一种淡水中总氮浓度的测定方法

1.本发明具体涉及一种淡水中总氮浓度的测定方法。


背景技术：

2.总氮(total nitrogen,tn)是水中无机氮(包括氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮)和有机氮的总和，是衡量水质富营养化的重要指标之一。随着经济的发展和人口的快速增长，大量含氮废水被排入水体，导致水质中有机氮和无机氮含量过高，微生物大量繁殖，出现富营养化状态。因此，水质中tn的监测成为当今环境保护的重要课题。
3.目前，淡水水体中tn的测定方法主要有：(1)高温氧化-化学发光检测法；(2)离子色谱法；(3)气相分子吸收光谱法；(4)连续流动分析法；(5)同位素稀释的气相色谱-质谱联用法；(6)碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法。方法(1)至(5)检测准确、快速、灵敏，但需要依赖大型分析仪器，一般实验室难以普及应用。方法(6)国标法(hj 636-2012)《碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》”(以下简称“国标法”)是测定淡水tn含量常用方法。该方法原理简单：在120℃～124℃碱性介质条件下，过硫酸钾为强氧化剂在60℃以上的水溶液中进行分解，在120～140℃高压蒸汽条件下可将大部分氮化合物(包括有机氮化合物、亚硝酸盐氮、氨氮)氧化成硝酸盐。用紫外分光光度法分别于波长220nm与275nm处测定其吸光度，按a＝a
220-2a
275
计算硝酸盐氮吸光度值，然后计算tn的含量。与依赖大型分析仪器淡水tn测定的方法相比，国标法使用仪器简单，对实验室要求较低，应用较为广泛，然而该国标方法测试范围窄，对于超测试上限的水样，需对样品进行梯度稀释，操作过程不仅繁琐，而且影响测量精度；并且，该方法需要用到高压灭菌过进行消解，操作繁琐且影响因素较多不易控制，使得测定结果准确度较低，给实验者带来许多困难。容易受到外界因素干扰，影响测定结果，由于其反应体系过大、操作不方便导致不能满足样品批量测试，同时耗时长。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种提高淡水总氮浓度测定范围和测定精度、安全性高、操作简单、工作效率提高、降低测定成本且减少二次污染的淡水中总氮浓度的测定方法。
5.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
6.一种淡水中总氮浓度的测定方法，包括以下步骤：
7.s1：标准工作曲线制定：
8.s1.1：采用硝酸钾标准使用液在六个15ml的旋盖式消解管内分别配制浓度为0.0、0.25、0.5、1.0、3.0、7.0μg
·
ml-1
的总氮工作液各4ml，所述硝酸钾标准使用液的浓度为10.0mg
·
l-1
；
9.s1.2：在每个总氮工作液中加入2.0-2.3ml浓度为40g/l的碱性过硫酸钾溶液，拧紧瓶盖，混匀，再置于消解仪中，在120～124℃下消解时间为30-50min，冷却至室温后将瓶中液体颠倒混匀2～3次；
10.s1.3：在每个消解后的总氮工作液中加入0.4ml盐酸溶液，再加水稀释到10ml，混匀；所述盐酸溶液采用浓度为1.19g/ml的浓盐酸溶液和无氨水以体积比为1∶9混合而成；
11.s1.4：使用紫外分光光度计，以水作为参比，分别在波长220nm和275nm处测定吸光度；零浓度的校正吸光度ab、每个工作液的校正吸光度as及二者差值ar分别按公式(1)、(2)和(3)进行计算，以总氮含量为横坐标，对应的ar为纵坐标，绘制标准曲线，并用线性回归法求出标准工作曲线的截距a和斜率b；
12.ab＝a
b220-2a
b275
(1)
13.as＝a
s220-2a
s275
(2)
14.ar＝a
s-ab(3)
15.ab为零浓度溶液的校正吸光度；
16.a
b220
为零浓度溶液于波长220nm处的吸光度；
17.a
b275
为零浓度溶液于波长275nm处的吸光度；
18.as为总氮工作液的校正吸光度；
19.a
s220
为总氮工作液于波长220nm处的吸光度；
20.a
