一种快速检测子痫前期的免疫层析检测卡及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种快速检测子痫前期的免疫层析检测卡及其制备方法与应用。


背景技术：

2.子痫前期(preeclampsia)指妊娠20周以后，出现血压升高、蛋白尿、头痛、眼花、恶心、呕吐、上腹不适等症状，属于妊娠期特发性高血压。子痫(eclampsia)是由子痫前期发展成更为严重的症状，引起抽搐发作或昏迷，可导致严重的母儿并发症，危及到母儿的生命。目前，子痫前期缺乏有效的诊断和治疗策略，除终止妊娠外，没有其他有效的治疗方法，现有的治疗是为了控制病情，争取延长孕周，因此及时的诊断出子痫前期十分重要。
3.先兆子痫有两种主要类型：在怀孕34周之前诊断出的早发性先兆子痫和34周以后诊断出的晚发性先兆子痫。绝大多数的筛查和监测策略集中于早期发作的先兆子痫，这只占所有先兆子痫病例的10
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15％，而晚期先兆子痫在很大程度上被忽视了。
4.目前，子痫前期的临床诊断需要满足以下三个依据：(1)量血压(收缩压/舒张压≥140/90mmhg)；(2)测蛋白尿(≥0.3g/24h)；(3)经有经验的医生通过子痫前期的相关症状对患者做出推测来进行筛查。然而，这种诊断方法的样本采集过程比较繁琐，耗时长。目前还没有一个可以对子痫前期进行定性和定量的指标来对患者进行筛查。因此，临床上急需有效的、快速的子痫前期筛查的标志物和相关的检测工具。
5.fkbpl是肽基脯氨酰顺反异构酶，属于免疫亲和蛋白组，是调控血管生成的关键蛋白，具有强大的抗血管生成活性，在发育和病理血管生成以及干细胞分化中都发挥着重要作用。fkbpl对血管生成的破坏依赖于与细胞表面受体cd44的结合。有研究已经确定fkbpl是子痫前期的预后生物标志物。健康妊娠女性和患有子痫前期的妊娠女性中的fkbpl和cd44浓度存在一定的差异。因此，基于这一研究基础将cd44和fkbpl作为子痫前期的诊断与预测指标。目前尚未发现以血清中的cd44和fkbpl浓度为检测指标的子痫前期免疫层析检测卡的相关报道。


技术实现要素：

6.为解决上述问题，本发明提供了一种快速检测子痫前期的免疫层析检测卡及其制备方法与应用。本发明以cd44和fkbpl作为子痫前期的生物标记物，设计了一种免疫层析检测卡，可以同时对血清中的cd44和fkbpl浓度进行定量检测，以实现对子痫前期患者进行快速检测和筛查的目的。
7.根据本发明的一个方面，提供一种快速检测子痫前期的免疫层析检测卡，该检测卡包括试纸条，试纸条包括样品垫、结合垫和反应膜，反应膜上设有第一检测线、第二检测线和质控线，第一检测线上包被有抗fkbpl第一单克隆抗体、第二检测线上包被有抗cd44第一单克隆抗体或第一检测线上包被有抗cd44第一单克隆抗体、第二检测线上包被有抗
fkbpl第一单克隆抗体，质控线上包被有第一阴性对照抗体；结合垫上包被有上转换发光纳米颗粒
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抗cd44第二单克隆抗体、上转换发光纳米颗粒
‑
抗fkbpl第二单克隆抗体、上转换发光纳米颗粒
‑
第二阴性对照抗体。
8.优选地，样品垫和结合垫均由玻璃纤维素膜制备而成。
9.优选地，反应膜由硝酸纤维素膜制备而成。
10.本发明的检测卡分别设置两条检测线对cd44和fkbpl进行检测，能够同时定量地检测血清中的cd44和fkbpl浓度，并可通过计算得出cd44与fkbpl的浓度比值，其可能成为预测子痫前期的标志物。本发明中涉及的抗cd44第一单克隆抗体、抗cd44第二单克隆抗体均为抗cd44的单克隆抗体，均能与cd44进行结合；抗fkbpl第一单克隆抗体、抗fkbpl第二单克隆抗体均为抗fkbpl的单克隆抗体，均能与fkbpl进行结合。把液态的待测样品滴加在样品垫上，待测样品能够由样品垫向结合垫层析；随后待测样品向前层析到结合垫上，当待测样品中含有cd44和fkbpl时，cd44和fkbpl能够分别与结合垫上包被的上转换发光纳米颗粒
