一种油茶花芽的石蜡切片及其制备方法和应用

1.本发明属于石蜡切片技术领域，特别涉及一种石蜡切片及其制备方法和应用，尤其涉及一种油茶花芽的石蜡切片及其制备方法和应用。


背景技术：

2.油茶为(camellia oleifera abel.)山茶科(theaceae)山茶属(camellia)小乔木，原产于中国，与油棕、椰子、油橄榄被称为世界四大木本油料植物。油茶籽油富含不饱和脂肪酸、维生素e和山茶甙等特定生理活性物质，具有极高的食用和医疗保健价值，深受广大消费者的喜爱。
3.植物开花是植物形成经济产量的重要基础，油茶为雌雄同花，因其自交率极低，落花落果严重等问题，导致产量低下。通过对不同时期油茶花芽解剖结构的观察，能够发现油茶花芽生长发育的关键时期，以此为依据采取相应的栽培措施，有助于解决油茶生产上多花少果的问题。同时，油茶花芽的解剖结构研究还可以帮助鉴定种质资源，因此探索有效获得油茶花芽切片的方法在鉴定评价大量油茶种质时有重要的应用价值，有利于缩短油茶种质资源的鉴定周期。
4.石蜡切片是组织学中重要的试验技术之一，用于观察细胞及组织的形态结构，该技术广泛的运用于各学科领域的研究。石蜡切片基本步骤包括取样固定、软化、脱水、透明、浸蜡、包埋、修蜡、切片、展片、烘片、脱蜡、复水、染色、封片和观察等一系列处理，制作步骤较为繁杂，周期长，且每个步骤都很重要，不同组织结构的植物以及植物不同部位的组织所需的处理方法也有所差异。处理方法或操作出现问题都会影响切片质量，常出现材料破碎、切片不完整、蜡带不连续、存在空洞等问题。
5.油茶花芽因其组织结构密实，在脱水、浸蜡、切片等环节都存在困难，处理不当都容易造成切片破碎不完整、组织结构不清晰等问题，不利于观察。目前以油茶花芽为材料开展石蜡切片技术的研究较少，且切片效果不够理想，结构更为完整和清晰的油茶花芽切片尚未见报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种油茶花芽的石蜡切片及其制备方法和应用，利用本发明的方法制备得到的石蜡切片质量高、组织结构清晰完整、效果明显、可操作性强、可重复性高、实用性强；本发明提供的方法可以对不同发育时期的油茶花芽进行石蜡切片，进而观察整个油茶花发育过程。
7.为此，本发明技术方案如下：
8.第一方面，本发明提供一种油茶花芽的石蜡切片制作方法，至少包括以下步骤：
9.(1)取材分割与固定：摘取油茶花芽，剥除萼片，切除油茶花芽部分组织，固定并软化；
10.(2)第一脱水和第一透明处理：将软化的油茶花芽依次采用梯度酒精进行脱水处
理；随后进行透明处理，所述透明剂至少包括正丁醇；
11.第一脱水的方式为依次采用体积浓度为70％、85％、95％的乙醇水溶液和无水乙醇浸泡，更换无水乙醇再浸泡，上述每次浸泡的时间分别为至少1h；
12.(3)浸蜡：将透明油茶花芽先后浸入分析纯正丁醇
‑
石蜡混合液及纯石蜡溶液中浸泡；
13.(4)将浸蜡油茶花芽依次经过包埋、修蜡、切片、粘片、展片和烘片处理；其中，油茶花芽切片蜡带的厚度优选为10
‑
15μm；所用粘片剂为新鲜鸡蛋清与分析纯甘油按体积比1：1配置；展片时间为至少30min，烘片时间为至少12h；
