用于膀胱癌诊断的多联ELISA试剂盒

用于膀胱癌诊断的多联elisa试剂盒
技术领域
1.本发明是一种用于膀胱癌诊断的多联elisa试剂盒，所用方法是双抗体夹心酶联免疫法以及生物素－亲和素生物反应放大系统，属于免疫学检测邻域。


背景技术：

2.膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是世界范围内常见恶性肿瘤，在男性全身肿瘤中发病率居第7位。一般来说，膀胱癌在中后期才能被诊断出来，约75％为非肌层浸润型膀胱癌，5年生存率为88％-98％，而肌层浸润型膀胱癌5年生存率仅46％-63％，且超过70％患者经治疗后仍会复发，给患者带来了巨大的身心伤害。因此，对膀胱癌患者的早期诊断至关重要。
3.膀胱癌的传统诊断手段很多，目前早期诊断方法主要有临床表现、尿脱落细胞学检查、光学成像、肿瘤标志物检测、影像学检查、膀胱镜检查活检、诊断性电切术后行病理学检查等。在临床中，膀胱镜检查是膀胱癌诊断的金标准，但这种方法具有一定的侵入性，操作复杂，并且在膀胱癌的早期诊断中，灵敏度和特异性较低，容易出现较高的假阳性率。且膀胱镜是有创操作，属侵入性检查,病人较为痛苦,在患者存在泌尿系统感染时不宜行此操作，甚至膀胱镜检查本身有导致泌尿系统感染的可能性。
4.膀胱癌的发生会对血液和尿液的成分产生直接影响，因此非侵入性的液体活检将为膀胱癌的早期诊断带来新的检测方法。液体活检是一种具有非常好的发展前景的膀胱癌生物标志物检测方法，它可以对多种生物标志物联合分析检测，进一步提高检测结果的灵敏度和特异性。液体活检具有较高的效率，检测时间一般在几分钟之内，可以实现对肿瘤标志物的快速检测。除此之外，液体活检还容易实现便携化，已经被广泛应用于疾病诊断，具有非常好的应用前景。近年来随着分子生物学的发展，膀胱癌分子生物学诊断方面有了重大的进步，为膀胱癌液体活检技术提供了有力的支持。
5.膀胱肿瘤抗原是近年来临床中研究最多的膀胱癌肿瘤标志物之一。膀胱肿瘤细胞可以降解膀胱基底膜，形成基底膜复合物，这些降解产物被排到膀胱中,就形成了膀胱肿瘤抗原(bladder tumor antigen，bta)，又称为补体因子h相关蛋白(human complement factor h related protein，hcfhrp)。目前fda批准的有两种bta检测试剂，bta-stat和bta-trak，研究显示其中bta-stat的敏感性和特异性分别是64％，77％，bta-trak的灵敏度与特异度分别为65％，74％。因此bta是一种非常有潜力的肿瘤标志物。
6.存活素(survivin)蛋白，是分子量为16.5kd的一种胞浆蛋白，是凋亡抑制蛋白家族中抗凋亡活性最强的蛋白，它在人的各种恶性肿瘤组织中如胃癌、前列腺癌等表达高，在分化差的组织中表达更加明显，而在正常细胞及组织中不表达，survivin可直接作用caspase,主要通过抑制caspase-3，-7而阻断细胞凋亡。生存素在膀胱癌组织中的表达水平高于癌旁组织，随着肿瘤分级和分期的增加，其表达水平也相应增加。研究表明，肌层浸润性膀胱癌生存素的表达发生率高于非肌层浸润性膀胱癌，低分化肿瘤中生存素的表达发生率高于中分化肿瘤，这提示生存素的表达与肿瘤分期和分级密切相关，对膀胱肿瘤的早期
诊断是一个非常重要的参考指标。
7.cd44是在细胞之间、细胞的粘附和迁移过程中起作用的一种糖蛋白，参与了多种细胞功能，通常在许多肿瘤的发生、发展以及转移的过程中伴随着cd44的异常表达。研究发现，膀胱肿瘤患者尿液中cd44的水平明显超过了健康志愿组，正常人的尿路上皮中cd44少量表达，当尿路上皮发生早期恶变时，cd44的表达会逐渐增加，之后又随着肿瘤发展侵袭，cd44表达又逐渐减少，其敏感性可达到81.1％，而特异性接近100％，因此，cd44是膀胱癌早期诊断的一个重要指标。
8.bta、cd44和survivin已有文献报道与膀胱癌的诊断相关，但3者联合检测膀胱癌还未见报道。目前已公开的与膀胱癌诊断相关的试剂盒多以血液或血清为检测物，尿液中肿瘤标志物检测膀胱癌还未见报道。


技术实现要素：

