。将 沉淀加入弱酸溶液振荡3
‑
12h后充分清洗，后干燥去水得到待负载至电极的材 料(mip)。cnts
‑
cooh和aam的质量比在(0.5～2):1；cnts
‑
cooh和nnmba 的质量比在(0.2～1):1；cnts
‑
cooh和过硫酸盐的质量比在(3～15):1。
9.3)将玻碳电极经氧化铝粉末抛光，去离子水清洗电极，涂覆0.4～0.7ul/mm2nafion(全氟磺酸
‑
聚四氟乙烯共聚物)溶液(质量浓度为0.1％
‑
2％)。将步骤2) 中的材料mip在溶液中分散，超声2
‑
30min得到稳定悬浊液，取0.14～1.4ul/mm
2 mip分散液滴涂在打磨好的电极上，室温晾干，在浸泡液中浸泡2
‑
30min，去离 子水清洗后干燥，得到新冠病毒电化学传感器。
10.4)使用制备的新冠病毒电化学传感器检测实际水环境中的新冠病毒，操作 方案如下：
11.配制不同梯度浓度的新冠病毒溶液，终浓度分别为1ng/l
‑
10ug/l，将制备 的电化学传感器置于上述新冠病毒溶液1
‑
30min，随后取出清洗，应用电化学工 作站中的dpv方法读取峰值电流，建立新冠病毒蛋白浓度与信号之间的标准曲 线。另外将新冠病毒电化学传感器置于未知浓度的新冠病毒溶液中，根据测得 的峰值电流和上述标准曲线得出新冠病毒的浓度。另外将浓度与标准方法(bca 试剂盒)对比，确定该方法测定的准确率。
12.5)对制备的新冠病毒电化学传感器进行再生重复利用，操作方案如下：
13.将新冠病毒加入缓冲液，使终浓度为10ng/l
‑
100ug/l，将制备的电化学传 感器置于上述新冠病毒溶液1
‑
30min，随后取出清洗，应用电化学工作站中的 dpv方法读取峰值电流。将上述电化学传感器置于碱性次氯酸盐中反应5
‑
60min， 取出清洗后置于新冠病毒蛋白溶液(10ng/l
‑
100ug/l)1
‑
30min，再次测定峰 值电流。
14.优选步骤1)中cnts
‑
cooh悬浊液的浓度优化为5
‑
20mg/ml；新冠病毒表 面蛋白优化为衣壳蛋白或s蛋白。
15.优选步骤2)中过硫酸盐优化为过硫酸钠、过硫酸钾或过硫酸铵；弱酸溶液 种类优化为草酸或醋酸，浓度优化为0.5～2mol/l。
16.优选步骤3)中玻碳电极的直径优化为3mm
‑
8mm。氧化铝粉末抛光的粒 径优化为分别经1～5mm、0.5～0.8mm和0.2～0.4mm的氧化铝粉末抛光。mip 的分散溶液优化为去离子水、dmf(n,n
‑
二甲基甲酰胺)或pbs(磷酸盐缓冲 溶液)；mip稳定悬浊液的浓度优化为0.1
‑
1mg/ml。浸泡液优化为去离子水或 pbs。
17.优选步骤5)中碱性次氯酸盐溶液的浓度优化为0.1
‑
1mol/l。
18.本发明有益效果是：
19.新冠病毒电化学传感器对实际环境中的新冠病毒具有灵敏的电化学响应， 在10ng/l
‑
100ug/l新冠病毒浓度范围内产生电信号和浓度间具有良好的线性关 系；对水中新冠病毒的检测准确率达84
‑
89％；新冠病毒电化学传感器能够再生 利用，经再生后对新冠病毒具有和再生前相近的电化学响应信号，重复利用的 准确率达88％
‑
93％。
附图说明
20.图1：实施例1制备的电化学传感器外观照片
21.图2：实施例1制备的电化学传感器透射电镜图
22.图3：实施例1制备的电化学传感器对1ng/l新冠病毒溶液响应的dpv曲线
23.图4：实施例1制备的电化学传感器对1ug/l新冠病毒溶液响应的dpv曲线
24.图5：实施例1制备的电化学传感器测定新冠病毒的标准曲线
25.图6：实施例1制备的电化学传感器的再生前后的dpv曲线
26.图7：实施例2制备的电化学传感器的再生前后的dpv曲线
27.具体实施方式
28.基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所 获得的所以其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例1：