s275
为总氮工作液于波长275nm处的吸光度；
21.ar为总氮工作液与零浓度溶液校正吸光度的差值；
22.s2：水样测定及计算
23.量取4ml淡水水样，按与总氮工作液相同的处理步骤测定并记录所述淡水水样的吸光度，并参照式(1)-(3)计算淡水水样和零浓度溶液校正吸光度差值ar'，样品中总氮的质量浓度按式(4)计算：
[0024][0025]
式中：
[0026]
ρ为淡水水样中总氮的质量浓度，mg/l；
[0027]ar
'为淡水水样的校正吸光度与零浓度溶液校正吸光度的差值；
[0028]
a为校准曲线的截距；
[0029]
b为校准曲线的斜率；
[0030]
v为试样体积，ml；
[0031]
f为稀释倍数。
[0032]
优选的，所述消解时间为30min。
[0033]
优选的，所述碱性过硫酸钾溶液的用量为2.0ml。
[0034]
优选的，所述淡水水样的盐度为0.0-15psu。
[0035]
优选的，所述淡水水样的ph为中性或碱性。
[0036]
优选的，所述淡水水样的的总氮浓度为0-11mg
·
l-1
。
[0037]
与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0038]
本发明采用15ml旋盖式消解管代替国家标准25ml玻璃比色管，避免了溶液高温消解溢出或氨气溢出的现象，提高了线性关系，节省了检测时间，降低了药品成本。与国标tn测定方法相比，本发明测定淡水tn浓度新方法具有更好的盐度范围适用性、准确性和精密度，浓度检测范围从0-7mg
·
l-1
扩大到0-11mg
·
l-1
，tn浓度的测定范围提高了1.6倍，可更
加有效测定较高tn浓度的样品，节省稀释成本和时间。综上所述，本发明建立的简便、快速测定淡水tn浓度方法，使tn浓度的测定工作更加简便、快速、准确，提高了工作效率，为实验室大批量测定淡水tn浓度提供了可行性。
附图说明
[0039]
图1为消解液用量对新方法tn浓度测定的影响图。
[0040]
图2为消解时间对新方法tn浓度测定的影响图。
[0041]
图3为水体盐度对新方法tn浓度测定的影响图。
[0042]
图4水体ph对新方法tn浓度测定的影响图。
[0043]
图5为tn测定新方法与国标法测定标准曲线对比图。
[0044]
图6为tn测定新方法与国标法标曲正交验证曲线图。
[0045]
图7为小体系测定tn的检测范围图。
[0046]
图8为tn测定新方法与国标法水样的正交验证曲线图。
具体实施方式
[0047]
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
[0048]
实施例1：
[0049]
仪器与试剂
[0050]
仪器
[0051]
紫外分光光度计、25ml比色管、移液管、200μl移液枪、5ml移液枪、200μl移液枪枪头、5ml移液枪枪头、高压蒸汽灭菌锅、15ml消解管、消解仪。
[0052]
试剂
[0053]
溶液配制参照国标法，具体配置见表1
[0054]
表1所需试剂的具体配制方法
[0055][0056]
本实施例提供一种淡水中总氮浓度的测定方法，包括以下步骤：
[0057]
s1：标准工作曲线制定：
[0058]
s1.1：采用硝酸钾标准使用液在六个15ml的旋盖式消解管内分别配制浓度为0.0、0.25、0.5、1.0、3.0、7.0μg
·
ml-1
的总氮工作液各4ml，所述硝酸钾标准使用液的浓度为10.0mg
·
l-1
；
[0059]
s1.2：在每个总氮工作液中加入2.0ml浓度为40g/l的碱性过硫酸钾溶液，拧紧瓶盖，混匀，再置于消解仪中，在120～124℃下消解时间为30min，冷却至室温后将瓶中液体颠倒混匀2～3次；
[0060]
s1.3：在每个消解后的总氮工作液中加入0.4ml盐酸溶液，再加水稀释到10ml，混匀；所述盐酸溶液采用浓度为1.19g/ml的浓盐酸溶液和无氨水以体积比为1∶9混合而成；
[0061]
s1.4：使用紫外分光光度计，以水作为参比，分别在波长220nm和275nm处测定吸光度；零浓度的校正吸光度ab、每个工作液的校正吸光度as及二者差值ar分别按公式(1)、(2)
