一种尿液次黄嘌呤含量POCT检测方法及应用与流程

一种尿液次黄嘌呤含量poct检测方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种尿液次黄嘌呤含量poct检测方法及应用。


背景技术：

2.癫痫作为世界上最常见的神经系统疾病之一，位列世界卫生组织(world health organization，who)重点防治的五大神经精神疾病之一。癫痫在儿童时期最为常见，严重危害着儿童的身心健康，临床上目前对儿童癫痫的治疗方案有多种，主要包括药物治疗，外科手术治疗，神经调控、生酮饮食治疗以及正在研究中的基因治疗和细胞移植等。根据患者的发作类型，结合神经影像学、神经电生理以及特异性生物标志物，制定个体化诊疗方案，将会给癫痫患者带来更多的益处。因此及时明确癫痫的诊断并予以相应的治疗显得尤为关键。
3.临床表现是癫痫诊断的基础，但当癫痫患者发作症状不典型时，辅助检查在癫痫的诊断中仍具有重要地位。近年来，随着科学技术不断进步，辅助检查方法逐渐丰富，越来越多的癫痫诊断方式被不断发现如神经影像学、神经电生理、遗传学、体液检查、神经心理学、免疫学和人工智能等。但上述辅助检查方法均有一定的受限性，如依赖医院较大型仪器设备及场地、检测时间长等。所以临床上急需一种快速简便地辅助检测手段。
4.研究发现，癫痫是由神经元的超同步放电引起的不可预知的反复发作。越来越多的研究表明，星形胶质细胞向神经元传递信号异常在神经网络的过度兴奋中起着重要作用。对多种中枢神经系统疾病(如阿尔茨海默病、卒中、重度抑郁、精神分裂症和癫痫)的病理学研究结果显示，嘌呤信号传导在神经元-胶质细胞和胶质细胞-胶质细胞相互作用中有重要的作用。嘌呤能信号的作用可以取代兴奋和抑制之间的平衡，促进癫痫样活动的出现，嘌呤能代谢过程中腺苷、肌酐、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿酸在癫痫发作中发挥重要作用，并且血液和尿液可以检测到其水平变化，目前研究表明血嘌呤水平在癫痫诊断中灵敏度及特异性均较高。但是目前常用的嘌呤及其代谢物检测方法为高相液相色谱法，由于黄嘌呤和次黄嘌呤的化学结构和性质差异微小,在高效液相色谱条件下难以达到有效分离,而且还易受到其他核苷类化合物的干扰，同时存在操作复杂等不足。
5.本发明旨在克服以上难点，建立一种能够在临床、居家快速便捷开展的尿液中次黄嘌呤含量检测方法及应用，可有效检测尿液中次黄嘌呤含量，对于癫痫患者诊断、实时检测具有重要价值。
6.poct技术是一种能够在临床快速便捷进行样本检测的技术。采集待测样本后，将待测样本加入反应杯中进行反应，反应后的混合液加入检测卡中，将检测卡插入手持式分光光度计检测仪中进行检测。该法已广泛应用于抗原抗体检测，但在尿液次黄嘌呤含量检测领域还鲜有使用。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种尿液次黄嘌呤含量poct检测方法及应用。
8.本发明所采用的技术方案为：一种尿液次黄嘌呤含量poct检测方法，所述检测方法包括：采集待检测样本进行酶学反应后，经分光光度计检测、内置标准曲线比对，获得次黄嘌呤浓度值。
9.上述该检测方法是通过采用poct方法进行检测，该检测方法仅需要对样本进行采集、酶学反应、分光光度计检测后，比对内置标准曲线即可获得数据值的输出，无需进行额外计算。该方法具有灵敏度高、耗时短、通量高等优点。本发明旨在建立一种利用poct技术简便、快速、准确检测人尿液中次黄嘌呤含量，为癫痫病情检测提供参考依据。
10.作为优选地，所述待检测样本为离体尿液。
11.作为优选地，所述待检测样本的采集体积不少于2-4ml。
12.作为优选地，所述酶学反应的反应体系包括反应杯、检测卡和对照品。
13.作为优选地，所述反应杯包括辣根过氧化物酶反应物、黄嘌呤氧化酶反应物和显色液反应物。
14.辣根过氧化物酶，一种糖蛋白，由于在辣根中该种酶的含量很高，故名。该酶比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备。辣根过氧化物酶广泛分布于植物界，辣根中含量最高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。辣根过氧化物酶由多个同工酶组成，分子量为40000，酶催化的最适ph因供氢体不同而稍微有所差异。