30.1)取10mg市售羧基化碳纳米管(cnts
‑
cooh)置于5ml离心管加入1ml 去离子水超声分散，加入1ml含nhs(1.7mg)和edac(1.3mg)的混合溶 液振荡，随后离心弃上清液，用2ml去离子水离心清洗3次。清洗后的沉淀加 入含0.2mg新冠病毒衣壳蛋白的pipes缓冲溶液(0.1mol/l)，振荡4h后离心。 弃上清液，沉淀用2ml去离子水离心清洗。
31.2)将步骤1)得到的产物中在1mlpipes溶液中重悬，加入10mgaam、 20mgnnmba振荡使其溶解。然后加入1.5mg过硫酸铵，室温下振荡3h。振 荡后溶液离心后弃上清液，用2ml去离子水离心清洗。沉淀加入2ml1mol/l 的草酸溶液，室温下振荡12h。振荡后溶液离心后弃上清液，用2ml去离子水 离心清洗。将沉淀置于烘箱干燥，得到待负载至电极的材料(mip)。
32.3)将市售的3mm玻碳电极分别经5mm、0.8mm和0.4mm的氧化铝粉末 抛光，浸入10ml去离子水清洗电极，涂覆5ulnafion溶液(质量浓度为2％， 涂覆量为0.7ul/mm2)。将步骤2)制备的mip1mg加入1mldmf溶液，超声 30min得到稳定悬浊液，取10ulmip分散液滴涂在打磨好的电极上(涂覆量为 1.4ul/mm2)，室温晾干，在pbs中浸泡2min，去离子水清洗后干燥，得到新 冠病毒电化学传感器。
33.4)测定未知样品中新冠病毒的浓度：配制不同浓度的新冠病毒溶液，终浓 度分别为1ng/l、10ng/l、100ng/l、1μg/l、10ug/l，将制备的电化学传感 器置于上述新冠病毒溶液10min，随后取出清洗，应用电化学工作站中的dpv 方法读取峰值电流，建立新冠病毒蛋白浓度与信号之间的标准曲线。另外将新 冠病毒电化学传感器置于未知浓度的新冠病毒溶液中，根据测得的峰值电流和 上述标准曲线得出新冠病毒的浓度。另外将浓度与标准方法(bca试剂盒)对 比，确定该方法测定的准确率。
34.5)新冠病毒电化学传感器的再生：配制新冠病毒溶液使其终浓度为100ng/l， 将
制备的电化学传感器置于上述新冠病毒溶液10min，随后取出清洗，应用电 化学工作站中的dpv方法读取峰值电流。将上述电化学传感器置于1mol/l碱 性次氯酸钠溶液中反应30min，取出清洗后置于100ng/l的新冠病毒衣10min， 再次测定峰值电流。
35.本实施例中，材料在电极上的涂覆厚度为1.4mm；该新冠病毒电化学传感 器产品的透射电镜图像见图1，可看到负载的功能材料的粒径为20nm。该新冠 病毒电化学传感器对1ng/l和1ug/l的新冠病毒的dpv响应曲线见图2和图3， 峰值电流分别为2.8ua和16.8ua。电化学传感器测定新冠病毒的标准曲线见图 4，标准曲线方程为y(ua)＝19.2+0.09x(ug/l)，对未知样本新冠病毒检测的浓度 为9.5ug/l，标准方法的检测浓度为10.7mg/l，因此该传感器的检测准确率为 89％；该新冠病毒电化学传感器再生后对新冠病毒仍具有电化学响应(图5)， 检测准确率达88％。
36.实施例2：
37.1)取5mg市售羧基化碳纳米管(cnts
‑
cooh)置于5ml离心管加入1ml 去离子水超声分散，加入1ml含nhs(1.7mg)和edac(1.25mg)的混合 溶液振荡，随后离心弃上清液，用2ml去离子水离心清洗3次。清洗后的沉淀 加入含0.2mg新冠病毒s蛋白的pbs缓冲溶液(0.01mol/l)，振荡4h后离心。 弃上清液，沉淀用2ml去离子水离心清洗。
38.2)将步骤1)得到的产物中在1mlpipes溶液中重悬，加入10mgaam、 25mgnnmba振荡使其溶解。然后加入1.6mg过硫酸钾，室温下振荡6h。振 荡后溶液离心后弃上清液，用2ml去离子水离心清洗。沉淀加入2ml0.5mol/l 的乙酸溶液，室温下振荡3h。振荡后溶液离心后弃上清液，用2ml去离子水 离心清洗。将沉淀置于烘箱干燥，得到待负载至电极的材料(mip)。