‑
抗cd44第二单克隆抗体、上转换发光纳米颗粒
‑
抗fkbpl第二单克隆抗体结合形成上转换发光纳米颗粒
‑
抗cd44第二单克隆抗体
‑
cd44、上转换发光纳米颗粒
‑
抗fkbpl第二单克隆抗体
‑
fkbpl；继续由结合垫向反应膜层析，当上转换发光纳米颗粒
‑
抗fkbpl第二单克隆抗体
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fkbpl和上转换发光纳米颗粒
‑
抗cd44第二单克隆抗体
‑
cd44经过两条检测线时，能够在相应的包被有能与fkbpl、cd44进行结合的单克隆抗体的检测线上固定下来，形成上转换发光纳米颗粒
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抗fkbpl第二单克隆抗体
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fkbpl
‑
抗fkbpl第一单克隆抗体、上转换发光纳米颗粒
‑
抗cd44第二单克隆抗体
‑
cd44
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抗cd44第一单克隆抗体的双抗体夹心结构。而结合垫上包被的上转换发光纳米颗粒
‑
第二阴性对照抗体和质控线上包被的第一阴性对照抗体的作用原理与上述作用原理相同，其作用在于对检测过程的正确性和免疫层析检测卡是否失效进行监控。
11.本发明采用的是上转换发光技术，即以稀土金属元素构成的上转换发光纳米颗粒作为标记物的免疫层析技术。首先，本发明采用的上转换发光纳米颗粒，为纳米材料，其具有优越的信号放大作用，能够达到良好的灵敏度和特异度。其次，上转换发光纳米颗粒在红外激发光下可发射出不同波长的可见光，其独特的上转换发光现象，使得以其作为标记物的检测过程排除了待检测生物样品自发荧光对检测结果造成干扰的可能，同时具有抗光漂白能力强、毒性低、背景荧光干扰小、发光特性稳定等优点，在免疫检测中可提高信噪比，从而提高了检测的灵敏度和稳定性，尤其适用于复杂样本的检测。此外，上转换发光纳米颗粒在足量的激发光照射下可以发出更强的发射光，能够进一步地提高检测的灵敏度。上转换发光纳米颗粒其自身的特点使得以其作为标记物的免疫层析检测可与仪器相结合，实现对被检测物高灵敏度的定量检测。并且，上转换发光纳米颗粒具有多种特征光谱(包括激发光谱和发射光谱)，使得基于上转换发光技术的免疫层析检测可进行灵敏度极高的多重分析，即一次性对生物样品的多目标被检测物进行检测。
12.优选地，上转换发光纳米颗粒的粒径为25
‑
200nm。
13.优选地，上转换发光纳米颗粒的粒径为50nm。
14.粒径小于10nm的上转换发光纳米颗粒的荧光效率较低，本方案选用粒径适中的纳米颗粒，能够减少空间位阻，避免其难和特异性抗体结合，同时在一定程度上能够提高上转换发光纳米颗粒的荧光效率，进而提高检测的灵敏度和稳定性。具体体现为：本发明的免疫
层析检测卡能够对浓度在0.1ng/ml以上的cd44和fkbpl进行检测，使得处于低浓度水平的fkbpl也能够被检测到，一定程度上避免了出现假阴性，该免疫层析检测卡对cd44和fkbpl的阳性检出率达到100％。
15.优选地，上转换发光纳米颗粒是经过羧基化修饰得到的。上转换发光纳米颗粒常带有疏水性基团，致使其难溶于水，表面效应对其性质影响很大，其表面缺陷可能会降低纳米颗粒的荧光性。在本方案中使用的上转换发光纳米颗粒是经过羧基化修饰得到的，能够提高纳米颗粒的稳定性，使其发光性能更加稳定，提高了免疫检测的精确度。
16.优选地，上转换发光纳米颗粒
‑
抗cd44第二单克隆抗体、上转换发光纳米颗粒
‑
抗fkbpl第二单克隆抗体、上转换发光纳米颗粒
‑