14.(5)随后进行脱蜡、复水和染色处理；其中，脱蜡的具体方法为浸没于二甲苯溶液脱蜡20min，后更换二甲苯溶液脱蜡20min；脱蜡后的油茶花芽切片浸泡于复水剂中复水10min，得到预复水油茶花芽切片；复水剂为分析纯二甲苯和无水乙醇按体积比为1：1混合而成；将预复水油茶花芽切片依次采用无水乙醇、无水乙醇体积浓度为95％、85％、70％的乙醇水溶液浸泡复水，得到复水油茶花芽切片；随后浸入番红染色剂浸泡，再依次经体积浓度为85％、95％的乙醇水溶液浸泡，后使用固绿染色剂浸泡，得到染色油茶花芽切片；所述番红染色剂为1％番红溶液，溶质为番红或藏红粉末溶剂为体积浓度为50％的乙醇水溶液，所述固绿染色剂为1％固绿溶液，溶质为固绿粉末溶剂为体积浓度为95％的乙醇水溶液；
15.(6)第二脱水和第二透明处理：将染色的油茶花芽依次采用梯度酒精进行脱水处理；随后进行透明处理，所述透明剂为二甲苯；
16.(7)封片：使用中性树脂封片，烘干后得到油茶花芽的石蜡切片。
17.优选地，在步骤(1)中，纵向切除油茶花芽1/3
‑
1/5体积的组织；上述处理有利于花芽组织的固定、脱水、浸蜡等操作，使得溶液能够浸入花芽组织内部，同时有利于包埋时调整位置，切面朝下水平放置使得包埋时花芽始终是平行于包埋盒底面，切片时能够快速切到花芽中央包含雄蕊雌蕊等结构完整的纵截面，进而方便观察花芽内部细胞和组织结构的发育变化。由于油茶花芽结构紧密，固定和软化时进行多次抽真空处理有利于溶液充分浸入油茶花芽组织内部固定、软化细胞和组织，可防止细胞腐坏导致萎缩等形态结构的变化，进而保持细胞的完整性；
18.优选地，以切开后露出雄蕊的长度为标准：
19.对于小于1.1cm的油茶花芽(例如1.0cm、0.9cm、0.8cm、0.7cm、0.6cm、0.5cm等或所述范围内的所有取值，由于篇幅限制不再赘述)，纵向切除油茶花芽1/5体积的组织；
20.对于大于1.1cm的油茶花芽(例如1.1cm、1.2cm、1.3cm、1.4cm、1.5cm、1.6cm、1.7cm、1.8cm、1.9cm、2.0cm等或所述范围内的所有取值，由于篇幅限制不再赘述)，纵向切除油茶花芽1/3体积的组织；
21.长度小于0.5cm的油茶花芽(例如0.4cm、0.3cm、0.2cm、0.1cm等或所述范围内的所有取值，由于篇幅限制不再赘述)，不进行切割。
22.其中，固定液优选将分析纯甲醛溶液、冰醋酸和体积浓度为70％的乙醇水溶液按体积比为1：1：18配置；软化液是将体积浓度为70％的乙醇水溶液和分析纯甘油按体积比为1：1配置。
23.优选地，步骤(2)中所述透明处理具体为：
24.依次使用透明剂一和透明剂二浸泡脱水后的油茶花芽，至少更换3次，脱水后的油
茶花芽与透明剂溶液体积比大于1：10(例如可以是1：10、1：9.5、1：9、1：8.5、1：8、1：7.5、1：7、1：6.5、1：6、1：5.5、1：5或所述范围内的所有取值，由于篇幅限制不再赘述)；
25.其中，透明剂一为分析纯正丁醇和分析纯乙醇按体积比1：1混合的溶液；
26.透明剂二为分析纯正丁醇。本发明使用正丁醇作为透明剂进行透明处理，区别于传统的使用二甲苯作为透明剂，正丁醇毒性远低于二甲苯，作为透明剂使用后透明效果好，组织平整，没有明显的收缩、变形现象，且不存在透明操作时间过长导致材料变脆的问题，在保证切片结果的同时，很大程度上降低了二甲苯溶液对实验人员的危害；
27.优选地，步骤(3)中所述分析纯正丁醇
‑
石蜡混合液为提前在高温环境中融化混合完全的分析纯正丁醇石蜡混合液，区别于传统的逐渐加入碎蜡的浸蜡方法，提前融化混合两者省时省力，且浸蜡效果好。
28.优选地，所述高温环境的温度为75℃
‑
85℃，例如可以是75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃及所述范围内的所有取值，由于篇幅限制不再赘述；