和(3)进行计算，以总氮含量为横坐标，对应的ar为纵坐标，绘制标准曲线，并用线性回归法求出标准工作曲线的截距a和斜率b；
[0062]ab
＝a
b220-2a
b275
(1)
[0063]as
＝a
s220-2a
s275
(2)
[0064]ar
＝a
s-ab(3)
[0065]ab
为零浓度溶液的校正吸光度；
[0066]ab220
为零浓度溶液于波长220nm处的吸光度；
[0067]ab275
为零浓度溶液于波长275nm处的吸光度；
[0068]as
为总氮工作液的校正吸光度；
[0069]as220
为总氮工作液于波长220nm处的吸光度；
[0070]as275
为总氮工作液于波长275nm处的吸光度；
[0071]ar
为总氮工作液与零浓度溶液校正吸光度的差值；
[0072]
s2：水样测定
[0073]
量取4ml淡水水样，按与总氮工作液相同的处理步骤测定并记录所述淡水水样的吸光度，并参照式(1)-(3)计算淡水水样和零浓度溶液校正吸光度差值ar'，样品中总氮的质量浓度按式(4)计算：
[0074][0075]
式中：
[0076]
ρ为淡水水样中总氮的质量浓度，mg/l；
[0077]ar
'为淡水水样的校正吸光度与零浓度溶液校正吸光度的差值；
[0078]
a为校准曲线的截距；
[0079]
b为校准曲线的斜率；
[0080]
v为试样体积，ml；
[0081]
f为稀释倍数。
[0082]
本实施例中，所述淡水水样的盐度为0.0-15psu。
[0083]
本实施例中，所述淡水水样的ph为中性或碱性。
[0084]
本实施例中，所述淡水水样的的总氮浓度为0-11mg
·
l-1
。
[0085]
水体tn含量的高低对于我们的生活环境的影响越来越重要，常规tn测定方法存在操作体积过大、消解困难、药品成本高等问题，如何更加简便、快速、准确地测出tn含量是急需要解决的问题。本发明采用15ml旋盖式消解管代替国家标准25ml玻璃比色管，避免了溶液高温消解溢出或氨气溢出的现象，提高了线性关系，节省了检测时间，降低了药品成本。与国标tn测定方法相比，本发明测定淡水tn浓度新方法具有更好的盐度范围适用性、准确性和精密度，浓度检测范围从0-7mg
·
l-1
扩大到0-11mg
·
l-1
，tn浓度的测定范围提高了1.6倍，可更加有效测定较高tn浓度的样品，节省稀释成本和时间。综上所述，本发明建立的简便、快速测定淡水tn浓度方法，使tn浓度的测定工作更加简便、快速、准确，提高了工作效率，为实验室大批量测定淡水tn浓度提供了可行性。
[0086]
实施例2：
[0087]
本实施例就实施例1的发明历程做具体阐述说明：
[0088]
1、实验方法设计
[0089]
1.1、影响因素优化实验
[0090]
为了准确确定小体系测定tn的方法，本实验从以下几个因素确定最佳反应条件，探究消解液用量、消解时间、盐度与ph等对tn测定反应过程的影响，每组实验均设置三个平行：(1)消解液用量影响因素：在室温下，配制浓度为0.0、0.25、0.5、1.0、3.0、7.0μg
·
ml-1
的硝酸盐tn工作液，各浓度分别设置五组，每组设三个平行，对各浓度工作液分别加入1.9ml、2.0ml、2.1ml、2.2ml、2.3ml碱性过硫酸钾后消解30min，分别加入0.4ml盐酸，纯水稀释至10ml，于波长220nm和275nm处检测吸光度。以此确定碱性过硫酸钾消解液的最佳使用量；(2)消解时间影响因素：其他条件不变，在室温条件下对tn工作液分别以10、20、30、40、50min进行显色反应，确定消解反应的最佳时间；(3)盐度影响因素：保证以上消解液最佳使用量和最佳消解时间不变，对tn工作液加入不同浓度的氯化钠改变水体盐度为0.0、2.5、5.0、7.5、15psu，为了确定水体盐度对tn检测的影响可做f检验统计分析进一步进行验证；(4)ph影响因素：保证以上消解液最佳使用量、最佳消解时间和最适盐度不变，对tn工作液加入盐酸试剂或氢氧化钠试剂调节水体ph为1、3、5、7、9、11，为了确定水体ph对tn检测的影响可做f检验统计分析进行验证；(5)测定tn浓度的线性范围确定：确定以上优化条件后，对tn工作液浓度范围进行扩大，分别设定tn工作液浓度为0、0.25、0.5、1、3、7、11、12、13、14、20、25μg