第二阴性对照抗体分别由上转换发光纳米颗粒与抗cd44第二单克隆抗体、抗fkbpl第二单克隆抗体、第二阴性对照抗体通过共价方式交联制备得到。上转换发光纳米颗粒通过共价方式与生物活性分子进行交联，在保证检测灵敏度的前提下提高了系统的可靠性和稳定性。
17.优选地，上转换发光纳米颗粒
‑
抗cd44第二单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：利用上转换发光纳米颗粒和pb缓冲液(磷酸缓冲液)制备悬浊液，向其中依次加入nhs(n
‑
羟基琥珀酰亚胺)和edc(1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐)进行反应；随后离心去除上清，加入pb缓冲液混匀；再向体系中加入抗cd44第二单克隆抗体进行反应，反应结束后加入bsa封闭，离心洗涤，得到上转换发光纳米颗粒
‑
抗cd44第二单克隆抗体；
18.上转换发光纳米颗粒
‑
抗fkbpl第二单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：利用上转换发光纳米颗粒和pb缓冲液制备悬浊液，向其中依次加入nhs和edc进行反应；随后离心去除上清，加入pb缓冲液混匀；再向体系中加入抗fkbpl第二单克隆抗体进行反应，反应结束后加入bsa封闭，离心洗涤，得到上转换发光纳米颗粒
‑
抗fkbpl第二单克隆抗体；
19.上转换发光纳米颗粒
‑
第二阴性对照抗体的制备方法包括以下步骤：利用上转换发光纳米颗粒和pb缓冲液制备悬浊液，向其中依次加入nhs和edc进行反应；随后离心去除上清，加入pb缓冲液混匀；再向体系中加入第二阴性对照抗体进行反应，反应结束后加入bsa封闭，离心洗涤，得到上转换发光纳米颗粒
‑
第二阴性对照抗体。
20.优选地，nhs与上转换发光纳米颗粒的质量比为1:2
‑
5，edc与上转换发光纳米颗粒的质量比为1:2
‑
5。
21.优选地，抗cd44第二单克隆抗体、抗fkbpl第二单克隆抗体、第二阴性对照抗体与上转换发光纳米颗粒的质量比均为1:100
‑
1000。
22.优选地，pb缓冲液的ph值为7.2，浓度为20mm。
23.优选地，上述试纸条还包括吸水垫和粘性底板，样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫依次部分重叠后粘贴在粘性底板表面。
24.优选地，试纸条的宽度为3
‑
5mm。
25.优选地，试纸条的宽度为3.5mm。
26.优选地，样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫依次部分重叠时，各重叠部分的间距均为1
‑
2mm。
27.优选地，样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫依次部分重叠后粘贴在粘性底板表面，其中样品垫与结合垫重叠处样品垫位于结合垫上方，结合垫和反应膜重叠处结合垫位于反应膜上方，反应膜和吸水垫重叠处吸水垫位于反应膜上方。
28.根据本发明的第二个方面，提供一种同时定量检测cd44和fkbpl浓度的方法，具体为：把待测样品滴加在快速检测子痫前期的免疫层析检测卡上，利用激光二极管在半球透镜的作用下对所述检测卡进行照射，通过信号采集器对信号进行采集。
29.优选地，激光二极管为790nm、980nm或1550nm激光二极管。
30.优选地，激光二极管为980nm激光二极管，为近红外激发光。
31.优选地，信号采集器采集的信号为540nm绿光信号。免疫层析检测卡对cd44和fkbpl进行检测时，在980nm激光二极管照射下，可以发出肉眼可见的绿色光(540nm)，使得检测结果便于观察。
32.优选地，激光二极管在半球透镜的作用下的能量密度＞0.001mw/cm3。
33.本发明提供的快速检测子痫前期的免疫层析检测卡，可以筛查孕妇是否患有子痫前期：若受检者怀孕20周时，血清中cd44与fkbpl的浓度比值显著高于怀孕15周时的比值，且显著高于正常孕妇血清中cd44与fkbpl的浓度比值，则确定待检者患子痫前期的风险大；反之，则患子痫前期的风险小。
