基于铕掺杂碳量子点比率荧光探针的四环素检测方法

1.本发明属于四环素检测技术领域，具体涉及一种基于铕掺杂碳量子点比率荧光探针的四环素检测方法。


背景技术：

2.四环素(tc)是一种重要的常用抗生素，因其成本低、抗菌活性高、口服吸收好、毒性低，在畜牧业、水产养殖和个体化治疗中得到广泛应用。不幸的是，由于过度使用tc产品，已经对食品安全、环境保护和人类健康造成了一些严重的不利影响。目前，有大量检测四环素的分析策略，如液相色谱
‑
质谱(lc
‑
ms)、高效液相色谱(hplc)、毛细管电泳(ce)，化学发光和电化学分析，可准确检测四环素。然而，存在仪器要求严格，耗时，步骤操作繁琐，要求专业技能等不足。近年来，荧光传感器或荧光分析技术以其操作简单、响应速度快、检测限低、样品用量少、选择性好、分析成本低等优点，成功地应用于tc的测定。值得注意的是，铕基荧光传感平台在与tc结合时表现出高度增强的荧光，近年来引起了广泛关注。这可以归因于这样一个事实，即tc可以与铕离子(eu
3+
)结合，形成铕
‑
四环素复合物(eu
3+
‑
tc)，并将四环素吸收的能量传递给eu
3+
，使eu
3+
的特征荧光得以极大增强，这被称为“天线效应”。此外，eu
3+
的荧光具有独特的光谱特性，包括大的stokes位移、长的荧光寿命和尖锐的线性发射区。然而，由于配位水分子振动模式引起的猝灭效应，铕结合四环素的荧光强度很弱。此外，这些基于铕的传感器平台由于在潮湿环境和紫外光下稳定性差，在实际应用中受到限制。


技术实现要素：

3.本发明的目的之一在于提供一种基于铕掺杂碳量子点比率荧光探针的四环素检测方法，步骤如下：
4.(1)将铕掺杂碳量子点比率荧光探针制备成水溶液，即为eu
‑
cds溶液；
5.(2)取步骤(1)制备的eu
‑
cds溶液，向其中加入不同量的四环素，将其制备成四环素不同浓度梯度的标准溶液，并混合均匀；
6.(3)采用荧光光谱法在380nm的激发下记录四环素不同浓度梯度的标准溶液468nm和620nm处的荧光强度；
7.(4)将步骤(3)得到的实验数据整理作图，以i
620
/i
468
的强度比作为纵坐标，四环素浓度作为横坐标，获得四环素浓度与i
620
/i
468
强度比的线性方程；
8.(5)将待测样品溶液与步骤(1)制备的eu
‑
cds溶液混合；采用荧光光谱法在380nm的激发下，获得待测溶液的468nm和620nm处的荧光强度，计算i
620
/i
468
，代入步骤(4)获得的线性方程，计算获得待测样品溶液中四环素的含量。
9.上述基于铕掺杂碳量子点比率荧光探针的四环素检测方法中，所述铕掺杂碳量子点比率荧光探针，由以下方法制备而成：
10.取8.0～12mmol柠檬酸和0.2～0.3mmol三聚氰胺溶解在水中，然后添加0～1000μl
甲醛溶液和300～800mg eu(no3)3·
6h2o；溶液充分混合后，在180～220℃，反应5～10h；反应结束后冷却至室温，所得溶液通过过滤，透析，去除分子量小于1000da的小分子；干燥，即得铕掺杂碳量子点比率荧光探针粉末。
11.在一个具体的实施例中，所述甲醛溶液的浓度为8mmol/l。
12.在一个具体的实施例中，所述柠檬酸的用量为10mmol；所述三聚氰胺的用量为0.25mmol；所述eu(no3)3·
6h2o的用量为500mg；所述甲醛溶液的用量为560μl时，量子产率最高。
13.在一个具体的实施例中，所述步骤(1)中eu
‑
cds溶液的浓度为60μg
·
ml
‑1。
14.在一个具体的实施例中，所述步骤(5)中待测样品溶液与eu
‑
cds溶液的混合比例为1:1。
15.在一个具体的实施例中，所述四环素不同浓度梯度的标准溶液的浓度范围为0