9.针对现有技术中存在的问题和不足，本发明提供了一种用于膀胱癌诊断的多联elisa试剂盒，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、性能稳定的特点。
10.本发明所采取的技术方案是：尿样中bta、survivin和cd44三种蛋白的联合诊断的组合在用于膀胱癌诊断的多联elisa试剂盒中的应用。
11.用于膀胱癌诊断的多联elisa试剂盒包括酶标板、标准品、稀释瓶、洗涤液、链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶工作液、生物素标记的第二抗体，显色液和终止液。所述样品稀释液为含有1％(w/v)bsa的pbst(磷酸盐吐温)缓冲液；所述显色液液由显色液a和显色液b组成，所述显色液a为0.02％(w/v)tmb(3,3’,5,5
’‑
四甲基联苯胺)，所述显色液b为0.006％(w/v)过氧化脲；所述终止液为2mol/l的硫酸；所述洗涤液为含0.2％吐温-20的pbst(磷酸盐-吐温)缓冲液。
12.用于膀胱癌诊断的多联elisa试剂盒，所述的第二抗体与生物素偶联，有放大反应的作用。
13.用于膀胱癌诊断的多联elisa试剂盒，所述的标记物为与链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶。
14.用于膀胱癌诊断的多联elisa试剂盒，内含三块已经包被的96孔酶标板，分别包被有第一抗人bta、第一抗人cd44和第一抗人survivin，孔板可拆卸。使用时必须同时使用三块板，可根据样本数目选择板条数。
15.用于膀胱癌诊断的多联elisa试剂盒，检测样本为人的尿液样本。
16.与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：
17.(1)当前市面上的试剂盒多是以一种指标作为检测对象，单一的标记物很难同时达到较高的灵敏度和特异性来检测膀胱癌的发生，而本发明制备的用于膀胱癌诊断的多联elisa试剂盒可同时检测尿液样品中survivin、cd44和bta这3种蛋白的表达水平，与单一标志物检测相比，三者联合检测，检出成功率高，技术重现性好，且对于膀胱癌诊断的敏感度为96.8％特异性为80.0％，能够对膀胱癌患者的早期诊断和治疗提供临床参考价值。
18.(2)本发明提供的用于早期膀胱癌诊断的多联elisa试剂盒，以尿液作为检测对象，而市面上用于膀胱癌诊断的试剂盒多以血清、血浆或组织匀浆作为检测对象，而血浆或血清中蛋白的含量较多，可能会对检测过程产生干扰，造成假阳性或假阴性，导致检测结果
的不准确。而与血清标志物相比，尿液标志物有更多优势，尿液容易收集、可反复检测，又与膀胱直接接触减少了来自其他器官的蛋白质污染，且尿检属于非侵入性操作，患者依从性更高。
19.(3)本发明提供的酶标板，可拆卸，可根据需要自行选择板条数并自由组装。
20.(4)本发明提供的试剂盒具有较好的敏感性和特异性，所用设备简单，操作容易，可在半天内出结果。
附图说明
21.图1为bta蛋白标准曲线。
22.图2为cd44蛋白标准曲线。
23.图3为survivin蛋白标准曲线。
24.图4为bta、survivin、cd44三指标联合对患者与正常人尿液elisa检测od
450
值的受试特征曲线。
具体实施方式
25.以下通过具体的实施例对本发明作进一步详细说明，但并不限制本发明的范围。另外，实施例中未注明具体技术操作步骤或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
26.实施例1.制备包被有第一抗体的酶标板
27.1、实验材料及试剂
28.(1)包被缓冲液：采用50mm碳酸盐缓冲液，ph＝9.6。
29.(2)洗涤液：选用含0.2％(v/v)吐温-20的pbst(磷酸盐-吐温)缓冲液。
30.(3)封闭液:含2％(w/v)bsa的pbst(磷酸盐-吐温)缓冲液。
31.2、包被：
32.①