34.本发明具有以下有益效果：
35.1.本发明为子痫前期的检测提供了一种采用新检测指标(即cd44和fkbpl)的免疫检测层析卡。
36.2.本发明基于上转换发光免疫层析技术，利用上转换发光纳米颗粒独特的上转换发光特性，把上转换发光纳米颗粒作为标记物，使检测无本底干扰，灵敏度高，发光性能稳定，不易淬灭，结合配套仪器能同时定量检测血清中的cd44和fkbpl浓度。
37.3.使用本发明的免疫层析检测卡对cd44和fkbpl浓度进行检测时，最低检测浓度为0.1ng/ml，灵敏度高。
38.4.本发明的免疫检测层析卡使用操作简单，检测样品时间短，与临床上通常使用的检测方法相比，检测速度大幅度提高。
39.5.本发明的免疫层析检测卡结构简单，易于加工制作，生产成本低，便于工业化生产。
40.6.cd44和fkbpl可能成为子痫前期新的标记物，cd44与fkbpl的浓度比值可能对用于诊断和评估妊娠早期和晚期出现先兆子痫的风险具有重要意义。
附图说明
41.图1为本发明的快速检测子痫前期的单孔免疫层析检测卡的结构示意图。
42.附图标记为：1样品垫、2结合垫、3第一检测线、4第二检测线、5质控线、6反应膜、7吸水垫、8粘性底板。
43.图2为本发明的快速检测子痫前期的双孔免疫层析检测卡的结构示意图。
44.附图标记为：c质控线、t检测线、s加样孔。
具体实施方式
45.下面结合具体实施方式对本发明提供的技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施
例，都属于本发明保护的范围。
46.实施例1
47.一种快速检测子痫前期的单孔免疫层析检测卡，制备方法具体包括以下步骤：
48.(1)制备上转换发光纳米颗粒(ucnps)
‑
抗体
49.将表面经过羧基化修饰的ucnps加入到ph为7.2、浓度为20mm的pb缓冲液中，配制成浓度为1mg/ml的悬浊液；向其中依次加入50mg/ml的nhs(nhs：ucnps质量比为1:4)和50mg/ml的edc(edc：ucnps质量比为1:4)，于4～30℃下反应30min；离心去除多余的nhs和edc，然后加入等量0.02mol/l的pb缓冲液，将悬浊液分散均匀；再向其中加入抗cd44第二单克隆抗体，于4～30℃反应2h，加入的抗cd44第二单克隆抗体与ucnps的质量比为1:100；反应完成后加入终浓度为1％的bsa封闭1.5h；反应完成后在4℃离心洗涤1次，得到上转换发光纳米颗粒
‑
抗cd44第二单克隆抗体，保存于0.02m的pb缓冲液中，放置于2～8℃备用；
50.根据上述制备方法，制备上转换发光纳米颗粒
‑
抗fkbpl第二单克隆抗体和上转换发光纳米颗粒
‑
第二阴性对照抗体；
51.(2)制备样品垫
52.选用玻璃纤维素膜作为样品垫材料，剪切成1.5cm*30cm规格的条带，将其放入ph7.2、浓度为0.02m、含0.1％wt吐温
‑
20的pb缓冲液中浸泡10min，浸泡完成后于37℃烘干，得到样品垫1；
53.(3)制备结合垫
54.选用玻璃纤维素膜作为结合垫材料，将其剪切成1cm*30cm规格的条带，用结合垫处理液浸泡10min，其中，结合垫处理液的成分含有0.1％bsa、2％蔗糖、0.1％吐温
‑
20，然后于37℃烘干，将步骤(1)制备得到的上转换发光纳米颗粒
‑
抗cd44第二单克隆抗体、上转换发光纳米颗粒
‑
抗fkbpl第二单克隆抗体、上转换发光纳米颗粒
‑
第二阴性对照抗体利用喷金仪按2:2:1的比例混合后均匀喷涂在玻璃纤维素膜上并于37℃烘干，得到结合垫2；
55.(4)制备反应膜
56.将硝酸纤维素膜(nc膜)剪切成2.5cm*30cm规格的条带，并将所得条带粘贴于粘性底板8中间，用划膜仪在nc膜不同位置上分别划上抗fkbpl第一单克隆抗体、抗cd44第一单克隆抗体、第一阴性对照抗体作为第一检测线3、第二检测线4、质控线5，于37℃烘干，得到反应膜6；