39.3)将市售的5mm玻碳电极分别经1mm、0.5mm和0.2mm的氧化铝粉末 抛光，浸入10ml去离子水清洗电极，涂覆10ulnafion溶液(质量浓度为1％， 涂覆量为0.5ul/mm2)。将步骤2)制备的mip0.5mg加入1ml去离子水，超 声10min得到稳定悬浊液，取5ulmip分散液滴涂在打磨好的电极上(涂覆量 为0.3ul/mm2)，室温晾干，在pbs中浸泡10min，去离子水清洗后干燥，得到 新冠病毒衣壳蛋白电化学传感器。
40.4)测定未知样品中新冠病毒的浓度：配制不同浓度的新冠病毒溶液，终浓 度分别为1ng/l、10ng/l、100ng/l、1μg/l、10ug/l，将制备的电化学传感 器置于上述新冠病毒溶液1min，随后取出清洗，应用电化学工作站中的dpv 方法读取峰值电流，建立新冠病毒蛋白浓度与信号之间的标准曲线。另外将新 冠病毒电化学传感器置于未知浓度的新冠病毒溶液中，根据测得的峰值电流和 上述标准曲线得出新冠病毒的浓度。另外将浓度与标准方法(bca试剂盒)对 比，确定该方法测定的准确率。
41.5)新冠病毒电化学传感器的再生：配制新冠病毒溶液使其终浓度为10ng/l， 将制备的电化学传感器置于上述新冠病毒溶液1min，随后取出清洗，应用电化 学工作站中的dpv方法读取峰值电流。将上述电化学传感器置于0.1mol/l碱 性次氯酸钠溶液中反应5min，取出清洗后置于10ng/l的新冠病毒衣1min，再 次测定峰值电流。
42.该新冠病毒电化学传感器中材料的涂覆厚度为0.3mm，负载的功能材料的 粒径为30nm；该新冠病毒电化学传感器测定新冠病毒的标准曲线见图6，标准 曲线方程为y(ua)＝19.1+0.082x(ug/l)，对未知样本新冠病毒检测的浓度为7.3 ug/l，标准方法的检测浓度为8.5mg/l，因此该传感器的检测的准确率为86％。 该新冠病毒电化学传感器再生后对新冠病毒仍具有电化学响应(图7)，检测准 确率达93％。
43.实施例3：
44.1)取20mg市售羧基化碳纳米管(cnts
‑
cooh)置于5ml离心管加入2ml 去离子水超声分散，加入1ml含nhs(1.7mg)和edac(1mg)的混合溶液 振荡，随后离心弃上清液，用3ml去离子水离心清洗。清洗后的沉淀加入含0.2 mg新冠病毒s蛋白的pipes缓冲溶液(0.1mol/l)，振荡4h后离心。弃上清液， 沉淀用2ml去离子水离心清洗。
45.2)将步骤1)得到的产物中在1mlpipes溶液中重悬，加入10mgaam、 20mgnnmba振荡使其溶解。然后加入1.35mg过硫酸钾，室温下振荡4h。 振荡后溶液离心后弃上清液，用3ml去离子水离心清洗。沉淀加入2ml2mol/l 的草酸溶液，室温下振荡8h。振荡后溶液离心后弃上清液，用2ml去离子水 离心清洗。将沉淀置于烘箱干燥，得到待负载至电极的材料(mip)。
46.3)将市售的8mm玻碳电极分别经3mm、0.6mm和0.3mm的氧化铝粉末 抛光，浸入10ml去离子水清洗电极，涂覆20ulnafion溶液(质量浓度为0.1％， 涂覆量为0.4ul/mm2)。将步骤2)制备的mip0.1mg加入1ml去离子水，超 声2min得到稳定悬浊液，取20ulmip分散液滴涂在打磨好的电极上(涂覆量 为0.4ul/mm2)，室温晾干，在pbs中浸泡30min，去离子水清洗后干燥，得到 新冠病毒衣壳蛋白电化学传感器。
47.4)测定未知样品中新冠病毒的浓度：配制不同浓度的新冠病毒溶液，终浓 度分别为1ng/l、10ng/l、100ng/l、1μg/l、10ug/l，将制备的电化学传感 器置于上述新冠病毒溶液30min，随后取出清洗，应用电化学工作站中的dpv 方法读取峰值电流，建立新冠病毒蛋白浓度与信号之间的标准曲线。另外将新 冠病毒电化学传感器置于未知浓度的新冠病毒溶液中，根据测得的峰值电流和 上述标准曲线得出新冠病毒的浓度。另外将浓度与标准方法(bca试剂盒)对 比，确定该方法测定的准确率。