29.优选地，分析纯正丁醇与石蜡的质量体积比为1：1g/ml；
30.优选地，步骤(3)浸泡完还包括以下步骤：
31.置于55
‑
65℃环境中烘烤，然后用液体石蜡浸泡后得到浸蜡油茶花芽；更换至少3次，第一次和第二次浸泡的时间为4h，第三次浸泡时间为12h，所述液体石蜡熔点为58℃
‑
60℃，油茶花芽材料与石蜡的体积比为1：50；
32.优选地，所述液体石蜡的温度为55
‑
65℃，例如可以是55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃及所述范围内的所有取值，由于篇幅限制不再赘述。上述烘烤和液体石蜡的温度不能超过65℃，过高的温度会导致样品碳化，而过低的温度不能达到融化石蜡的目的。
33.优选地，步骤(6)中所述透明处理具体为：
34.依次使用透明剂三和透明剂四浸泡脱水染色后的油茶花芽；
35.其中，透明剂三为分析纯二甲苯和分析纯乙醇按体积比1：1混合的溶液；
36.透明剂四为分析纯二甲苯；每次浸泡时间为至少5min；
37.第二脱水的方法为依次浸入浓度体积为95％乙醇溶液、无水乙醇，每次浸泡时间为至少5min。
38.优选地，本发明中需要加热并恒温处理的步骤，如软化、浸蜡、展片与烘片等，均在烘箱中进行，该方法能够替代展片机及烘片机作用，有效的节省操作所需费用，同时可以制作出高质量的切片。
39.作为优选技术方案，所述制作方法至少包括以下步骤：
40.(1)取材分割与固定：摘取油茶花芽，剥除萼片，切除油茶花芽部分组织，固定并软化；以切开后露出雄蕊的长度为标准：
41.对于小于1.1cm的油茶花芽，纵向切除油茶花芽1/5体积的组织；
42.对于大于1.1cm的油茶花芽，纵向切除油茶花芽1/3体积的组织；
43.长度小于0.5cm的油茶花芽，不进行切割；
44.(2)第一脱水和第一透明处理：将软化的油茶花芽依次采用梯度酒精进行脱水处理；依次使用透明剂一和透明剂二浸泡脱水后的油茶花芽，至少更换3次，脱水后的油茶花芽与透明剂溶液体积比大于1：10；
45.其中，透明剂一为分析纯正丁醇和分析纯乙醇按体积比1：1混合的溶液；
46.透明剂二为分析纯正丁醇；
47.(3)浸蜡：将透明油茶花芽浸入分析纯正丁醇石蜡混合液中浸泡；所述分析纯正丁醇石蜡混合液为提前在75℃
‑
85℃的环境中融化混合完全的分析纯正丁醇石蜡混合液；分析纯正丁醇与石蜡的质量体积比为1：1g/ml；置于55
‑
65℃环境中烘烤，然后用温度为55
‑
65℃的液体石蜡浸泡后得到浸蜡油茶花芽；
48.(4)将浸蜡油茶花芽依次经过包埋、修蜡、切片、粘片、展片和烘片处理；
49.(5)随后进行脱蜡、复水和染色处理；
50.(6)第二脱水和第二透明处理：将染色的油茶花芽依次采用梯度酒精进行脱水处理；依次使用透明剂三和透明剂四浸泡脱水染色后的油茶花芽；
51.其中，透明剂三为分析纯二甲苯和分析纯乙醇按体积比1：1混合的溶液；
52.透明剂四为分析纯二甲苯；
53.(7)封片：使用中性树脂封片，烘干后得到油茶花芽的石蜡切片。
54.第二方面，本发明提供一种油茶花芽的石蜡切片，所述石蜡切片由本发明第一方面所述的方法制备而成。
55.第三方面，本发明提供如第一方面所述的油茶花芽石蜡切片在组织器官和细胞观察、研究油茶花芽组织相关病理学和油茶品种培育中的应用。