57.(5)组装免疫层析试纸条
58.将样品垫1、结合垫2和吸水垫7分别粘贴在步骤(4)制备的反应膜6的两侧，保证各组分垫间距1.5mm交错层叠即可，然后裁切成3.5mm宽的试纸条并安装于定制的卡壳中，得到如图1所示的快速检测子痫前期的单孔免疫层析检测卡。
59.实施例2
60.一种快速检测子痫前期的双孔免疫层析检测卡，该双孔免疫层析检测卡包括试纸条，试纸条包括第一试纸条和第二试纸条。
61.第一试纸条的制备方法具体包括以下步骤：
62.(1)制备上转换发光纳米颗粒(ucnps)
‑
抗体
63.将表面经过羧基化修饰的ucnps加入到ph为7.2、浓度为20mm的pb缓冲液中，配制成浓度为1mg/ml的悬浊液；向其中依次加入50mg/ml的nhs(nhs：ucnps质量比为1:4)和
50mg/ml的edc(edc：ucnps质量比为1:4)，于4～30℃下反应30min；离心去除多余的nhs和edc，然后加入等量0.02mol/l的pb缓冲液，将悬浊液分散均匀；再向其中加入抗cd44第二单克隆抗体，于4～30℃反应2h，加入的抗cd44第二单克隆抗体与ucnps的质量比为1:100；反应完成后加入终浓度为1％的bsa封闭1.5h；反应完成后在4℃离心洗涤1次，得到上转换发光纳米颗粒
‑
抗cd44第二单克隆抗体，保存于0.02m的pb缓冲液中，放置于2～8℃备用；
64.根据上述制备方法，制备上转换发光纳米颗粒
‑
第二阴性对照抗体；
65.(2)制备样品垫
66.选用玻璃纤维素膜作为样品垫材料，剪切成1.5cm*30cm规格的条带，将其放入ph7.2、浓度为0.02m、含0.1％wt吐温
‑
20的pb缓冲液中浸泡10min，浸泡完成后于37℃烘干，得到样品垫；
67.(3)制备结合垫
68.选用玻璃纤维素膜作为结合垫材料，将其剪切成1cm*30cm规格的条带，用结合垫处理液浸泡10min，其中，结合垫处理液的成分含有0.1％bsa、2％蔗糖、0.1％吐温
‑
20，然后于37℃烘干，将步骤(1)制备得到的上转换发光纳米颗粒
‑
抗cd44第二单克隆抗体、上转换发光纳米颗粒
‑
第二阴性对照抗体利用喷金仪按2:1的比例混合后均匀喷涂在玻璃纤维素膜上并于37℃烘干，得到结合垫；
69.(4)制备反应膜
70.将硝酸纤维素膜(nc膜)剪切成2.5cm*30cm规格的条带，并将所得条带粘贴于粘性底板中间，用划膜仪在nc膜的不同位置上分别划上抗cd44第一单克隆抗体、第一阴性对照抗体作为检测线(t)、质控线(c)，于37℃烘干，得到反应膜；
71.(5)组装免疫层析试纸条
72.将样品垫、结合垫和吸水垫分别粘贴在步骤(4)制备的反应膜的两侧，保证各组分垫间距1.5mm交错层叠即可，然后裁切成3.5mm宽的试纸条，得到第一试纸条；
73.第二试纸条的制备方法具体包括以下步骤：
74.(1)制备上转换发光纳米颗粒(ucnps)
‑
抗体
75.将表面经过羧基化修饰的ucnps加入到ph为7.2、浓度为20mm的pb缓冲液中，配制成浓度为1mg/ml的悬浊液；向其中依次加入50mg/ml的nhs(nhs：ucnps质量比为1:4)和50mg/ml的edc(edc：ucnps质量比为1:4)，于4～30℃下反应30min；离心去除多余的nhs和edc，然后加入等量0.02mol/l的pb缓冲液，将悬浊液分散均匀；再向其中加入抗fkbpl第二单克隆抗体，于4～30℃反应2h，加入的抗fkbpl第二单克隆抗体与ucnps的质量比为1:100；反应完成后加入终浓度为1％的bsa封闭1.5h；反应完成后在4℃离心洗涤1次，得到上转换发光纳米颗粒
‑
抗fkbpl第二单克隆抗体，保存于0.02m的pb缓冲液中，放置于2～8℃备用；
76.根据上述制备方法，制备上转换发光纳米颗粒
‑
第二阴性对照抗体；
77.(2)制备样品垫