·
ml-1
，确定tn浓度的线性检测范围。
[0091]
1.2、tn标准工作曲线绘制
[0092]
参照国标法，标准工作曲线实验步骤具体为下：
[0093]
(1)分别量取0.0、0.1、0.2、0.4、1.2、2.8ml硝酸钾标准使用液于15ml消解管中，加超纯水水稀释至4ml，此时对应tn(以n计)浓度分别为0.00、0.25、0.50、1.00、3.00和7.00mg
·
l-1
；
[0094]
(2)加入2ml碱性过硫酸钾溶液，拧紧瓶盖，混匀；
[0095]
(3)将消解管置于消解仪中，加热至120℃开始消解，保持温度在120～124℃之间30min，冷却至室温后将瓶中液体颠倒混匀2～3次；
[0096]
(4)分别加入0.4ml盐酸溶液，加水稀释至10ml标线，混匀。使用紫外分光光度计，以水作为参比，分别在波长220nm和275nm处测定吸光值，按照a＝a
220-2a
275
进行计算，以tn浓度为横坐标，对应吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
[0097]
1.3、tn测定新方法标准曲线的拟合验证
[0098]
根据上述2.2.1确定的优化实验条件，同时分别采用小体系与国标两种方法测定tn的浓度，并根据结果绘制两种方法相对应的标准曲线进行线性拟合。采用正交验证和f、t检验对小体系和国标两种方法的结果分别进行验证，以此证明tn测定新方法的可行性。
[0099]
1.4、实测环境样品的准确性验证
[0100]
本实验水样采自广东省茂名市两个站点，茂南站点采集水样3个，化州站点采集水样2个。水样采集完毕，送回实验室后放入冰箱保存。分别采用小体系与国标两种方法测定其tn浓度。由于部分样品tn浓度较高，测定前需进行相应倍数的梯度稀释。对样品的两种测定结果分别进行f、t检验，拟证明tn测定新方法的准确性。
[0101]
2、结果与讨论
[0102]
2.1、消解液用量的优化
[0103]
在高温碱性介质下，过硫酸钾做氧化剂将水中氨氮、亚硝酸盐氮以及大部分有机物氧化为硝酸盐，所以消解液的用量是影响实验检验结果的重要因素。消解液用量对小体系检测tn浓度的影响，结果如图1所示：相同tn浓度下，当碱性过硫酸钾用量为1.9-2.0ml时，吸光度呈上升趋势，1.9ml时吸光度较低的原因是碱性过硫酸钾用量不足，不能与水中含氮化合物完全反应，导致吸光度较低。用量为2.0-2.3ml时，吸光度呈下降趋势，当用量为2.0ml时，吸光度达到峰值，即小体系测定tn浓度过程中消解液碱性过硫酸钾用量为2.0ml最佳。
[0104]
2.2、消解时间的优化
[0105]
消解时间长短是影响tn检测的重要因素，消解时间的延长有利于过硫酸钾的消解。实验数据如图2所示：相同tn浓度下，当消解时间为10-30min时，吸光度呈上升趋势，其原因是因为加热时间的延长使过硫酸钾氧化底物更加彻底。时间为30-50min时，吸光度整体呈下降趋势，但下降趋势不明显，整体稳定性较差。当用量为30min时，整体吸光度达到峰值，且该时间下的数据较稳定，因此该方法消解时间设定30min为最佳。
[0106]
3.3、水体盐度对小体系总氮浓度测定的影响
[0107]
水体盐度是影响tn检测的重要因素之一。测定水体盐度对小体系tn浓度测定的影响，结果如图3所示：相同tn浓度下，盐度为0-5psu时，吸光度呈下降趋势，当盐度大于5psu时，吸光度随盐度的增大而增加，且tn浓度越高，增长幅度越大。由于整体数据波动幅度较小，需进行进一步显著性分析。经置信度为95％的f检验，水体盐度对小体系tn浓度的测定结果的f值为0.016，小于f表2.759(df1为4，df2为25)，说明水体盐度范围0.0-15psu对小体系tn浓度的测定结果不存在显著性差异，即小体系测定tn浓度方法盐度范围较大，受盐度影响较小，可以适用于盐度含量较高的环境样品测定。与国标法相比，本方法对不同水体盐度的总氮测定的适用性也更加明确。
[0108]
3.4、ph对小体系tn浓度测定的影响
[0109]
ph值是衡量水体酸碱度的一个值，是影响实验检测结果的重要影响因素之一。本实验对小体系测定tn浓度方法的最适ph进行探究。水体ph对小体系tn浓度测定的影响，结果如图4所示：当tn浓度范围为0-1mg
