通过双酚A暴露重置脑垂体稳态增加成年大鼠血清睾酮的测试方法

通过双酚a暴露重置脑垂体稳态增加成年大鼠血清睾酮的测试方法
技术领域：
：1.本发明涉及生物医药
技术领域：
：。
背景技术：
：：2.1981年，双酚a，即2,2-双(4-羟基苯基)丙烷，缩写为bpa，首次作为聚碳酸酯塑料制造单体合成。从那时起，它已被广泛用于各种消费品，包括与食品密切接触的产品，如塑料婴儿奶瓶、食品罐内衬和牙科修复材料。除了来自一般环境，也就是水、空气和土壤的潜在暴露外，bpa也可能直接通过受污染的食品进入人体。调查表明，90％的美国普通人群的尿液样本中可检测到bpa，平均血清浓度为2.5-10.95ng/ml。同时最近的一项研究发现，中国3至11岁儿童尿液中的总双酚含量在0.43至31.5ng/ml之间。3.目前有研究发现，双酚a被认为是一种内分泌干扰物，其作用类似于雌激素，并具有干扰雄激素合成的作用。双酚a对睾丸间质细胞发育的影响似乎取决于剂量和暴露时间。例如，子宫内暴露于高剂量(40-400mg/kgbw/day)的双酚a会抑制胎儿睾丸间质细胞和支持细胞的分化，并导致大鼠体内睾酮(t)的产生降低。然而，在新生小鼠第0-9天使用剂量高达97mg/kgbw的bpa不会影响成年的生殖功能，而在小鼠青春期，即出生后第21-35天，使用极低剂量(2.4μg/kgbw/day)的bpa暴露会降低35天时的血清lh和t水平。此外，从妊娠第12天到出生后第21天的双酚a暴露，成年后睾丸间质液中的t水平降低，这意味着围产期是bpa暴露的敏感时期，成年大鼠直接暴露于双酚a两周也会降低睾丸重量和t水平，这意味着双酚a不仅会影响睾丸间质细胞的发育，还会影响其功能。尽管如此，大多数研究使用相对较高剂量的双酚a(1-100毫克/千克体重/天)，但是不清楚双酚a作用的潜在机制，也没有很好的检测方法进行检测，并且睾丸间质细胞对于男性生殖系统的发育和男性生殖功能的维持至关重要。在大鼠中，成年睾丸间质细胞(alc)由青春期的睾丸间质干细胞(slc)发育而来，经过4个发育阶段：slc、plc(祖细胞lc)、ilc(未成熟lc)和alc，成年鼠每个睾丸中总共形成了约2500万个alc。出生后21-35天，是plc向ilc发展的时期，也是alc发育中最关键的阶段之一，也是bpa暴露最敏感的阶段。然而，在这一阶段，bpa暴露的长期影响以及研究机理还不清楚，目前没有很好的判断研究方式。技术实现要素：4.针对现有技术的不足，本发明提供了一种通过双酚a暴露重置脑垂体稳态增加成年大鼠血清睾酮的测试方法，通过该方法可以对双酚a对睾丸间质细胞发育影响的机理进行研究判断，同时步骤简单高效。5.为实现上述目的，本发明提供了一种通过双酚a暴露重置脑垂体稳态增加成年大鼠血清睾酮的测试方法，包括以下步骤，6.步骤一，将sd大鼠置于23±2℃的恒温、55±5％的恒湿环境中，进行12小时的光/暗循环，并允许sd大鼠自由获取食物和水，将bpa溶解在乙醇中，然后稀释在生育酚剥脱玉米油中，直至乙醇的最终浓度为0.5％，用于胃内给药；将sd大鼠随机分为三组，分别设置为对照组、低剂量组和高剂量组，每组8只，从出生后第21天开始，每天分别灌胃0、0.1或10mg/kgbw剂量的bpa，持续14天；在出生第56天处死sd大鼠；收集干血，在4℃下以250g的转速离心15min，以收集血清，并在-80℃下储存；将其中一个睾丸浸入液氮中冷冻，并在-80℃下保存；将另一个睾丸固定在4％多聚甲醛中；7.步骤二，使用2000试剂盒，通过免疫化学发光法测定血清t水平；采用酶联免疫吸附试验(elisa)试剂盒测定血清黄体生成素(lh)、卵泡刺激素(fsh)、双氢睾酮(dht)、生长激素(gh)和胰岛素样生长因子1(igf-1)的浓度；t、lh、fsh、dht、gh和igf-1试剂盒的灵敏度分别为0.15ng/ml、0.2miu/ml、0.1miu/ml、0.5pg/ml、0.1ng/ml和3ng/ml；8.