78.选用玻璃纤维素膜作为样品垫材料，剪切成1.5cm*30cm规格的条带，将其放入ph7.2、浓度为0.02m、含0.1％wt吐温
‑
20的pb缓冲液中浸泡10min，浸泡完成后于37℃烘干，得到样品垫；
79.(3)制备结合垫
80.选用玻璃纤维素膜作为结合垫材料，将其剪切成1cm*30cm规格的条带，用结合垫
处理液浸泡10min，其中，结合垫处理液的成分含有0.1％bsa、2％蔗糖、0.1％吐温
‑
20，然后于37℃烘干，将步骤(1)制备得到的上转换发光纳米颗粒
‑
抗fkbpl第二单克隆抗体、上转换发光纳米颗粒
‑
第二阴性对照抗体利用喷金仪按2:1的比例混合后均匀喷涂在玻璃纤维素膜上并于37℃烘干，得到样品垫；
81.(4)制备反应膜
82.将硝酸纤维素膜(nc膜)剪切成2.5cm*30cm规格的条带，并将所得条带粘贴于粘性底板中间，用划膜仪在nc膜的不同位置上分别划上抗fkbpl第一单克隆抗体、第一阴性对照抗体作为检测线(t)、质控线(c)，于37℃烘干，得到反应膜；
83.(5)组装免疫层析试纸条
84.将样品垫、结合垫和吸水垫分别粘贴在步骤(4)制备的反应膜的两侧，保证各组分垫间距1.5mm交错层叠即可，然后裁切成3.5mm宽的试纸条，得到第二试纸条；
85.把上述得到的第一试纸条和第二试纸条安装于定制的cd44和fkbpl卡壳中，得到如图2所示的快速检测子痫前期的双孔免疫层析检测卡，其中，双孔免疫层析检测卡的卡壳中含有两个加样孔s，均位于样品垫的上方。
86.对比例1
87.一种定性检测cd44和fkbpl的免疫层析检测卡，制备方法具体包括以下步骤：
88.(1)制备样品垫
89.选用玻璃纤维素膜作为样品垫材料，剪切成1.5cm*30cm规格的条带，将其放入ph7.2、浓度为0.02m、含0.1％wt吐温
‑
20的pb缓冲液中浸泡10min，浸泡完成后于37℃烘干，得到样品垫；
90.(2)制备金标垫
91.①
取氯金酸溶解于去离子水中，形成氯金酸浓度为0.2g/100ml的氯金酸溶液，并加热至溶液沸腾，在搅拌下将浓度为1g/100ml的柠檬酸三钠溶液加入到沸腾的氯金酸溶液中，柠檬酸三钠溶液与氯金酸溶液的体积比为1.4:50，当混合溶液呈现透明的酒红色(6min左右)时停止加热，让其自然冷却至室温后用k2co3溶液调节ph至7.5，即获得胶体金溶液(胶体金颗粒的平均粒径为40nm)；
92.②
以ph＝7.2、浓度为0.02mol/l的磷酸盐缓冲液为溶剂，以抗cd44第二单克隆抗体为溶质，配制浓度为1mg/ml的cd44第二单克隆抗体溶液，取10μl与1ml步骤
①
制备的胶体金溶液混合，当混合均匀后，用锡箔纸将离心管包好，摇床标记30min；然后加入浓度为5g/100ml的牛血清白蛋白溶液20μl并混匀，继续在摇床中标记20min。标记结束后以11000rpm/min离心30min，获得的分离产物即为金标抗cd44第二单克隆抗体，将其溶于50μl金标复溶液中，即获得浓度为0.2mg/ml的金标抗cd44第二单克隆抗体溶液(4℃贮存备用)；其中，金标复溶液是将三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、叠氮钠溶于去离子水中制备而成，三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.02mol/l，牛血清白蛋白的浓度为1g/100ml，叠氮钠的浓度为0.2g/100ml；
93.金标抗fkbpl第二单克隆抗体溶液、金标第二阴性对照抗体溶液的制备方法与上述金标抗cd44第二单克隆抗体溶液的制备方法一样；
94.③
将制作金标垫的玻璃纤维素膜裁成1cm
×
30cm，放置在喷金标机的运行平台上，设定喷量为4μl/cm2，操作喷金标机使其注射泵和管线充满含有金标抗cd44第二单克隆抗
体溶液、金标抗fkbpl第二单克隆抗体溶液、金标第二阴性对照抗体的混合液，质量比为2:2:1，并完成喷金操作，将玻璃纤维素膜用电热恒温干燥箱在37℃干燥12h，即获金标垫。