56.与现有技术相比，本发明提供的油茶花芽的石蜡切片及其制备方法通过油茶花芽固定前切割处理，有利于花芽组织的固定、脱水、浸蜡等操作，使得溶液能够浸入花芽组织内部固定、软化细胞，可防止细胞腐坏所导致得萎缩等形态结构的变化，进而保持细胞的完整性，有利于迅速且完整的固定油茶花芽形态结构；同时还有利于包埋时调整位置，切面朝下水平放置使得包埋时花芽始终是平行于包埋盒底面，切片时能够快速切到花芽中央包含雄蕊雌蕊等结构完整的纵截面，进而方便观察花芽内部细胞和组织结构的发育变化。其次，在透明处理时使用正丁醇作为透明剂。因为传统透明剂二甲苯毒性大，正丁醇毒性远低于二甲苯，作为透明剂使用后透明效果好，组织平整，没有明显的收缩、变形现象，且不存在透明操作时间而过长导致材料变脆的问题，在保证切片结果的同时，很大程度上降低了二甲苯溶液对实验人员的危害。再次，本发明使用提前融化混合完全的正丁醇石蜡融混合液作为浸蜡溶液，该处理区别于传统的逐渐加入碎蜡的浸蜡方法，提前融化混合两者省时省力，且浸蜡效果好。
附图说明
57.图1为实施例1制备的石蜡切片显微镜下图，
58.图1a是0.63倍显微镜下的油茶花芽切片，
59.图1b是实施例1的油茶花芽切片局部放大图(10倍)，
60.图1c是实施例1油茶花芽切片花药组织放大图(40倍)；
61.图2为实施例2制备的石蜡切片显微镜下图，
62.图2a是0.63倍显微镜下的油茶花芽切片，
63.图2b是实施例2的油茶花芽切片局部放大图(10倍)，
64.图2c是实施例2油茶花芽切片花药组织放大图(40倍)；
65.图3为对比例1制备的石蜡切片显微镜下图，
66.图3a是0.63倍显微镜下的油茶花芽切片，
67.图3b是对比例1的油茶花芽切片局部放大图(10倍)，
68.图3c是对比例1油茶花芽切片花药组织放大图(40倍)。
具体实施方式
69.下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但下述实施例绝非对本发明有任何限制。以下实施例和对比例供试材料均采于2020年8月至2020年12月的油茶不同发育时期的花芽，种植于海南大学热带油茶“三圃一园”示范基地，油茶种质资源圃(位于海南省，儋州市，那大镇)。实施例和对比例中所涉及的油茶植株生长健壮且处于成熟期，无明显病虫害，花芽发育正常。
70.实施例1
71.本实施例具体步骤如下：
72.(1)取材分割与固定：使用剪刀或刀片连花柄一起采集油茶花芽，立即带回实验室后进行选择分割，用镊子将萼片剥除后用全新干净刀片纵向切除花芽1/3
‑
1/5体积的组织，然后快速放进50ml盛有固定液的离心管中浸泡，每管放置3
‑
5个花芽，盖紧盖子，标记上日期、处理、样品、采集人等信息，材料与固定液的体积比需大于1：20g/ml，每天进行抽真空处理，其余时间置于4℃下保存，固定7天后得到固定油茶花芽；所述油茶花芽长度为1.05cm；所述固定液是将分析纯甲醛溶液、冰醋酸和体积浓度为70％的乙醇水溶液按体积比为1：1：18配置；所述真空处理是将装有固定液和材料的容器放入真空干燥器中，抽真空30分钟；
73.(2)软化：将步骤(1)中所得固定油茶花芽从固定液中取出放入装有软化液的50ml离心管中，每管放置3
‑
5个花芽，盖紧盖子，标记上日期、处理、样品、采集人等信息，材料与软化液的体积比需大于1：20g/ml，将离心管盖子打开后抽真空处理30min后置于60℃环境中软化24h，得到软化油茶花芽；所述软化液是将体积浓度为70％的乙醇水溶液和分析纯甘油按体积比为1：1配置；