步骤三，通过定量pcr(qpcr)检测睾丸间质细胞类固醇合成基因和支持细胞标记基因的转录水平，使用微型试剂盒从睾丸中提取总rna，使用nanodropnd-1000测量rna的数量和纯度，然后通过逆转录系统合成cdna；在含有7.5ul480greenimaster、0.75ul反向引物、0.75ul正向引物、10ul总量为1ng的rna和4ul去酶水的容器中进行pcr反应；将核糖体蛋白s16(rps16)作为qpcr结果的标准内参物；9.步骤四，用ripa裂解缓冲液对睾丸组织进行均质和裂解获得总蛋白样品，使用增强型bca蛋白质分析试剂盒测量蛋白质浓度，取60μg总蛋白样品，在含有10％十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上；用含5％bsa的tbst封闭2h后，在4℃下将聚偏氟乙烯膜与一抗一起培育过夜；然后，将聚偏氟乙烯膜与山羊抗小鼠igg(h+l)hrp结合物或山羊抗兔igg(h+l)在室温下培育2小时；通过imagej软件进行蛋白质条带密度分析，将β-肌动蛋白作为内部对照值；10.步骤五，选择cyp11a1作为识别睾丸间质细胞的生物标记物，先将睾丸固定，在乙醇和二甲苯中梯度脱水，将各sd大鼠睾丸切成4部分后包埋于石蜡块中，然后在每个睾丸中随机取相同大小的部分作为组织阵列包埋在石蜡中，切割获得横截面厚度为5微米的切片，并将切片粘附在载玻片上；完成脱蜡和复水后，用含10％h2o2的甲醇孵育10min以阻断内源性过氧化物酶，用pbs冲洗切片；切片在ph6.0的0.01m柠檬酸钠中加热，并在室温下冷却；用二抗宿主血清进行封闭后，切片在4℃下与cyp11a1兔克隆抗体孵育过夜，用pbs洗涤，然后在室温下与dylight488山羊抗兔igg(h+l)孵育1小时；在用pbs洗涤后，向切片中添加含有dapi的抗荧光淬灭剂，以显示胞质为绿色的cyp11a1阳性细胞和蓝色细胞核；11.步骤六，采用lcbiotechnologyco对对照组和低剂量组的睾丸rna样本进行rna-seq分析；通过生物分析仪2100对完整性rin值》7.0的rna进行评估，并通过变性琼脂糖凝胶电泳进行确认；将片段化的rna通过逆转录酶的作用下合成cdna；序列由illuminaꢀꢀnovaseqtm6000平台完成匹配，采用r-package-edger软件包筛选差异倍数》1.5，p值《0.05的差异表达基因(degs)；采用基因本体(go)、京都基因和基因组百科全书(kegg)分析degs功能；12.步骤七，将10种不同睾丸细胞类型的100个最特异标记基因与degs对照；计算并比较10种不同睾丸细胞类型的匹配基因百分比。13.作为本发明的进一步设置，所述步骤三中，在用含10％h2o2的甲醇阻断内源性过氧化物酶后，用pbs冲洗切片3次，每次持续5min。14.作为本发明的进一步设置，所述步骤三中，切片在4℃下与cyp11a1兔克隆抗体培育过夜后，用pbs洗涤切片3次，每次5分钟。15.作为本发明的进一步设置，所述步骤三中还包括睾丸间质细胞的统计，在20x物镜下对每个区域中的cyp11a1阳性细胞进行计数，在至少四只sd大鼠的睾丸切片上统计多个区域。16.这样设置的有益效果是：这样设置的检测方法，通过bpa的暴露重置了成年sd大鼠的生长激素(gh)和卵泡刺激素(fsh)内稳态，并导致血清睾酮水平显著升高，但不影响血清促黄体生成素水平。在qpcr和westernbolt的实验显示bpa显著上调睾丸间质细胞类固醇合成途径中的选择性基因/蛋白质，包括类固醇生成急性调节蛋白、细胞色素p45011a1、细胞色素p45017a和低密度脂蛋白受体，通过睾丸的rna-seq分析表明bpa显著影响睾丸间质体细胞群体的基因，但不影响生殖细胞。