95.(3)制备反应膜
96.①
以ph＝7.2、浓度为0.02mol/l的磷酸盐缓冲液为溶剂、抗cd44第一克隆抗体为溶质，配制抗cd44第一单克隆抗体浓度为2mg/ml的第二检测线溶液；以ph＝7.2、浓度为0.02mol/l的磷酸盐缓冲液为溶剂、抗fkbpl第一单克隆抗体为溶质，配制成抗fkbpl第一单克隆抗体浓度为2mg/ml的第一检测线溶液；以ph＝7.2、浓度为0.02mol/l的磷酸盐缓冲液为溶剂、第一阴性对照抗体为溶质，配制成第一阴性对照抗体浓度为2mg/ml的质控线溶液；
97.②
将硝酸纤维素膜(nc膜)剪切成2.5cm*30cm规格的条带，并将所得条带粘贴于粘性底板中间，用划膜仪在nc膜的第一检测线、第二检测线、质控线上分别划上第一检测线溶液、第二检测线溶液、质控线溶液，于37℃烘干，得到反应膜；
98.(4)组装免疫层析试纸条
99.将样品垫、结合垫和吸水垫分别粘贴在步骤(3)制备的反应膜的两侧，保证各组分垫间距1.5mm交错层叠即可，然后裁切成3.5mm宽的试纸条并安装于定制的卡壳中，得到定性检测cd44和fkbpl的免疫层析检测卡。
100.测试例
101.1.实验构建方式
102.(1)实验对象和样本
103.实验对象：选取正常孕妇和子痫前期孕妇各30例，上述子痫前期孕妇均由具有15年以上临床经验的妇产科主任医师通过相关症状诊断为子痫前期患者，可信度高。
104.样本：上述正常孕妇和子痫前期孕妇在孕期为15周和20周时，分别进行静脉抽血3
‑
4ml，室温放置30min，在转速2500rpm/min下离心5min后将血清转移至新的ep管，分装后于
‑
80℃保存。
105.(2)cd44和fkbpl的检测
106.利用实施例1
‑
2和对比例1中的免疫层析检测卡分别对上述孕妇的血清样本进行cd44和fkbpl检测。其中，实施例1
‑
2的免疫层析检测卡可以对cd44和fkbpl的浓度进行定量检测，并计算cd44/fkbpl的浓度比值；而对比例1中的免疫层析检测卡则只能对cd44和fkbpl进行定性检测。先前的研究表明，孕妇孕期从15周到20周时，cd44/fkbpl浓度比值逐渐增大，当孕妇孕期为20周时，其cd44/fkbpl浓度比值显著高于孕期15周以及正常孕妇的cd44/fkbpl浓度比值时，则判断该孕妇患有子痫前期。
107.(3)灵敏度测试
108.上述怀孕15周和20周子痫前期孕妇的血清样本中的cd44和fkbpl浓度经过定量后，将剩余血清样本进行精确稀释，得到cd44浓度为0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、120ng/ml的血清样本，以及fkbpl浓度为0.05ng/ml、0.10ng/ml、0.20ng/ml、0.30ng/ml、0.40ng/ml、0.50ng/ml、0.60ng/ml、0.70ng/ml、0.80ng/ml、0.90ng/ml、1.00ng/ml。
109.将上述稀释得到的血清样本分别利用实施例1
‑
2和对比例1的免疫层析检测卡进行多次检测，实验结果取平均值。
110.(4)免疫检测层析卡的使用方法和检测原理
111.①
实施例1
‑
2的免疫层析检测卡的使用方法和检测原理
112.将待测血清样本滴加在样品垫或加样孔上，样品向前层析，移动到结合垫上，其中的cd44、fkbpl分别与结合垫上的上转换发光纳米颗粒
‑
抗cd44第二单克隆抗体、上转换发光纳米颗粒颗粒
‑
抗fkbpl第二单克隆抗体结合形成上转换发光纳米颗粒
‑
抗cd44第二单克隆抗体
‑
cd44、上转换发光纳米颗粒颗粒
‑
抗fkbpl第二单克隆抗体
‑
fkbpl，继续向反应膜层析，在两条相应的检测线上形成上转换发光纳米颗粒
‑
抗cd44第二单克隆抗体
‑
cd44
‑
抗cd44第一单克隆抗体、上转换发光纳米颗粒颗粒
‑
抗fkbpl第二单克隆抗体
‑
fkbpl
‑
抗fkbpl第一单克隆抗体(双抗体夹心结构)，并在相应的检测线上被固定下来。