酶标板1：将包被缓冲液与5.0μg/ml的第一抗人bta抗体配制成包被液，轻轻混匀，100μl/孔加入到96孔板中，封闭覆膜放至37℃恒温箱中孵育1h然后4℃冰箱中包被过夜。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满稀释后的洗涤液，静置1分钟后弃去，如此重复5次，每一次在滤纸上扣干。然后加封闭液100μl/孔，37℃封闭2h，弃去上清液，然后再用pbst洗板3次，每次3min。最后，将封闭处理后的96孔酶标板放置37℃烘干箱烘干后，包装，得到包被好的96孔酶标板，4℃保存备用。
33.②
酶标板2：将包被缓冲液与5.0μg/ml的第一抗人cd44抗体配制成包被液，轻轻混匀，100μl/孔加入到96孔板中，封闭覆膜放至37℃恒温箱中孵育1h然后4℃冰箱中包被过夜。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满稀释后的洗涤液，静置1分钟后弃去，如此重复5次，每一次在滤纸上扣干。然后加封闭液100μl/孔，37℃孵育2h，弃去上清液，然后再用洗涤液洗板3次，每次3min。最后，将封闭处理后的96孔酶标板放置37℃烘干箱烘干后，包装，得到包被好的96孔酶标板，4℃保存备用。
34.③
酶标板3：将包被缓冲液与2.5μg/ml的第一抗人survivin抗体配制成包被液，轻轻混匀，100μl/孔加入到96孔板中，封闭覆膜放至37℃恒温箱中孵育1h然后4℃冰箱中包被过夜。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满稀释后的洗涤液，静置1分钟后弃去，如此
重复5次，每一次在滤纸上扣干。然后加封闭液100μl/孔，37℃封闭2h，弃去上清液，然后再用pbst洗板3次，每次3min。最后，将封闭处理后的96孔酶标板放置37℃烘干箱烘干后，包装，得到包被好的96孔酶标板，4℃保存备用。
35.实施例2.生物素标记第二抗体工作液制备
36.1、样本稀释液的制备：
37.样品稀释液含有1％(w/v)bsa的pbst缓冲液。
38.2、生物素标记的第二抗体工作液制备：
39.①
将生物素标记的第二抗bta抗体用样本稀释液按照1:10000(v/v)的比例进行稀释，混匀备用；
40.②
将生物素标记的第二抗cd44抗体用样本稀释液按照1:10000(v/v)的比例进行稀释，混匀备用；
41.③
将生物素标记的第二抗survivin抗体用样本稀释液按照1:500(v/v)的比例进行稀释，混匀备用。
42.实施案例3.本发明试剂盒的组成
43.(1)实施例1制备的包被的96孔酶标板；
44.(2)样品稀释液：含有1％(w/v)bsa的pbst缓冲液；
45.(3)洗涤液：含0.2％吐温20的pbst(磷酸盐-吐温)缓冲液；
46.(4)实施例2制备的生物素标记的第二抗体工作液；
47.(5)辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素溶液；
48.(6)显色液：显色液由显色液a和显色液b组成，其中，显色液a为0.02％(w/v)tmb，显色液b为0.006％(w/v)过氧化脲；使用时将显色液a和显色液b按照1:1等体积混合均匀；(7)终止液：2mol/l的硫酸。
49.二、试剂盒的使用方法
50.(一)使用步骤
51.1、实验前准备：从4℃冰箱中取出试剂盒，平衡到室温(18-25℃)。盒内试剂应放置于冰盒中，注意使用前将所有试剂充分混匀，不要使液体产生大量气泡以免对结果产生误差。
52.2、加样温育：
53.本试剂盒共有三块已经包被的96孔酶标板，分别包被有第一抗bta、第一抗cd44和第一抗survivin蛋白，孔板可拆卸，使用时必须同时使用三种酶标板，可根据样本数目选择板条数。
54.①
酶标板1：根据待测样品数量加上标准品的数量分别取足够数量的包被板条，固定于框架上，记录各孔的位置。每个标准品孔、样品孔和空白孔建议作2个复孔，100μl/孔。bta标准品按照0.5ng/ml，1.0ng/ml，2.0ng/ml，4.0ng/ml，8.0ng/ml，16.0ng/ml的浓度稀释后加入标准品中。将样品加于酶标板的孔底，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，加盖封板膜，室温温育60分钟。(设立标准品浓度为0μg/ml为阴性对照，最后只加显色底物与终止液而无其他抗原抗体成分的孔作为空白孔进行调零)
