一种通过Telocytes对肝细胞癌的预后评价方法与流程

一种通过telocytes对肝细胞癌的预后评价方法
技术领域
1.本发明涉及临床医学技术领域，具体为一种通过telocytes对肝细胞癌的预后评价方法。


背景技术：

2.telocytes（tcs）作为新型的间质来源的细胞，广泛存在于人类器官和组织中，参与多种生理、病理过程，如参与组织修复，心脏缺血再灌注损伤，动脉粥样硬化，和肿瘤发生等。在人类肝脏组织中，tcs对cd34、pdgfr-α和cd117阳性表达，对波形蛋白（vimentin）和cd28阴性表达，其参与疾病发生、发展的过程被称为“telocytopathies”。
3.tcs可作为促瘤因素参与炎性结肠息肉和pdgfr-a变异型结肠疾病的发生和发展；tcs还可与周围细胞之间传递信息参与肺部多种疾病过程。申请人在前期研究中发现，tcs在肝细胞癌癌旁组织中的高表达与患者预后生存期具有相关性，tcs低表达患者具有更长的生存期，且通过多条信号通路研究tcs促进肝细胞癌侵袭转移的内在机制。因此将tcs在肿瘤癌旁病理组织中的表达情况作为预测患者生存预后的指标具有一定的科学性和实用性。
4.在肿瘤病理组织中，统计计数tcs的数量需要通过免疫组化或免疫荧光指标进行染色，并通过透射电镜进行细胞形态的识别，此过程需要成本较高，观察时间较长。


