一种油乳剂灭活疫苗的细菌内毒素检测方法与流程

1.本发明属于油乳剂灭活疫苗检测领域，具体涉及一种油乳剂灭活疫苗的细菌内毒素检测方法。


背景技术：

2.热原是指临床上能引起哺乳动物发热反应的物质，细菌内毒素是热原的一种，由革兰氏阴性菌产生一种可滤过的、热稳定的代谢副产物，是革兰氏阴性菌细胞壁的产物，是高分子量脂多糖(lps)的复合物。
3.细菌在生活状态时不释放细菌内毒素，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性。内毒素大量进入血液就会引起发热反应(热原反应)。
4.在机体内，细菌内毒素可激活单核/巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞及补体系统，先后诱导产生大量肿瘤坏死因子、白介素等细胞因子，引起内皮细胞的损伤和屏障功能的改变，导致全身性炎症反应综合征和脓毒症发生；严重者可导致低血压、中毒性休克、弥漫性血管内凝血、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭甚至死亡。因此，细菌内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原，在gmp条件下控制细菌内毒素污染就等于控制热原污染。
5.目前细菌内毒素检查法主要包含有凝胶法和光度法。凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。光度法又分为动态法和终点法，其中动态法分为动态浊度法和动态显色法，终点法分为终点浊度法和终点显色法。
6.但因油乳剂灭活疫苗检测细菌内毒素需先进行破乳，使其油水分离后检测水相中的细菌内毒素含量。但申请人发现，直接取澄清水相检测细菌内毒素会导致检测结果与实际结果存在偏差。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种油乳剂灭活疫苗的细菌内毒素检测方法，能够准确的检测疫苗中的细菌内毒素含量；从而弥补现有技术的不足。
8.本发明所提供的油乳剂灭活疫苗的细菌内毒素检测方法，是将待检测的疫苗样品加入破乳剂后，振荡后离心；再将下层水相和沉淀重悬后，取重悬的水相溶液进行内毒素含量检测；
9.所述的破乳剂，作为实施例的具体记载，为含有20％吐温
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80的乙醇溶液；
10.所述的含有20％吐温
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80的乙醇溶液与待检测的疫苗样品的体积比，优选为2:1；
11.所述的离心，是在3000rpm离心15分钟；
12.本发明的方法，是在动态试管检测仪中检测内毒素的含量。
13.本发明的方法，一种具体的操作步骤如下：
14.1)向无热原的15ml玻璃离心管中加入待检测的疫苗样品和破乳剂，用1800rpm的旋涡振荡器剧烈震荡1分钟，然后将离心管置于3000rpm的台式离心机中离心15分钟；
15.2)将步骤1)中破乳后的疫苗用除热原的枪头穿过上层油将下层水相吹打重悬，吸取重悬均匀的水相进行适当倍数稀释，加入动态试管检测仪中进行检测；
16.3)通过动态试管检测仪的数据分析系统得出疫苗中细菌内毒素含量。
17.本发明的方法通过将沉淀重悬后再检测水相中细菌内毒素的含量，从而使检测的结果与疫苗中真实的细菌内毒素含量值更接近；从而有效的解决了现有技术中检测疫苗成品内毒素含量准确率不高的问题。
具体实施方式
18.油乳剂灭活疫苗中的细菌内毒素能使动物发生发热等副反应，严重的甚至造成动物死亡，因此对油乳剂灭活疫苗的细菌内毒素进行检测是非常有必要的，但是截止目前为止没有一种能准确检测出油乳剂灭活疫苗细菌内毒素的方法。在现有技术中，采用破乳剂将疫苗破乳后，直接取澄清水相检测细菌内毒素，导致测定的疫苗成品的内毒素含量与检测的半成品的细菌内毒素含量不一致。
19.而本发明使用含有20％吐温
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80的乙醇溶液作为破乳剂，将破乳剂与疫苗按比例震荡混匀，通过离心使破乳后的疫苗油水分离；并且离心后将底部的沉淀与水相溶液重悬均匀后，再进行检测；从而能够测出真实的细菌内毒素含量。