55.②
酶标板2：根据待测样品数量加上标准品的数量分别取足够数量的包被板条，固定于框架上，记录各孔的位置。每个标准品孔、样品孔和空白孔建议作2个复孔，100μl/孔。
cd44标准品按照0.31ng/ml，0.62ng/ml，1.25ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml的浓度稀释后加入标准品中。将样品加于酶标板的孔底，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，加盖封板膜，室温温育60分钟。(设立标准品浓度为0μg/ml为阴性对照，最后只加显色底物与终止液而无其他抗原抗体成分的孔作为空白孔进行调零)
56.③
酶标板3：根据待测样品数量加上标准品的数量分别取足够数量的包被板条，固定于框架上，记录各孔的位置。每个标准品孔、样品孔和空白孔建议作2个复孔，100μl/孔。survivin标准品按照0.625ng/ml，1.25ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml的浓度稀释后加入标准品中。将样品加于酶标板的孔底，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，加盖封板膜，室温下温育60分钟。(设立标准品浓度为0μg/ml为阴性对照，最后只加显色底物与终止液而无其他抗原抗体成分的孔作为空白孔进行调零)
57.3、洗板：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置1分钟后弃去，如此重复5次，每一次在滤纸上扣干。(手工洗板或洗板机均可)
58.4、加生物素标记的第二抗体：
59.取第3步晾干的酶标板进行如下操作
60.①
酶标板1：将生物素标记的第二抗bta抗体用样本稀释液按照1:10000(v/v)的比例进行稀释，100μl/孔，震荡混匀后，盖上封膜板，37℃温育90分钟；
61.②
酶标板2：将生物素标记的第二抗cd44抗体用样本稀释液按照1:10000(v/v)的比例进行稀释，100μl/孔，震荡混匀后，盖上封膜板，37℃温育90分钟；
62.③
酶标板3：将生物素标记的第二抗survivin抗体用样本稀释液按照1:500(v/v)的比例进行稀释，100μl/孔，震荡混匀后，盖上封膜板，37℃温育90分钟。
63.本试剂盒共有三瓶生物素标记的第二抗体瓶，分别为生物素标记的第二抗bta抗体、生物素标记的第二抗cd44抗体、生物素标记的第二抗survivin抗体，使用时需注意酶标板与对应的生物素标记的第二抗体瓶搭配使用，切勿交叉。
64.5、洗板：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置1分钟后弃去，如此重复5次，每一次在滤纸上扣干。
65.6、加链霉亲和素标记的hrp工作液：每孔加入链霉亲和素化hrp试剂100μl，震荡混匀后，盖上封膜板，37℃孵育30分钟。
66.7、洗板：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置1分钟后弃去，如此重复5次，每一次在滤纸上扣干。
67.8、加显色液：将显色液a和显色液b按照1:1等体积混合均匀，然后将混合后的显色液迅速加入96孔酶标板的反应孔中，100μl/孔，置于37℃避光反应15min。
68.9、加终止液：分别取出酶标板，迅速加入100μl终止液，然后立即测定结果。
69.10、测定：使用设置为450nm的酶标仪，在5分钟内测定每孔的od值。
70.11、结果判断与分析：记录相关实验数据，用curve expert 1.3软件分别绘制标准曲线，其中x轴为标准品的od值，y轴为各od值所相对应的浓度，根据曲线得出的浓度值再乘以相应的稀释倍数即为样品的实际浓度。