48.5)新冠病毒电化学传感器的再生：配制新冠病毒溶液使其终浓度为100μ g/l，将制备的电化学传感器置于上述新冠病毒溶液30min，随后取出清洗，应 用电化学工作站中的dpv方法读取峰值电流。将上述电化学传感器置于0.5 mol/l碱性次氯酸钾液中反应60min，取出清洗后置于100μg/l的新冠病毒衣 30min，再次测定峰值电流。
49.该新冠病毒电化学传感器中材料的涂覆厚度为0.4mm，负载的功能材料的 粒径为20nm；该新冠病毒电化学传感器测定新冠病毒的标准曲线方程为y (ua)＝16.9+0.095x(ug/l)，对未知样本新冠病毒检测的浓度为8.5ug/l，标准方 法的检测浓度为10.2mg/l，因此该传感器的检测的准确率为84％。该新冠病毒 电化学传感器再生后对新冠病毒仍具有电化学响应，检测准确率达89％。
50.实施例4：
51.1)取15mg市售羧基化碳纳米管(cnts
‑
cooh)置于5ml离心管加入0.75 ml去离子水超声分散，加入1ml含nhs(1.3mg)和edac(0.75mg)的混 合溶液振荡，随后离心弃上清液，用2ml去离子水离心清洗。清洗后的沉淀加 入含0.3mg新冠病毒衣壳蛋白的pbs缓冲溶液(0.05mol/l)，振荡4h后离心。 弃上清液，沉淀用2ml去离子水离心清洗。
52.2)将步骤1)得到的产物中在1mlpipes溶液中重悬，加入15mgaam、 30mgnnmba振荡使其溶解。然后加入2mg过硫酸钾，室温下振荡5h。振荡 后溶液离心后弃上清液，用2ml去离子水离心清洗。沉淀加入2ml1mol/l 的草酸溶液，室温下振荡6h。振荡后溶液离心后弃上清液，用2ml去离子水 离心清洗。将沉淀置于烘箱干燥，得到待负载至电极的材料(mip)。
53.3)将市售的3mm玻碳电极分别经3mm、0.6mm和0.3mm的氧化铝粉末 抛光，浸入10ml
去离子水清洗电极，涂覆5ulnafion溶液(质量浓度为1％， 涂覆量为0.7ul/mm2)。将步骤2)制备的mip1mg加入1ml去离子水，超声 20min得到稳定悬浊液，取1ulmip分散液滴涂在打磨好的电极上(涂覆量为 0.14ul/mm2)，室温晾干，在pbs中浸泡20min，去离子水清洗后干燥，得到 新冠病毒衣壳蛋白电化学传感器。
54.4)测定未知样品中新冠病毒的浓度：配制不同浓度的新冠病毒溶液，终浓 度分别为1ng/l、10ng/l、100ng/l、1μg/l、10ug/l，将制备的电化学传感 器置于上述新冠病毒溶液20min，随后取出清洗，应用电化学工作站中的dpv 方法读取峰值电流，建立新冠病毒蛋白浓度与信号之间的标准曲线。另外将新 冠病毒电化学传感器置于未知浓度的新冠病毒溶液中，根据测得的峰值电流和 上述标准曲线得出新冠病毒的浓度。另外将浓度与标准方法(bca试剂盒)对 比，确定该方法测定的准确率。
55.5)新冠病毒电化学传感器的再生：配制新冠病毒溶液使其终浓度为10μg/l，将制备的电化学传感器置于上述新冠病毒溶液20min，随后取出清洗，应 用电化学工作站中的dpv方法读取峰值电流。将上述电化学传感器置于0.3 mol/l碱性次氯酸钾溶液中反应30min，取出清洗后置于10μg/l的新冠病毒 衣20min，再次测定峰值电流。
56.该新冠病毒电化学传感器中材料的涂覆厚度为0.14mm，负载的功能材料的 粒径为10nm；该新冠病毒电化学传感器测定新冠病毒的标准曲线方程为y (ua)＝17.5+0.09x(ug/l)，对未知样本新冠病毒检测的浓度为9.5ug/l，标准方法 的检测浓度为10.9mg/l，因此该传感器的检测的准确率为87％。该新冠病毒电 化学传感器再生后对新冠病毒仍具有电化学响应，检测准确率达90％。