此外，go和kegg分析表明与igf-1相关的pi3k/akt信号被激活，irs1、akt1和creb的磷酸化增加证实了这一点。通过这种测试方法，可以得出青春期短期低剂量的bpa暴露会影响成年雄性sd大鼠垂体(gh和fsh)和睾丸(睾酮)的稳态，并有效验证bpa对成年sd大鼠的作用机理。附图说明17.图1a为本发明实施例中不同浓度双酚a对血清睾酮激素水平影响的示意图；18.图1b为本发明实施例中不同浓度双酚a对血清dht影响的示意图；19.图1c为本发明实施例中不同浓度双酚a对血清lh影响的示意图；20.图1d为本发明实施例中不同浓度双酚a对血清fsh影响的示意图；21.图1e为本发明实施例中不同浓度双酚a对血清gh影响的示意图；22.图1f为本发明实施例中不同浓度双酚a对血清igf-1影响的示意图；23.图1g为本发明实施例中不同浓度双酚a对睾丸间质细胞数量影响的示意图；24.图2a为本发明实施例中不同浓度双酚a对cyp11a1基因表达的影响示意图；25.图2b为本发明实施例中不同浓度双酚a对cyp17a1基因表达的影响示意图；26.图2c为本发明实施例中不同浓度双酚a对star基因表达的影响示意图；27.图2d为本发明实施例中不同浓度双酚a对hsd3b1基因表达的影响示意图；28.图2e为本发明实施例中不同浓度双酚a对hsd17b3基因表达的影响示意图；29.图2f为本发明实施例中不同浓度双酚a对scarb1基因表达的影响示意图；30.图2g为本发明实施例中不同浓度双酚a对lhcgr基因表达的影响示意图；31.图2h为本发明实施例中不同浓度双酚a对akr1c14基因表达的影响示意图；32.图2i为本发明实施例中不同浓度双酚a对srd5a1基因表达的影响示意图；33.图2j为本发明实施例中不同浓度双酚a对sox9基因表达的影响示意图；34.图2k为本发明实施例中不同浓度双酚a对dhh基因表达的影响示意图；35.图3a为本发明实施例中每种蛋白质在不同浓度双酚a下的代表性蛋白质印迹示意图；36.图3b为本发明实施例中cyp11a1在不同浓度双酚a下的量化示意图；37.图3c为本发明实施例中cyp17a1在不同浓度双酚a下的量化示意图；38.图3d为本发明实施例中star在不同浓度双酚a下的量化示意图；39.图3e为本发明实施例中scarb1在不同浓度双酚a下的量化示意图；40.图3f为本发明实施例中lhcgr在不同浓度双酚a下的量化示意图；41.图3g为本发明实施例中hsd3b1在不同浓度双酚a下的量化示意图；42.图3h为本发明实施例中hsd17b3在不同浓度双酚a下的量化示意图；43.图3i为本发明实施例中insl3在不同浓度双酚a下的量化示意图；44.图3j为本发明实施例中sox9在不同浓度双酚a下的量化示意图；45.图3k为本发明实施例中dhh在不同浓度双酚a下的量化示意图；46.图3l为本发明实施例中srd5a1在不同浓度双酚a下的量化示意图；47.图4a为本发明实施例中6个样本的pca主成分分析图；48.图4b为本发明实施例中差异表达基因的热图；49.图4c为本发明实施例中差异表达基因的火山图；50.图4d为本发明实施例中585个degs与之前报道的睾丸细胞特异性标记基因的匹配列表图；51.图5a为本发明实施例中上调的差异表达基因的go分析图；52.图5b为本发明实施例中上调的差异表达基因的kegg分析图；53.图6为本发明实施例中的类固醇合成相关的信号通路图；54.图7a为本发明实施例中每种蛋白质在不同浓度双酚a下的代表性蛋白质印记表达图；55.图7b为本发明实施例中irs1蛋白在不同浓度双酚a下的westernblot结果量化图；56.图7c为本发明实施例中akt1蛋白在不同浓度双酚a下的westernblot结果量化图；57.图7d为本发明实施例中creb蛋白在不同浓度双酚a下的westernblot结果量化图；58.图7e为本发明实施例中p-irs1蛋白在不同浓度双酚a下的westernblot结果量化图；59.