71.(二)试剂盒的性能检测
72.1、灵敏度：对抗原做梯度稀释并进行检测，阴性对照为pbs，然后根据已确定的阴阳临界值测出该抗原的最低检出浓度(loq)，
73.表1灵敏度试验测定数据
[0074] 酶标板1酶标板2酶标板3灵敏度ng/ml0.320.1130.21检测范围ng/ml0.5-160.31-100.625-20
[0075]
2、精密度：批内重复性是选取在4℃保存的同一批组装好的elisa试剂盒，连续检测3天，使用3种不同浓度且浓度差较大的抗原标准品作为样本，设定5个重复，按本试剂盒的说明书进行操作，计算其平均值标准差(sd)以及变异系数(cv)，
×
100％；批间重复性是选取保存于4℃的3个批次的elisa试剂盒，使用3种不同浓度且浓度差较大的抗原标准品作为样本，并设定5个重复，按本试剂盒的说明书操作，计算其平均值标准差(sd)以及变异系数(cv)。
[0076]
表2精密度实验测定数据(平均值)
[0077][0078][0079]
3、准确性：采用加标回收试验，选择2例膀胱癌患者尿液，分别加入等体积的标准品溶液2.0ng/ml和5.0ng/ml，分析测定添加后样品的浓度，每个样品做3个平行测定，最后计算平均回收率。
[0080]
回收率＝(加标试样测定值-试样测定值)/加标的添加值
×
100％
[0081]
表3回收实验测定结果
[0082]
回收率(％)酶标板1酶标板2酶标板3分析样本189-10296.5-10688-110分析样本298-11195-11599-104.5
[0083]
4、稳定性：将试剂盒在37℃放置3周和在4℃放置3周的相同产品进行检测后比较结果。
[0084]
表4试剂盒稳定性实验结果
[0085][0086]
5、临床验证
[0087]
(1)样本收集
[0088]
肿瘤组：男性40名，女性20名，肿瘤组的平均年龄为66.4
±
9.8岁，标准为：所有患者均有完整的病例资料且近期未接受泌尿生殖系操作以及手术、放化疗等，最终经膀胱镜检或turbt术行病理检查证实为膀胱肿瘤患者。
[0089]
健康对照组：同期进行健康体检的正常人群40例，无任何肿瘤相关证据，男性17名，女性23名，平均年龄为65.8
±
8.0岁。
[0090]
(2)样本处理
[0091]
所有患者在入院后未行任何导尿、膀胱镜检查术、直肠指诊等泌尿系相关操作之前，留取新鲜的清晨清洁中段尿50-100ml，编号后在离心机上设置1000g，2-8℃条件下离心15分钟，留取样本中的上清液，等分试验样本并将样品储存在-80℃待检。
[0092]
(3)实验方法
[0093]
采用本发明的实施例1制备的试剂盒对40例健康对照组尿样和60例肿瘤组尿样尿液中3种抗原的含量进行检测。然后根据实验数据应用spss19.0软件进行分析，相关计量数据应用卡方检验进行组间对比，以p《0.05为具有显著统计学差异。应用spss绘制采用受试者工作曲线(roc曲线)来分析各肿瘤标记物对膀胱癌检测的敏感性及特异性，通过youden指数来确定各指标的cutoff值。roc曲线下面积(auc)，可以反映肿瘤标记物对于膀胱癌诊断实验的准确性，并且当auc≤0.5时，肿瘤指标对膀胱癌无诊断价值；当0.5＜auc≤0.7时，诊断的准确性比较低；当0.7＜auc≤0.9时，表示有一定的准确性；当auc＞0.9时，表示有较高的准确性。应用logistics回归分析和roc分析比较3种标记物组合联合检测的准确性。
[0094]
(4)结果分析
[0095]
如表5所见，bta、cd44、survivin三种标记物的组合具有较高的敏感度和特异度，特异度为80％，敏感度为96.8％，对这三项指标联合检测作roc曲线，可得其auc＝0.905(95％ci：0.822-0.958)，三者联合诊断的效能最好。
[0096]
表5不同肿瘤标志物组合联合检测结果
[0097]
抗原组合敏感度，％特异度，％aucbta71.9800.820cd4482.5800.859survivin80.9582.640.8552bta+survivin8086.540.89bta+cd44+survivin96.8800.905