74.(3)第一脱水：将步骤(2)中所得软化油茶花芽从软化液中取出分别装入扎有小孔、溶液能够自由进出的2ml离心管中，每管装1个花芽并在离心管盖子上用铅笔写上编号，将所述离心管装入50孔2ml离心管盒中，打开离心管盖子用体积浓度为70％的乙醇水溶液漂洗3次后，先后依次加入500ml体积浓度为70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇进行梯度脱水，各梯度间隔为2h。随后，倒除95％乙醇，加入等体积无水乙醇浸泡处理2h，更换无水乙醇再浸泡处理2h，得到脱水油茶花芽；
75.(4)第一透明：提前配置好透明剂一，将步骤(3)中离心管盒中的无水乙醇倒除，倒入500ml透明剂一浸泡1h，后倒除透明剂一，加入等体积透明剂二浸泡2h，后更换透明剂二浸泡2h，更换透明剂二再浸泡2h，得到透明油茶花芽；所述透明剂为两种溶液，透明剂一为分析纯正丁醇和分析纯乙醇按体积比为1：1配置，透明剂二为分析纯正丁醇溶液；透明剂一、二可反复使用2
‑
3次，气味较大注意口罩及手套的佩戴；
76.(5)浸蜡：将熔点为58℃
‑
60℃的250g切片石蜡和250ml分析纯正丁醇装入空的50孔离心管盒，放入75℃烘箱中烘烤融化混合完全后，将步骤(4)所得装有样品的离心管放入盒中，将烘箱调至65℃烘烤48h后将混合液倒除，加入等体积纯石蜡液，在65℃烘烤浸蜡4h，
每隔4h更换一次等体积纯蜡液，重复3次，第三次浸蜡时长为12h，得到浸蜡油茶花芽；
77.(6)包埋：用较硬的挂历纸制作长宽高分别为10cm、2cm、2cm的可拆解包埋盒及长宽均为10cm的固定板；用a4纸制作长宽为2cm、1cm的标签条，在标签正反面都写上样品编码；准备两把镊子及用于打蜡的小杯子；提前打开包埋机(型号:kd
‑
bm)将温度设置为65℃，将新蜡块放入蜡缸中融化，将步骤(5)所得蜡液及离心管放入包埋机的样品盒；包埋时，准备好包埋用的纸盒轻粘蜡液使盒子定形，再将盒子底部蘸取少量蜡液将其固定在固定板上；将镊子加热(65℃)，将制作好的标签按包埋材料的顺序放入盒子(预计样品位置的正前方)，后用小杯子在蜡缸内装取蜡液倒入盒子，微满，再用加热过的镊子夹取样品盒中的花芽按照对应标签位置水平放入小盒中央2
‑
3秒，使其稍微固定不动，注意若镊子上粘有蜡块应及时更换加热过的镊子，以防粘黏材料；包埋时应注意应迅速把材料按需要的切面排好，材料之间要距离1
‑
1.2cm单个排列，室温冷却24h后得到包埋油茶花芽蜡条；
78.(7)修蜡：用刀片在步骤(6)所得包埋油茶花芽蜡条的中花芽四周切出一条深度约为1mm的浅沟，用手将蜡条轻轻一折而分裂成蜡块，使每一块蜡包含一个花芽在蜡块中央，并将所述蜡块用刀片切割修整成正方体，且并不使花芽暴露在外，花芽四周至少留有2
‑
3mm的蜡；将边长为2cm的木块一端浸渍融化的石蜡，然后将修整的蜡块粘上木块，再用加热过的熔蜡铲(或平底汤匙)烫平蜡块与木块的接合处，使两者牢固地粘住；带蜡液冷凝后用刀片修整花芽四周多余的蜡，修整时连续下刀，每次约1mm深，从外向花芽靠近，直至距离花芽2mm处，后从下刀最深处由外向内水平入刀直至最靠近花芽处的刀位，使花芽突出成长方体状，最后从侧面45
°
角斜切将花芽凸出部分以下修整成楔形；得到修整油茶花芽蜡块；
79.(8)切片：将步骤(7)所得修整油茶花芽蜡块固定在切片机的样品固定器上，调整木块位置，使蜡块切面与刀片平行；将切片刀装上切片机(型号：kd
‑
2258)调节刀片角度为5
°
，调整切片厚度为12μm，打开转轮保险钮开始切片，切取5片完整、清晰、连续的切片后用解剖针挑起切好连成带的蜡带放在黑色卡纸上，用解剖刀切断蜡带，在卡纸上写上材料编号，得到油茶花芽切片蜡带；