·
l-1
时，ph对吸光度影响较低，整体数据较为稳定，随着tn浓度的增加，ph对tn测定的影响也逐渐增大。经置信度为95％的f检验，ph对小体系tn浓度测定结果f值为0.028，小于f表2.524(df1为5，df2为30)，说明不同ph对小体系tn浓度的测定结果不存在显著性差异。整体分析，当ph处于中性或碱性时，吸光度稳定性较好。综上所述，小体系测定tn浓度方法最适ph值范围应为中性或碱性。
[0110]
3.5、在优化条件下的标准工作曲线的绘制
[0111]
综合上述实验结果，可以确定最适宜的反应条件为：碱性过硫酸钾消解液用量2.0ml，消解时间为30min，ph值调至7以上。
[0112]
使用浓度范围在0-10mg
·
l-1
的硝酸盐标准溶液，按照确定好的实验条件进行15ml小体系标准曲线的绘制，同时按照国家标准方法绘制25ml体系的标准曲线，结果如图5所示：15ml体系的吸光度与tn浓度的线性回归方程为y＝0.0468x-0.004，线性相关系数r2＝0.9998；25ml体系的吸光度与tn浓度的线性回归方程为y＝0.0455x-0.002,线性相关系数r2＝0.9996。可以得出，小体系测定tn的方法与国标方法测定tn的吸光度与浓度具有很好的线性回归关系。为了进一步确定小体系测定tn方法的准确定，本实验采用正交验证法对
两种方法进行交叉检验，以25ml体系的测定结果作为横纵坐标，15ml体系的测定结果为纵坐标，进行线性拟合，结果如图6所示：两种方法的线性方程为a
15 ml体系
＝1.0296a
25 ml体系
+0.0023，线性相关系数r2＝0.9992，说明两种方法的测定结果高度一致。经置信度为95％的t检验，大小体系两种方法的sig.＝0.948﹥0.05，进一步证实15ml小体系测定tn方法与25ml大体系国标测定tn方法的测定结果不存在显著性差异，说明15ml小体系测定tn浓度的方法可行性较高。
[0113]
3.6、小体系测定tn浓度的线性检测范围
[0114]
采用优化好的实验条件进行15ml小体系线性范围检测，结果如图7所示。当tn浓度在0-11mg
·
l-1
范围内时，溶液浓度与吸光度呈线性关系，相关系数r2＝0.9997；当tn浓度超过11mg
·
l-1
时，吸光度增长幅度降低，线性相关系数下降，稳定性减弱。可以确定小体系测定tn浓度的检测范围为0-11mg
·
l-1
，较之国家标准中的0-7mg
·
l-1
测定范围扩大了接近1.6倍。本实验小体系测定方法明显提高了tn的测定上线，可以对较高的tn浓度进行有效地检测，节省了多梯度稀释所消耗的时间和成本。
[0115]
3.7、小体系与国标方法测定实际样品的交叉验证
[0116]
用两种方法分别同时检测茂名市茂南区和化州的样品，实验结果采用正交验证法进行比较，以25ml体系测定结果为横坐标，15ml体系测定结果为纵坐标进行线性拟合，如图8所示，两种方法的水样测定结果拟合的线性相关系数为0.9982，线性关系良好。
[0117]
为进一步验证15ml体系测定方法的可行性，对两种测定结果分别进行f检验和t检验。经置信度为95％的f检验，15ml体系和国标25ml体系两种测定方法对两个不同地区实际样品的tn浓度检测结果的f值为0.009，小于f表5.318(df1为1，df2为8)，说明小体系和国家标准测定tn浓度的检测结果不存在显著性差异。经置信度为95％的t检验，15ml体系和国标25ml体系两种方法测定实际样品tn浓度的检测结果的sig.＝0.928﹥0.05，进一步证实两种方法无显著性差异。综上所述，本实验建立的15ml小体系检测淡水tn浓度的方法准确度高，具有可行性。
[0118]
以上所述，仅是本技术的较佳实施例，并非对本技术做任何形式的限制，虽然本技术以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本技术，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本技术技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。