‑
100μm。
16.在一个具体的实施例中，所述的透析是先采用0.22μm的过滤膜过滤，滤液采用切断分子量为1000da的透析袋在超纯水中透析24h，每隔6小时更新一次水以去除小分子。
17.本发明的目的之二在于提供一种用于检测四环素的纸基传感器，是将滤纸浸入铕掺杂碳量子点比率荧光探针的水溶液中；室温孵育培养一段时间后，干燥即得所述用于检测四环素的纸基传感器；
18.所述铕掺杂碳量子点比率荧光探针，由以下方法制备而成：
19.取8.0～12mmol柠檬酸和0.2～0.3mmol三聚氰胺溶解在水中，然后添加0～1000μl甲醛溶液和300～800mg eu(no3)3·
6h2o；溶液充分混合后，在180～220℃，反应5～10h；反应结束后冷却至室温，所得溶液通过过滤，透析，去除分子量小于1000da的小分子；干燥，即得铕掺杂碳量子点比率荧光探针粉末。
20.在一个具体的实施例中，铕掺杂碳量子点比率荧光探针的水溶液的浓度为60μg
·
ml
‑1。
21.所述的滤纸可以按照需求裁剪成不同的形状，本领域技术人员应当理解滤纸的形状不会影响检测结果；在一个具体的实施例中，是将滤纸裁剪成直径为6mm的圆形。
22.在一个具体的实施例中，所述的室温孵育为室温孵育培养10min。
23.本发明的目的之三在于提供上述用于检测四环素的纸基传感器在智能手机作为信号读取器的四环素检测方法中的应用。
24.本发明的目的之四在于提供一种智能手机作为信号读取器的四环素检测方法，步骤如下：
25.(1)将不同浓度的四环素标准溶液添加到上述纸基传感器表面；
26.(2)在智能手机上下载安装颜色扫描应用程序；
27.(3)用智能手机上的颜色扫描应用程序记录步骤(1)中的纸基传感器在365nm紫外灯下的荧光颜色，并对纸基传感器的荧光颜色进行数字化和输出，获得r g b值；用r/b作为纵坐标，四环素的浓度作为横坐标，获得四环素浓度与r/b的线性方程；
28.(4)将待测样品溶液添加到上述的纸基传感器表面；
29.(5)用智能手机上的颜色扫描应用程序记录步骤(4)的纸基传感器在365nm紫外灯下的荧光颜色，并对纸基传感器的荧光颜色进行数字化和输出，获得r g b值；计算r/b；将
r/b的数值代入步骤(3)获得的线性方程，计算获得待测样品溶液中四环素的含量。
30.以上关于原料用量的表述，仅为实验室的操作用量，而不是对其用量的绝对限定，本领域技术人员应当理解，在实际生产中，可以根据生产规模，按照上述比例调整用量。
31.本发明用于检测四环素的方法适用于水溶液等基质样品，例如水体、牛奶；固态的样品可以制备成水溶液的形式，或经过滤去除不溶于水的成分后进行检测。
32.上述步骤(1)和(4)中，不同浓度的四环素标准溶液或待测样品溶液在纸基传感器上的添加量，可以根据用来制备纸基传感器的试纸片的大小进行调整；在本发明一个具体的实施例中，试纸片的大小为直径6mm的圆片形，不同浓度的四环素标准溶液或待测样品溶液在试纸片上的添加量为200μl/片。
33.本发明提供的铕掺杂碳量子点的制备及其检测四环素的原理为：将铕离子掺杂到碳量子点的晶格结构中作为tc的特定识别单元。未加入四环素时，铕掺杂碳量子点发蓝色荧光(λem＝420nm)。与四环素结合后，基于内部过滤效应(ife)和eu
3+
‑
tc的“天线效应”，碳量子点的蓝色荧光逐渐淬灭，掺杂铕元素的特征红色荧光逐渐增强(λem＝620nm)，产生基于四环素含量的比率荧光信号变化。相应地，检测体系在紫外灯下的颜色逐渐从蓝色到棕黄色到浅紫色到浅玫瑰红色到浅粉色到最终的红色，发生显著的变化。
34.本发明技术方案的优点：