图7f为本发明实施例中p-akt1蛋白在不同浓度双酚a下的westernblot结果量化图；60.图7g为本发明实施例中p-creb蛋白在不同浓度双酚a下的westernblot结果量化图；61.图7h为本发明实施例中p-irs1/irs1在不同浓度双酚a下的westernblot结果量化图；62.图7i为本发明实施例中p-akt1/akt1在不同浓度双酚a下的westernblot结果量化图；63.图7j为本发明实施例中p-creb/creb在不同浓度双酚a下的westernblot结果量化图；具体实施方式64.本发明通过双酚a暴露重置脑垂体稳态增加成年大鼠血清睾酮的测试方法的实施例：包括以下步骤，65.步骤一，将sd大鼠置于23±2℃的恒温、55±5％的恒湿环境中，进行12小时的光/暗循环，并允许sd大鼠自由获取食物和水，将bpa溶解在乙醇中，然后稀释在生育酚剥脱玉米油中，直至乙醇的最终浓度为0.5％，用于胃内给药；将sd大鼠随机分为三组，分别设置为对照组、低剂量组和高剂量组，每组8只，从出生后第21天开始，每天分别灌胃0、0.1或10mg/kgbw剂量的bpa，持续14天；在出生第56天处死sd大鼠；收集干血，在4℃下以250g的转速离心15min，以收集血清，并在-80℃下储存；将其中一个睾丸浸入液氮中冷冻，并在-80℃下保存；将另一个睾丸固定在4％多聚甲醛中；66.步骤二，使用2000试剂盒，通过免疫化学发光法测定血清t水平；采用酶联免疫吸附试验(elisa)试剂盒测定血清黄体生成素(lh)、卵泡刺激素(fsh)、双氢睾酮(dht)、生长激素(gh)和胰岛素样生长因子1(igf-1)的浓度；t、lh、fsh、dht、gh和igf-1试剂盒的灵敏度分别为0.15ng/ml、0.2miu/ml、0.1miu/ml、0.5pg/ml、0.1ng/ml和3ng/ml；67.步骤三，通过定量pcr(qpcr)检测睾丸间质细胞类固醇合成基因和支持细胞标记基因的转录水平，使用微型试剂盒从睾丸中提取总rna，使用nanodropnd-1000测量rna的数量和纯度，然后通过逆转录系统合成cdna；在含有7.5ul480greenimaster、0.75ul反向引物、0.75ul正向引物、10ul总量为1ng的rna和4ul去酶水的容器中进行pcr反应；将核糖体蛋白s16(rps16)作为qpcr结果的标准内参物；68.步骤四，用ripa裂解缓冲液对睾丸组织进行均质和裂解获得总蛋白样品，使用增强型bca蛋白质分析试剂盒测量蛋白质浓度，取60μg总蛋白样品，在含有10％十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上；用含5％bsa的tbst封闭2h后，在4℃下将聚偏氟乙烯膜与一抗一起培育过夜；然后，将聚偏氟乙烯膜与山羊抗小鼠igg(h+l)hrp结合物或山羊抗兔igg(h+l)在室温下培育2小时；通过imagej软件进行蛋白质条带密度分析，将β-肌动蛋白作为内部对照值；69.步骤五，选择cyp11a1作为识别睾丸间质细胞的生物标记物，先将睾丸固定，在乙醇和二甲苯中梯度脱水，将各sd大鼠睾丸切成4部分后包埋于石蜡块中，然后在每个睾丸中随机取相同大小的部分作为组织阵列包埋在石蜡中，切割获得横截面厚度为5微米的切片，并将切片粘附在载玻片上；完成脱蜡和复水后，用含10％h2o2的甲醇孵育10min以阻断内源性过氧化物酶，用pbs冲洗切片；切片在ph6.0的0.01m柠檬酸钠中加热，并在室温下冷却；用二抗宿主血清进行封闭后，切片在4℃下与cyp11a1兔克隆抗体孵育过夜，用pbs洗涤，然后在室温下与dylight488山羊抗兔igg(h+l)孵育1小时；在用pbs洗涤后，向切片中添加含有dapi的抗荧光淬灭剂，以显示胞质为绿色的cyp11a1阳性细胞和蓝色细胞核；70.