80.(9)粘片：用30槽不锈钢载玻片架装入全新平面载玻片，用洗洁精水刷洗一遍，再用蒸馏水冲洗3遍，后用95％酒精浸泡3s后烘干备用；取1个新鲜鸡蛋去除蛋黄后称量25ml蛋清装入100ml烧杯中，加入等体积甘油搅拌混合完全后备用；用棉签蘸取少量粘片剂均匀涂抹在上述清洗干净的载玻片除磨砂部分的面积上，放入45℃烘箱中烘烤2h；取出带有烘干粘片剂的载玻片在磨砂部分写上花芽编号，后滴加蒸馏水，所述蒸馏水滴加面积不超过载玻片面积(约μl)，以滴满载玻片但不流出载玻片为标准，后将油茶花芽蜡带放于其中央，用滴管吸除部分蒸馏水，以留有足够展片蜡带展片但蜡带不易位移的蒸馏水体积为标准，得到负载在载玻片上的油茶花芽切片蜡带；
81.(10)展品与烘片：将步骤(9)中带有蒸馏水和油茶花芽蜡带的载玻片平铺放置于45℃烘箱中烘烤30min，使油茶花芽切片蜡带平展，后继续在45℃烘箱中烘烤12h使切片完全干燥并紧贴于载玻片，得到负载在载玻片上的油茶花芽切片；
82.(11)脱蜡：准备5个染色缸(长
×
宽
×
高＝10.4cm
×
9.4cm
×
10cm)，将步骤(10)中所得负载在载玻片上的油茶花芽切片装入载玻片架中浸没于装有约500ml二甲苯溶液的染色缸中脱蜡20min，后更换二甲苯溶液脱蜡20min，得到脱蜡的油茶花芽切片；
83.(12)复水：按分析纯二甲苯和无水乙醇按体积比1：1配置500ml复水剂，将步骤
(11)中所得脱蜡的油茶花芽切片浸泡于装有约500ml复水剂的染色缸中复水10min，得到预复水油茶花芽切片；将预复水油茶花芽切片依次采用无水乙醇，更换无水乙醇，更换体积浓度为95％、85％、70％的乙醇水溶液浸泡复水，每级浸泡时长为5min，得到复水油茶花芽切片；
84.(13)染色：取5g番红粉末、500ml体积浓度为50％的乙醇水溶液配置1％番红染色剂，取5g固绿粉末、500ml体积浓度为95％的乙醇水溶液配置1％固绿染色剂，将步骤(12)复水油茶花芽切片浸没于装有约500ml的1％番红染色剂的染色缸中浸泡4h，再依次浸泡体积浓度为85％、95％的乙醇水溶液，每级浸泡5min，后更换1％固绿染色剂浸泡13s，得到染色油茶花芽切片；
85.(14)第二脱水：将步骤(13)所得染色油茶花芽切片依次浸入浓度体积为95％乙醇溶液、无水乙醇，更换无水乙醇再浸泡，每级浸泡时间为5min，得到脱水染色油茶花芽切片；
86.(15)第二透明：将步骤(14)所得脱水染色油茶花芽切片浸入二甲苯和无水乙醇混合溶液浸泡5min，后更换为分析纯二甲苯溶液浸泡5min，更换分析纯二甲苯溶液再浸泡5min，得到透明染色油茶花芽切片；所述二甲苯和无水乙醇混合溶液为分析纯二甲苯和无水乙醇按体积比为1：1混合得到的混合液；
87.(16)封片时，将步骤(15)所得透明染色油茶花芽切片从二甲苯中取出，放在能吸水的白纸上，在二甲苯干燥前迅速地在切片边缘，滴加中性树脂；用小镊子，轻轻地夹住盖玻片的右侧，后把它的左侧接触树脂，再用左手持一解剖针抵住盖玻片左侧，右手控制镊子慢慢放下盖玻片使树胶顺着盖玻片放下的方向蔓延并将空气完全排除，待盖玻片全部放下后，慢慢调整盖玻片位置，使其将组织完全覆盖。
88.将实施例1制备的石蜡切片在显微镜下进行观察，具体结果如图1所示，其中图1a是0.63倍显微镜下的油茶花芽切片，图1b是实施例1的油茶花芽切片局部放大图(10倍)，图1c是实施例1油茶花芽切片花药组织放大图(40倍)，可以看出，实施例1通过将花芽进行适当切割，暴露出花芽内部结构，能够使得油茶花芽内部雄蕊、雌蕊等组织充分浸入固定液，细胞形态结构完整，在软化、脱水、浸蜡步骤中，油茶花芽各组织均能达到处理后预期效果，即油茶花芽各部分组织软硬程度相当且不会因脱水、浸蜡未完全导致的样品碎裂，切片成粉末状和丝状的现象。因此，本发明制作的油茶花芽石蜡切片能够清晰的观察到油茶花芽各组织的结构，尤其是可以清晰看到花药的结构，通过切片可快速判断花芽发育时期及发育情况。