35.通过一步水热法制备了铕掺杂碳量子点比率荧光探针。将铕离子掺杂到碳量子点中，既能保持碳量子点本身的蓝色荧光，又能与四环素分子特异性结合增强铕离子的红色荧光，产生比率荧光信号和颜色的显著渐变。这种新型荧光探针，具有优异的物理和化学稳定性，不需要复杂的碳量子点修饰，通过单一的碳量子点就可以实现对目标分子的比率荧光检测，在紫外灯下用肉眼可以观察到碳量子点颜色逐渐从蓝色到棕黄色到浅紫色到浅玫瑰红色到浅粉色到最终红色的显著变化。
36.此外，还开发了一种无需仪器的便携式纸基传感器和智能手机辅助的poct平台，用于四环素的现场可视化检测。研制的纸基传感器，具有易于携带、低成本、高选择性和高灵敏度特点，可以用肉眼直接、轻松地读出检测信号。智能手机作为简单答案分析仪，具有便携、易操作的特点。当tc的浓度超过一定水平时，肉眼可见的直接颜色变化警告用户，进一步手机辅助图像处理可提供四环素浓度的定量分析。为现场和资源贫乏地区四环素的定性鉴别和半定量分析提供了强有力的方法。在食品安全监测中显示出巨大的潜在应用。不仅为四环素的比率荧光和视觉传感提供了一种新的策略，而且为开发高效的比率荧光和视觉传感平台提供了新的见解，它在未来很有希望用于许多其他现场检测。
附图说明
37.图1铕掺杂碳量子点比率荧光探针的tem分析图和hrtem图；
38.图2 eu
‑
cds的x射线光电子能谱(xps)图；
39.图3铕掺杂浓度对eu
‑
cds
‑
tc复合物的荧光光谱的影响；
40.图4不同浓度tc对eu
‑
cds荧光强度影响的荧光光谱图；
41.图5铕掺杂碳量子点比率荧光探针检测四环素的线性方程；
42.图6铕掺杂碳量子点比率荧光探针对四环素的特异性；
43.图7基于铕掺杂碳量子比率荧光探针结合智能手机和纸基传感器检测四环素的线
性方程。
具体实施方式
44.在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
45.下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
46.实施例1
47.一种铕掺杂碳量子点比率荧光探针的制备方法，步骤如下：
48.称取1920mg(10.0mmol)柠檬酸和31.5mg(0.25mmol)三聚氰胺溶解在10ml超纯水中，然后添加560μl甲醛溶液(甲醛浓度为8.0mmol/l)和500mg eu(no3)3·
6h2o(99.99％)。将溶液充分混合，转移到25ml聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在220℃的温度下反应10h小时，冷却至室温后，所得深黄色溶液通过0.22μm的过滤膜过滤并用透析袋(切断分子量为1000da)在超纯水中进一步透析24小时，每隔6小时更新一次水以去除小分子。随后，通过蒸发透析袋内的溶液并在80℃下干燥，获得铕掺杂碳量子点比率荧光探针的粉末，量子产率为10.81％。
49.图1为上述方法制备的铕掺杂碳量子点比率荧光探针(eu
‑
cds)的透射电镜(tem)图和高分辨透射电镜(hrtem)图。由图1中的a可知，eu
‑
cds为均匀分布的近球形纳米颗粒，eu
‑
cds粒径分布柱状图显示粒径分布为1.0
‑
3.0nm，平均粒径为2.0nm。hrtem图像(图1中b)显示eu
‑
cds具有清晰的晶格条纹，晶格间距约为0.20nm，这与石墨碳的(100)面一致。
50.为了进一步确认eu
‑
cds的元素组成和化学键，进行了x射线光电子能谱(xps)测量。图2为eu
‑
cds的xps图，其中，a为eu
‑
cds的xps全扫描光谱，b为c1s的xps光谱，c为n1s的xps光谱，d为o1s的xps光谱，e为eu3d的xps光谱；