步骤六，采用lcbiotechnologyco对对照组和低剂量组的睾丸rna样本进行rna-seq分析；通过生物分析仪2100对完整性rin值》7.0的rna进行评估，并通过变性琼脂糖凝胶电泳进行确认；将片段化的rna通过逆转录酶的作用下合成cdna；序列由illuminaꢀꢀnovaseqtm6000平台完成匹配，采用r-package-edger软件包筛选差异倍数》1.5，p值《0.05的差异表达基因(degs)；采用基因本体(go)、京都基因和基因组百科全书(kegg)分析degs功能；71.步骤七，将10种不同睾丸细胞类型的100个最特异标记基因与degs对照；计算并比较10种不同睾丸细胞类型的匹配基因百分比。72.作为本发明的进一步设置，所述步骤三中，在用含10％h2o2的甲醇阻断内源性过氧化物酶后，用pbs冲洗切片3次，每次持续5min。73.作为本发明的进一步设置，所述步骤三中，切片在4℃下与cyp11a1兔克隆抗体培育过夜后，用pbs洗涤切片3次，每次5分钟。74.作为本发明的进一步设置，所述步骤三中还包括睾丸间质细胞的统计，在20x物镜下对每个区域中的cyp11a1阳性细胞进行计数，在至少四只sd大鼠的睾丸切片上统计多个区域。75.为了研究双酚a对动物整体生长的影响，按35和56天的年龄记录体重,如下表s1。76.supplementalmaterialtables1:animalbodyweightandtestisweight[0077][0078][0079]mean±sem,n＝6,*significantlydifferentfrom0.1mg/kgdosegroupatp《0.05.[0080]在暴露于bpa的后第35天，体重没有发现差异，而在低剂量bpa组中，成年sd大鼠在第56天的体重略有轻微增加，增加了约8％。高剂量组体重明显低于低剂量组，p＜0.05。除此之外，在整个实验过程中，sd大鼠都是健康的，没有其他异常体征。此外，睾丸重量没有发现差异。[0081]为了评估在青春期暴露于双酚a对成年sd大鼠生殖功能的潜在影响，分析了主要生殖激素的血清水平，如图1所示。如图1a可以看出0.1mg/kg剂量的bpa显著增加了t水平,但是对其直接代谢产物dht水平没有影响,如图1b所示；进一步的，检查t水平的升高是否与促性腺激素的变化有关，实验方法中测量了血清lh和fsh水平，从图1c-d可以高低两种剂量的bpa都能显著降低fsh，而任何剂量的bpa都不会显著影响lh，这表明血清t的增加不太可能是由于垂体促性腺激素的增加，与之相反的，lh的轻度和不显著降低是由于血清t增加的反馈抑制；除生殖激素外，如图1e所示，低剂量bpa也增加了血清gh水平，而不影响igf-1水平，见图1f。[0082]进一步的，cyp11a1是鉴定成年sd大鼠睾丸间质细胞的最佳标记物之一，通过cyp11a1染色可以定量alc的数量。通过测试发现，双酚a处理对成年sd大鼠睾丸中cyp11a1阳性间质细胞数量没有显著影响。[0083]进一步的，通过试验操作，认为血清t水平升高表示睾丸间质细胞类固醇合成功能可能发生改变，为了证实在青春期双酚a的暴露是否确实影响成年sd大鼠睾丸间质细胞和支持细胞的功能，通过qpcr分析了睾丸间质细胞类固醇合成基因，包括cyp11a1、cyp17a1、star、hsd3b1、hsd17b3、lhcgr、scarb1、akr1c14和srd5a1，以及支持细胞的标记基因dhh和sox9，如图2所示。bpa在0.1mg/kg剂量下特异性上调cyp11a1、cyp17a1和star的表达水平，如图2a-k所示，在低剂量下显著下调sox9的表达水平，而不影响其他基因。通过测试可以得出，高水平血清t是由于一些关键的类固醇合成蛋白的特异性变化所致的。