20.本发明采用破乳剂将疫苗破乳，将水相中的沉淀重悬，采用光度法——动态浊度法，检测水相中细菌内毒素含量，与半成品的细菌内毒素含量一致。
21.对本发明方法的所使用的仪器、试剂和方法进行如下的记载：
22.1、主要仪器
23.动态试管检测仪，型号：lkl064
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03
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045，生产厂家：lab kinetics,llc；漩涡振荡器，型号：ms3，生产厂家：biocote；台式离心机，型号：l600，生产厂家：长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；剪切机，型号：t25，生产厂家：ika。
24.2、试剂
25.细菌内毒素工作标准品，效价：10eu/支，湛江安度斯生物有限公司；鲎试剂，规格：10～0.03eu/ml，湛江安度斯生物有限公司；细菌内毒素检查用水，规格：50ml/瓶，湛江安度斯生物有限公司。
26.下面结合实施例对本发明的细菌内毒素检验方法过程进行详细的描述。
27.实施例1：检测用于制备油乳剂灭活疫苗的细菌中的内毒素含量
28.(1)注射用白油样品细菌内毒素含量检测
29.取2ml道达尔注射用白油(批号：1148790014317)，加入2ml细菌内毒素检查用水，1400rpm旋涡振荡1分钟，取下层水相按动态浊度法进行检测，结果表明检测用水中细菌内毒素含量＜0.063eu/ml。
30.(2)4种灭活病毒的鸡胚尿囊液样品细菌内毒素含量检测
31.将4种尿囊液分别用细菌内毒素检查用水稀释100倍，按动态浊度法进行检测，细菌内毒素含量如下表1所示：
32.表1：4种尿囊液细菌内毒素检测结果表
33.序号尿囊液病毒种类细菌内毒素检测结果(eu/ml)1h7n9 h7
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re3株25.514
2h5n1 re
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11株13.5723h5n1 re
‑
12株80.9354h5n1 re
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11株6.723
34.实施例2：检测油乳剂灭活疫苗的细菌内毒素含量
35.(1)油乳剂灭活疫苗的制备
36.将上述4种尿囊液按照2:1:2:1的比例混合制成水相，取水相300ml待用；取450ml道达尔注射用白油(批号：1148790014317)作为油相；先将油相倒入烧杯中，将剪切机转速调至8000rpm，再缓慢倒入尿囊液，倒完后再将剪切机转速调至12000rpm，用手将烧杯逆时针缓慢摇动，剪切3.5分钟既得乳化后疫苗。
37.(2)油乳剂灭活疫苗的细菌内毒素含量检测
38.向无热原的15ml玻璃离心管中分别加入待检测的疫苗样品2ml和4ml 20％吐温80乙醇溶液，用1800rpm的旋涡振荡器剧烈震荡1分钟，然后将离心管置于3000rpm的台式离心机中离心15分钟；
39.取油水分离后水相中澄清液体，按常规的动态浊度法进行检测，细菌内毒素含量＜3.750eu/ml；
40.采用本发明的方法，将破乳后的疫苗用除热原的枪头穿过上层油相将下层水相吹打重悬，将重悬均匀的水相按动态浊度法进行检测，细菌内毒素含量为38.872eu/ml。
41.(3)检测结果如表2所示。
42.表2：制备的油乳剂灭活疫苗的细菌内毒素含量检测表
[0043][0044][0045]
总结如下：由于4种尿囊液按照2:1:2:1比例混合，混合后的尿囊液的细菌内毒素含量为38.866eu/ml，而白油中细菌内毒素含量可以忽略，故疫苗理论上细菌内毒素含量应为38.866eu/ml；
[0046]
按已有方法检测破乳后澄清水相的细菌内毒素含量＜3.750eu/ml；
[0047]
按本发明方法将水相中沉淀重悬后水相中细菌内毒素含量为38.872eu/ml，实测值与理论值基本一致，因此本发明方法检测出疫苗中细菌内毒素含量更准确。