51.由图2可知，xps全扫描光谱在281.08,398.08,537.08和1131.08ev处显示四个明显的峰，归因于c1s、n1s、o1s和eu3d，元素含量分别为60.11％,2.99％,33.03％和3.87％。高含量的eu证实了eu在cds中的成功掺杂(图2中a)。在高分辨率光谱中(图2b
‑
e)，c1s波段可以在284.7,285.7和288.4ev处反褶积成三个峰值，分别对应于c
‑
c/c＝c，c
‑
n/c
‑
o和c＝o基团；在n1s光谱中，399.9和401.5ev处的峰对应于n
‑
c和n
‑
h基团；o1s波段在531.2，532.0和532.9ev，可以反褶积成三个峰值，分别归属于c＝o和c
‑
oh基团。eu3d在1134.0和1164.0ev分别归因于3d
5/2
和3d
3/2
结构的光电发射。高分辨率eu3d光谱由四个峰组成，分别为eu
3+
(1165.0和1135.4ev)和eu
2+
(1155.0和1125.5ev)。
52.实施例2
53.一种铕掺杂碳量子点比率荧光探针的制备方法，步骤如下：
54.称取1536mg(8.0mmol)柠檬酸和25.2mg(0.2mmol)三聚氰胺溶解在10ml超纯水中，然后添加300mg eu(no3)3·
6h2o(99.99％)。将溶液充分混合，转移到25ml聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在220℃的温度下反应10h小时，冷却至室温后，所得深黄色溶液通过0.22μm的过滤膜过滤并用透析袋(切断分子量为1000da)在超纯水中进一步透析24小时，每隔6小时更新一次水以去除小分子。随后，通过蒸发透析袋内的溶液并在80℃下干燥，获得铕掺杂碳量子点比率荧光探针的粉末，量子产率为7.50％。
55.实施例3
56.一种铕掺杂碳量子点比率荧光探针的制备方法，步骤如下：
57.称取2304mg(12.0mmol)柠檬酸和37.8mg(0.3mmol)三聚氰胺溶解在10ml超纯水中，然后添加1000μl甲醛溶液(甲醛浓度为8.0mmol/l)和800mg eu(no3)3·
6h2o(99.99％)。将溶液充分混合，转移到25ml聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在220℃的温度下反应10h小时，冷却至室温后，所得深黄色溶液通过0.22μm的过滤膜过滤并用透析袋(切断分子量为1000da)在超纯水中进一步透析24小时，每隔6小时更新一次水以去除小分子。随后，通过蒸发透析袋内的溶液并在80℃下干燥，获得铕掺杂碳量子点比率荧光探针的粉末，量子产率为9.02％。
58.实施例4
59.铕掺杂浓度对eu
‑
cds
‑
tc复合物的荧光光谱的影响
60.在实施例1的方法的基础上，设置eu(no3)3·
6h2o掺杂浓度分别为300mg、500mg和800mg，制备不同eu(no3)3·
6h2o掺杂浓度的eu
‑
cds；并检测其在加入tc后的荧光光谱，结果如图3所示，从荧光强度曲线和荧光强度照片可以看出，荧光光谱显示出强烈的掺杂浓度依赖性，随着eu掺杂浓度从300mg提高到500mg，eu
‑
cds
‑
tc的荧光强度增强幅度变大；eu掺杂浓度超过500mg以后，由于新产生的缺陷和减少的表面钝化可导致荧光强度降低，eu掺杂浓度800mg的荧光强度增强幅度反而低于500mg eu掺杂的样品；因而，与其他掺杂浓度相比，500mg掺杂的eu
‑
cds在与tc作用后产生了最高的荧光强度增强。因此，500mg的eu掺杂浓度为最佳浓度。
61.实施例5
62.一种检测四环素的方法，步骤如下：
63.(1)将实施例1制备的铕掺杂碳量子点比率荧光探针制备成浓度为60μg
·
ml