113.利用980nm激光二极管(近红外激发光)在半球透镜的作用下对上述检测卡进行照射，可以发射出肉眼可见的绿色光(540nm)，通过信号采集器对信号进行采集。若在质控线上能够采集到绿光信号，检测线上无法采集绿光信号，表示血清样本中不含cd44和fkbpl；在质控线和检测线上均能采集到绿光信号，表示血清样本中含有cd44和fkbpl；当质控线上没有检测到绿光信号时，表示免疫层析检测卡失效。并通过信号采集结果得出cd44和fkbpl的具体浓度，并计算出cd44与fkbpl的浓度比值。
114.②
对比例1的免疫层析检测卡的使用方法和检测原理
115.将待测血清样本滴加在样品垫上，样品向前层析，移动到结合垫上，其中的cd44、fkbpl分别与结合垫上的金标抗cd44第二单克隆抗体、金标抗fkbpl第二单克隆抗体结合形成金标抗cd44第二单克隆抗体
‑
cd44、金标抗fkbpl第二单克隆抗体
‑
fkbpl，继续向反应膜层析，在两条相应的检测线上形成金标抗cd44第二单克隆抗体
‑
cd44
‑
抗cd44第一单克隆抗体、金标抗fkbpl第二单克隆抗体
‑
fkbpl
‑
抗fkbpl第一单克隆抗体的双抗体夹心结构，并在相应的检测线上被固定下来。
116.在10
‑
30min内观察反应结果，30min后结果判定无效。仅在质控线出现红色条带，检测线不出现红色条带，表示血清样本中不含cd44和fkbpl；在质控线和检测线均出现红色条带，检测线的条带颜色相对质控线颜色较浅或者条带颜色深浅均一，表示血清样本中含有cd44和fkbpl；当质控线未出现有色条带，表示免疫层析检测卡失效。
117.2.实验结果
118.(1)正常孕妇和子痫前期孕妇的检测结果
119.表1正常孕妇和子痫前期孕妇的检测结果
120.[0121][0122]
注：+表示cd44或fkbpl能够被检测到，检测线显红色；
[0123]
‑
表示cd44或fkbpl不能被检测到，检测线不显色。
[0124]
表1为实验结果的平均值，利用本发明实施例1
‑
2提供的免疫层析检测卡对15周、20周的正常孕妇和子痫前期孕妇的血清样本进行检测，能够定量地检测cd44和fkbpl的浓度，通过cd44/fkbpl浓度比值比较，能够对子痫前期患者进行快速筛查，其诊断结果与具有15年以上临床经验的妇产科主任医师的诊断结果一致，由此可以说明本发明提供免疫层析检测卡对子痫前期的诊断结果十分准确。此外，由表1还可以看出，由于正常孕妇和子痫前期患者血清中fkbpl的浓度较低，利用胶体金作为标志物制得的免疫层析检测卡，仅仅能够检测出高浓度的cd44，无法低浓度的fkbpl进行检测。虽然条带显色有深有浅，但肉眼无法通过颜色的深浅对cd44或fkbpl的含量进行估计，即无法对cd44和fkbpl进行定量，因而无法对cd44与fkbpl的浓度比值进行比较，不能够用于诊断和评估子痫前期。
[0125]
(2)灵敏度结果
[0126]
表2已知浓度的cd44和fkbpl样品检测结果
[0127]
[0128][0129]
注：
‑
表示cd44或fkbpl不能被检测到。
[0130]
由表2的样品检测结果可知，利用本发明实施例1
‑
2的免疫层析检测卡对已知浓度的血清样本进行检测时，检测结果与原浓度基本相同，没有显著性差异，这主要是因为上转换发光纳米颗粒独特的发光特性，并且发光性能稳定，使得检测的灵敏度高、稳定性好，检测结果准确可信。本发明实施例1
‑
2的免疫层析检测卡的最低检测限为0.1ng/ml，当cd44和fkbpl浓度在0.1ng/ml以上时，均能够被检测到。利用本发明提供的免疫层析卡能够更加精确地检测cd44和fkbpl，同时对cd44和处于低浓度水平的fkbpl定量更加准确，这对利用cd44与fkbpl的浓度比值进行子痫前期患者的快速检测和诊断具有极其重要的意义。
[0131]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。