15.黄嘌呤氧化酶，黄嘌呤包括咖啡因，茶碱，可可碱(主要在巧克力中发现)，和马黛因。主要的化合物，黄嘌呤，是嘌呤降解途径的产物，并会在黄嘌呤氧化酶的作用下转换为尿酸。黄嘌呤氧化酶是一种专一性不高，既能催化次黄嘌呤生成黄嘌呤，进而生成尿酸，又能直接催化黄嘌呤生成尿酸的酶，ec1.2.3.2。一种含钼、非血红素铁、无机硫化物、fad的黄素酶。存在于牛乳、动物特别是鸟类的肝脏与肾脏、昆虫、细菌中。分子量10几万―30几万。底物专性较广，除以嘌呤衍生物为电子供体外，还可以蝶啶衍生物、醛(生成羧酸)为电子供体，表面上生成羟基化合物，氧原子来源于水。nadh也氧化。电子受体很多，有分子氧、硝酸盐、苯醌、硝基化合物、nad、铁氧还蛋白等，但依酶的来源而有所不同。在反应时生成过氧化物，引起连锁反应。黄嘌呤氧化酶的分子量较大，约27万，并含有两分子fad、两个钼原子和八个铁原子。酶中的钼以钼蝶呤辅因子的形式存在，是酶的活性位点。铁原子则为[2fe-2s]铁氧还蛋白铁硫簇的一部分，参与电子转移反应。黄嘌呤氧化酶(9002-17-9)主要用于生化研究，常用诊断用酶，黄嘌呤、肌苷和鸟苷等的测定。
[0016]
作为优选地，所述显色液反应物为tris-hcl缓冲液、1,5二甲基-2-苯基-4-氨基-3-吡唑啉酮和石炭酸中的任意一种。
[0017]
作为优选地，所述检测卡带有凹槽，用于检测反应后的混合液。
[0018]
上述选用带有凹槽的检测卡，是由于在选取了样本后，需要将反应液滴入检测卡凹槽处。将检测卡插入手持式分光光度计进行检测，读取样品中次黄嘌呤浓度。
[0019]
作为优选地，所述对照品包括阳性对照品和阴性对照品。
[0020]
作为优选地，所述阳性对照品为含有一定浓度次黄嘌呤的溶液；
[0021]
所述阴性对照品为纯化水。
[0022]
一种尿液次黄嘌呤含量poct检测方法的应用，采用上述权利要求1-9任一所述的尿液次黄嘌呤含量poct检测方法在临床或居家环境下进行快速检测癫痫的应用。
[0023]
癫痫的辅助检查方法虽逐渐丰富，但都存在一定的受限性。本方法仅需操作者将采集的尿液滴至反应杯中进行混合反应，反应产物转移至检测卡上即可上机检测，检测仪器仅依赖于普通手持型分光光度计，结果可自动判读，对操作人员的要求极其简单，临床及居家可推广性高。
[0024]
本发明的有益效果为：
[0025]
(一)检测结果精准：本发明有效满足了临床检测尿液中次黄嘌呤含量的需求，提供了一种尿液次黄嘌呤含量poct检测方法及应用，能够快速、准确且灵敏地检测出尿液中次黄嘌呤含量。为相关治疗方案的制定提供及时的预判。实验结果重复性好，精密度高。另外，本发明检测时间周期短，最快能在20分钟内完成检测，极大的节约了检测时间，加快临床诊断效率，是一种高效的辅助检测手段。
[0026]
(二)填补临床应用空白：癫痫的辅助检查方法虽逐渐丰富，但都存在一定的受限性。本发明可以通过poct进行临床甚至居家快检，有效弥补了目前临床上癫痫辅助检查的不足。
[0027]
(三)检测结果输出率高：本发明采用poct方法进行检测，该检测方法仅需要对样本进行采集、酶学反应、分光光度计检测后，比对内置标准曲线即可获得数据值的输出，无需进行额外计算。该方法具有灵敏度高、耗时短、通量高等优点。本发明旨在建立一种利用poct技术简便、快速、准确检测人尿液中次黄嘌呤含量，为癫痫病情检测提供参考依据。
[0028]
(四)操作简单，便于推广：本方法仅需操作者将采集的尿液滴至反应杯中进行混合反应，反应产物转移至检测卡上即可上机检测，检测仪器仅依赖于普通手持型分光光度计，结果可自动判读，对操作人员的要求极其简单，临床及居家可推广性高。
具体实施方式
[0029]
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0030]
实施例：
[0031]
本发明建立了一种利用便携式简易尿液次黄嘌呤含量poct检测方法，从而为癫痫的病情的检测提供参考依据。
[0032]
1.试剂盒保存于2-8℃。试剂盒规格：10人份/盒，具体组分见表1
[0033]
表1.试剂盒组分
[0034]
[0035][0036]
2.试剂盒性能验证
[0037]
2.1样本采集
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选用企业标准品进行试剂盒性能验证。所有样本保存于2-8℃；若样本长时间不使用可保存于-20℃。
[0039]
2.2样本反应
[0040]
取各企业标准品1ml，加入到反应杯中用移液管吹洗5次混匀，室温静置15min，用移液管吸取0.5ml上步反应中充分反应的液体，小心滴入检测卡凹槽处。将检测卡插入手持式分光光度计(哈希dr1900)进行检测，读取样品中次黄嘌呤浓度。