89.实施例2
90.与实施例1相比，其区别在于采集的油茶花芽长度为1.53cm，本实施例油茶花芽的石蜡切片效果见图2，其中图2a是0.63倍显微镜下的油茶花芽切片，图2b是实施例2的油茶花芽切片局部放大图(10倍)，图2c是实施例2油茶花芽切片花药组织放大图(40倍)，从图2可以看出，实施例2的切片效果与实施例1相似，不再赘述，说明本发明提供的方法同样适用于较大的花芽，可用范围广。
91.对比例1
92.本对比例的步骤(1)为：使用剪刀或刀片连花柄一起采集1.04cm长度的油茶花芽，不做任何切割处理，直接快速放进固定液中固定；其余步骤与实施例1完全相同。
93.将对比例1制备的石蜡切片在显微镜下进行观察，具体结果如图3所示，其中图3a
是0.63倍显微镜下的油茶花芽切片，图3b是对比例1的油茶花芽切片局部放大图(10倍)，图3c是对比例1油茶花芽切片花药组织放大图(40倍)，可以看出对比例1制备的油茶花芽石蜡切片组织带有明显裂痕，萼片组织缺失且位移重叠，花瓣断裂缺失；花药结构无法看清。
94.分析原因可能是由于油茶花芽组织结构相互包裹叠加导致固定液无法完全渗入内层组织，脱水不完全，浸蜡时蜡也无法渗透到内部组织中去，使得内部组织发硬发脆，切片会出现粉末状或丝状的现象，无法成片。此外，由于外部组织和内部组织软硬不一致，导致内部出现空洞，切片时出现外层组织萼片碎裂位移，内层组织花瓣、花药结构不完整，整个切片带有裂痕等现象。
95.对比例2
96.本对比例的透明剂一和透明剂二中的正丁醇替换为二甲苯，浸蜡混合液中正丁醇替换为二甲苯，其余步骤与实施例1完全相同。
97.将对比例2制备的石蜡切片在显微镜下进行观察，制备的油茶花芽石蜡切片清晰度与实施例1类似，但是由于大量使用二甲苯，且进行了加热处理，造成二甲苯挥发弥漫在空气中，对于环境和实验人员都造成不可逆的损害。
98.综上所述，本发明通过油茶花芽固定前切割处理，有利于花芽组织的固定、脱水、浸蜡等操作，使得溶液能够浸入花芽组织内部固定、软化细胞，可防止细胞腐坏所导致得萎缩等形态结构的变化，进而保持细胞的完整性，有利于迅速且完整的固定油茶花芽形态结构；同时还有利于包埋时调整位置，切面朝下水平放置使得包埋时花芽始终是平行于包埋盒底面，切片时能够快速切到花芽中央包含雄蕊雌蕊等结构完整的纵截面，进而方便观察花芽内部细胞和组织结构的发育变化。其次，在透明处理时使用正丁醇作为透明剂。因为传统透明剂二甲苯毒性大，正丁醇毒性远低于二甲苯，作为透明剂使用后透明效果好，组织平整，没有明显的收缩、变形现象，且不存在透明操作时间而过长导致材料变脆的问题，在保证切片结果的同时，很大程度上降低了二甲苯溶液对实验人员的危害。再次，本发明使用提前融化混合完全的正丁醇石蜡融混合液作为浸蜡溶液，该处理区别于传统的逐渐加入碎蜡的浸蜡方法，提前融化混合两者省时省力，且浸蜡效果好。
99.应该注意到并理解，在不脱离后附的权利要求所要求的本发明的精神和范围的情况下，能够对上述详细描述的本发明做出各种修改和改进。因此，要求保护的技术方案的范围不受所给出的任何特定示范教导的限制。
100.申请人声明，以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。