‑1的水溶液，即为eu
‑
cds溶液；
64.(2)取步骤(1)制备的eu
‑
cds溶液，向其中加入不同量的四环素，将其制备成四环素不同浓度梯度的标准溶液，其中四环素的浓度为0
‑
100μm；混合均匀后，于室温条件下培养5min；
65.(3)采用荧光光谱法在380nm的激发下记录四环素不同浓度梯度的标准溶液的发射光谱；结果如图4所示；从图4可以看出随着四环素浓度的增加，eu
‑
cds体系在468nm处的荧光强度明显下降，而在620nm处的荧光强度逐渐增加。当四环素浓度高于80μm时，f
468
处于猝灭状态，但f
620
不再增加并开始下降。
66.(4)将得到的实验数据整理作图，以i
620
/i
468
的强度比作为纵坐标，tc浓度作为横坐标，获得线性方程如图5所示，线性关系式为y＝0.0630x
‑
0.242；线性相关系数r2＝0.999。
67.(5)将待测样品溶液与步骤(1)制备的eu
‑
cds溶液按照1:1比例混合，于室温条件下培养5min；采用荧光光谱法在380nm的激发下，获得待测溶液的468nm和620nm处的荧光强度，计算i
620
/i
468
的强度比，对照步骤(4)获得的标准曲线，计算获得待测样品溶液中四环素的含量。
68.上述检测四环素的方法稳定性良好，重复性高，检出限为6.9nm。
69.铕掺杂碳量子点比率荧光探针对四环素的特异性：
70.将相同浓度(100μm)的四环素(tetracycline)及其类似物(土霉素oxytetracycline、金霉素chlortetracycline、红霉素erythromycin)溶液分别与等体积的步骤(1)制备的eu
‑
cds溶液混合，在室温下培养5分钟后，采用荧光光谱法在380nm的激发下记录混合物的发射光谱。如图6所示，只有四环素可以引起eu
‑
cds在468nm处的荧光猝灭，并在620nm处产生很强的新的荧光发射峰。
71.实施例6
72.一种基于铕掺杂碳量子点比率荧光探针结合智能手机和纸基传感器检测四环素的方法，步骤如下：
73.(1)将实施例1制备的铕掺杂碳量子点比率荧光探针制备成浓度为60μg
·
ml
‑1的水溶液；
74.(2)将滤纸切割成直径约为6mm的圆形，然后浸入步骤(1)制备的eu
‑
cds(60μg
·
ml
‑1)溶液中；室温孵育培养10min后，室温条件下，在空气中干燥；获得用于检测四环素的纸基传感器；
75.(3)将不同浓度(0
‑
150μm)的tc水溶液添加到步骤(2)制备的圆形纸基传感器表面；添加量为200μl/片纸基传感器；
76.(4)在紫外灯下用肉眼观察圆形纸基传感器的荧光颜色变化。通过应用商店下载获得的颜色扫描应用程序(app:colorimeter)对纸基传感器的荧光颜色进行数字化和输出，获得r gb值；用得到实验数据(r/b)整理作图，获得线性方程(图7)，线性关系式为y＝0.049x
‑
0.219；线性相关系数r2＝0.998。
77.(5)将待测样品溶液添加到步骤(2)制备的纸基传感器表面；添加量为200μl/片纸基传感器；用智能手机上的颜色扫描应用程序记录纸基传感器在紫外灯下的荧光颜色，并对纸基传感器的荧光颜色进行数字化和输出，获得r g b值；计算r/b；将r/b的数值代入步骤(4)获得的线性方程，计算获得待测样品溶液中四环素的含量。
78.采用上述方法检测四环素的稳定性良好，重复性高，检出限为13.2nm。
79.综上，本发明合成的铕掺杂碳量子点比率荧光探针不仅为tc的比率荧光和视觉传感提供了一种新的策略，而且为开发高效的比率荧光和视觉传感平台提供了新的见解。
80.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。