[0084]为了进一步研究bpa如何影响类固醇生成，通过westernblot分析了主要的类固醇合成蛋白，如图3所示，与mrna水平的变化一致，0.1mg/kg剂量的bpa也显著增加了cyp11a1、cyp17a1和star的蛋白质水平；其中，star是受影响最显著的蛋白质，此外，其他的类固醇生成蛋白与rna的变化水平一致，通过测试还可以表明，两种剂量的bpa都显著降低了sox9蛋白水平，而不影响dhh。进一步的，采用rna-seq技术分析了对照组和低剂量bpa组的睾丸总rna，以研究bpa暴露如何影响睾丸细胞的整体转录。两组每个样本均检测到约32k个独特转录本；主成分分析(pca)显示，来自对照组和bpa组的样本分别聚集成2个可区分的组，如图4a，表明低剂量bpa显著影响整个睾丸细胞转录组，以p《0.05和比率》1.5倍为筛选标准，试验中鉴定出了585个差异表达基因(degs)，其中，512个上调，73个下调，可以从热图(图4b)和火山图(图4c)中清楚地看到。s2和s3列出了前50个上调和下调degs。[0085]supplementalmaterialtables2:top50differentiallyup-regulatedgenesbybpa[0086][0087][0088]supplementalmaterialtables3:top50differentiallydown-regulatedgenesbybpa[0089][0090][0091]在该方法中，由于rna-seq是用整个睾丸的rna进行的检测，因此很难知道哪些睾丸细胞负责检测到的degs，为了确定可能发生差异表达的特定细胞类型，通过现有技术，即单细胞rna-seq研究(green等人，2018年)，将确定的10种睾丸细胞类型的前100个标记基因与当前研究检测到的degs进行对比，如图4d，大多数degs与间质室的体细胞群相匹配，几乎没有与生精小管内的细胞相匹配。与每种细胞类型的前100个标记基因相匹配的degs数量分别为：睾丸间质细胞26个、间充质细胞25个、血管内皮细胞23个、淋巴细胞12个、巨噬细胞16个和平滑肌/肌样细胞15个，很少或没有基因与支持细胞、精原细胞、精母细胞以及精子细胞匹配，他们的数量仅为支持细胞4个、精原细胞1个、精母细胞0个或精子细胞0个。从而进一步论证，bpa特异性地影响了间质室的睾丸体细胞群。[0092]进一步的，通过该方法，对上调的差异表达基因的go分析显示，degs在细胞外空间、类固醇生物合成过程、igf相关生物过程、细胞周期调节和内皮细胞形态等过程发生了富集，由图5a可见。其中igf相关过程出现4次，表明其重要性。通过degs的kegg分析可以看出类固醇生成、自身免疫性甲状腺疾病、皮质醇合成、胆固醇代谢、jak/stat信号通路和pi3k/akt信号通路的富集，如图5b。[0093]总的来说，go和kegg分析都表明bpa主要影响细胞分泌、细胞膜成分、胆固醇代谢和类固醇生成。通过图6可以看出涉及类固醇生成的详细成分；其涉及的主要信号通路是igf-1/jak-stat/pi3k-akt和lhcgr/g-stimulating蛋白/腺苷酸环化酶(ac)。[0094]进一步的，为了证实pi3k/akt信号通路确实被激活，该方法通过测试该通路关键成分的磷酸化来进一步分析该通路，如图7所示。低剂量bpa可显著上调胰岛素受体底物-1(irs1)、akt1和camp反应元件(cre)结合蛋白(creb)3个关键成分的磷酸化，而不影响其总蛋白水平。通过这些结果可以体现，青春期暴露于bpa可显著重置成人pi3k/akt信号通路的基础活性，这可能在成年睾丸间质细胞依赖bpa增加类固醇合成中起主要作用，从而解释bpa的作用机理。[0095]以上实例，只是本发明优选地具体实例的一种，本领域技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都包含在本发明的保护范围内。当前第1页12当前第1页12