[0041]
2.3试剂盒性能：
[0042]
2.3.1准确度：对企业标准品的准确度标准品(表2)样本进行检测，其测量结果的相对偏差应在
±
10％范围内。
[0043]
表2.企业准确度标准品
[0044][0045][0046]
2.3.2空白限：用零浓度标准品或样本稀释液作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的分光光度值，计算其平均值(m)和标准差(sd),得出m+2sd所对应的分光光度值，根据零浓度标准品与相邻标准品之间的浓度-分光光度值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将m+2sd所对应的分光光度值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为空白限。
[0047]
2.3.3线性：将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限。按试剂盒说明书进行操作，对每一浓度的样本
均重复检测2次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r，r应≥0.9900。
[0048]
2.3.4重复性：本试剂盒变异系数(cv)应不大于10％。
[0049]
用企业标准品中重复性标准品各检测10次，计算10次测量结果的平均值m和标准差sd，根据公式cv＝sd/m
×
100％得出变异系数cv。
[0050]
2.3.5批间差：变异系数(cv)应不大于15％。
[0051]
用三个批号的试剂(盒)分别测试同一浓度的样本，各重复10次，计算30次测量结果的平均值m和标准差sd，根据公式cv＝sd/m
×
100％得出变异系数cv。
[0052]
3.对10份临床样本检测
[0053]
3.1样本采集
[0054]
采集5名癫痫患者及5名健康人受检者尿液标本。
[0055]
样本采集要点：采用一次性无菌尿杯收集中段尿，体积不少于2ml。
[0056]
3.2样本反应
[0057]
取各企业标准品1ml，加入到反应杯中用移液管吹洗5次混匀，室温静置15min，用移液管吸取0.5ml上步反应中充分反应的液体，小心滴入检测卡凹槽处。将检测卡插入手持式分光光度计进行检测，读取样品中次黄嘌呤浓度。
[0058]
3.3结果分析：
[0059]
最终试剂盒检测结果显示其中4例阳性，6例阴性。
[0060]
表3.10例尿液样本中次黄嘌呤含量检测结果
[0061]
[0062][0063]
(一)检测结果精准：本发明有效满足了临床检测尿液中次黄嘌呤含量的需求，提供了一种尿液次黄嘌呤含量poct检测方法及应用，能够快速、准确且灵敏地检测出尿液中次黄嘌呤含量。为相关治疗方案的制定提供及时的预判。实验结果重复性好，精密度高。另外，本发明检测时间周期短，最快能在20分钟内完成检测，极大的节约了检测时间，加快临床诊断效率，是一种高效的辅助检测手段。
[0064]
(二)填补临床应用空白：癫痫的辅助检查方法虽逐渐丰富，但都存在一定的受限性。本发明可以通过poct进行临床甚至居家快检，有效弥补了目前临床上癫痫辅助检查的不足。
[0065]
(三)检测结果输出率高：本发明采用poct方法进行检测，该检测方法仅需要对样本进行采集、酶学反应、分光光度计检测后，比对内置标准曲线即可获得数据值的输出，无需进行额外计算。该方法具有灵敏度高、耗时短、通量高等优点。本发明旨在建立一种利用poct技术简便、快速、准确检测人尿液中次黄嘌呤含量，为癫痫病情检测提供参考依据。
[0066]
(四)操作简单，便于推广：本方法仅需操作者将采集的尿液滴至反应杯中进行混合反应，反应产物转移至检测卡上即可上机检测，检测仪器仅依赖于普通手持型分光光度计，结果可自动判读，对操作人员的要求极其简单，临床及居家可推广性高。
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本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，均属于本发明的保护范围。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的范围下，可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。