技术实现要素：

5.（一）解决的技术问题肝细胞癌手术治疗是患者可能取得无瘤生存状态的唯一有效方式，患者术后是否需要接受化疗，放射治疗或免疫靶向治疗，需要病理分子生物学指标的综合评价，除病理分期和细胞增殖指标外，没有其他可以为临床医师提供患者预后评价的准确指标，基于现有技术的这一缺陷，本发明提供了一种通过telocytes对肝细胞癌的预后评价方法，具备可以为临床医师提供患者预后评价的准确指标的优点，解决了为肝细胞癌患者预后评价指标可能性的问题。
6.（二）技术方案为实现上述为肝细胞癌患者预后评价指标可能性目的，本发明提供如下技术方案：一种通过telocytes对肝细胞癌的预后评价方法，包括以下步骤：s1：取肝细胞癌患者术后肿瘤标本，在距肿瘤1-2cm范围内的癌细胞旁组织，在室温液体溶剂中利用高速破碎、高速研磨、高速搅拌和超分子渗透技术，快速对癌细胞旁组织进行破碎、研磨至细微颗粒，提取形态完整的组织细胞，将癌细胞旁组织细胞固定在4%的多聚甲醛缓冲液中，石蜡包埋在jb-p5型石蜡包埋机中并存档，然后用rm2016型病理切片仪制备3μm厚的组织切片。切片用二甲苯一式三份(每次15min)，纯乙醇脱水2次(每次5min)，乙醇梯度为85%和75%(5min)，切片在柠檬酸钠抗原提取液(servicebio：g1202，ph为6.0)中孵育次，用pbs(servicebio：g0002，ph为7.4)在摇床上浸泡5min，目的组织用液体阻滞剂pen
标记，在室温下浸泡3%bsa溶液中30min，做成冰冻切片或石蜡切片；s2：应用cd34（高度糖基化的i型跨膜糖蛋白）/cd117（ⅲ型跨膜醅氨酸激酶受体蛋白）/pdgfr（血小板衍生生长因子受体）/vimentin（波形纤维蛋白）指标做免疫荧光染色；s3：以cd34+/cd117+/pdgfr+/vimentin-细胞为tcs细胞；s4：将癌旁组织放入电镜通用固定液中，切片后于透射电子显微镜下观察tcs细胞的形态；s5：通过相同高倍镜计数后作统计分析。
7.优选的，所述cd117采用编码相对分子质量为135000的ⅲ型跨膜醅氨酸激酶受体蛋白。
8.优选的，所述免疫荧光染色第一组选用cd28/vimentin双免疫荧光标记，端粒表达pdgfr-a；第二组选用cd34/cd117双免疫荧光标记，端粒表达pdgfr-a；第三组选用cd34/pdgfr双免疫荧光标记，端粒表达pdgfr-a。
9.（三）有益效果与现有技术相比，本发明提供了一种通过telocytes对肝细胞癌的预后评价方法，具备以下有益效果：1、该通过telocytes对肝细胞癌的预后评价方法，通过应用cd34（高度糖基化的i型跨膜糖蛋白）/cd117（ⅲ型跨膜醅氨酸激酶受体蛋白）/pdgfr（血小板衍生生长因子受体）/vimentin（波形纤维蛋白）指标做免疫荧光染色，以cd34+/cd117+/pdgfr+/vimentin-细胞为tcs细胞，可以为临床医师提供患者预后评价的准确指标，解决了为肝细胞癌患者预后评价指标可能性的问题。
10.2、该通过telocytes对肝细胞癌的预后评价方法，通过采用多组双免疫荧光标记，并设置对照组的研究方法，通过对细胞形态与端粒数目进行观察，利用透射电镜来测定细胞和体外培养的细胞的超微结构，来分析相关细胞外囊泡和信号蛋白的遗传信息，对肝细胞癌的预后评价研究具有重要意义。
附图说明
11.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
12.图1为本发明的5μm放大比例显微镜观察图；图2为本发明的2μm放大比例显微镜观察图；图3为本发明的10μm放大比例显微镜观察图。
具体实施方式
13.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
14.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
15.请参阅图1-3，本发明提供一种技术方案：实施例一：一种通过telocytes对肝细胞癌的预后评价方法，包括以下步骤：s1：取肝细胞癌患者术后肿瘤标本，在距肿瘤1-2cm范围内的癌细胞旁组织，在室温液体溶剂中利用高速破碎、高速研磨、高速搅拌和超分子渗透技术，快速对癌细胞旁组织进行破碎、研磨至细微颗粒，提取形态完整的组织细胞，将癌细胞旁组织细胞固定在4%的多聚甲醛缓冲液中，石蜡包埋在jb-p5型石蜡包埋机中并存档，然后用rm2016型病理切片仪制备3μm厚的组织切片。切片用二甲苯一式三份(每次15min)，纯乙醇脱水2次(每次5min)，乙醇梯度为85%和75%(5min)，切片在柠檬酸钠抗原提取液(servicebio：g1202，ph为6.0)中孵育3次，用pbs(servicebio：g0002，ph为7.4)在摇床上浸泡5min，目的组织用液体阻滞剂pen标记，在室温下浸泡3%bsa溶液中30min，制成冰冻切片。
16.s2：应用cd34（高度糖基化的i型跨膜糖蛋白）和vimentin（波形纤维蛋白）指标做双免疫荧光染色。
17.s3：以cd34+和vimentin-细胞为tcs细胞。
18.s4：将癌旁组织放入电镜通用固定液中，切片后于透射电子显微镜下观察tcs细胞的形态。
19.s5：通过相同高倍镜计数后作统计分析。
20.实施例二：s1：取肝细胞癌患者术后肿瘤标本，在距肿瘤1-2cm范围内的癌细胞旁组织，在室温液体溶剂中利用高速破碎、高速研磨、高速搅拌和超分子渗透技术，快速对癌细胞旁组织进行破碎、研磨至细微颗粒，提取形态完整的组织细胞，将癌细胞旁组织细胞固定在4%的多聚甲醛缓冲液中，石蜡包埋在jb-p5型石蜡包埋机中并存档，然后用rm2016型病理切片仪制备3μm厚的组织切片。切片用二甲苯一式三份(每次15min)，纯乙醇脱水2次(每次5min)，乙醇梯度为85%和75%(5min)，切片在柠檬酸钠抗原提取液(servicebio：g1202，ph为6.0)中孵育3次，用pbs(servicebio：g0002，ph为7.4)在摇床上浸泡5min，目的组织用液体阻滞剂pen标记，在室温下浸泡3%bsa溶液中30min，制成冰冻切片。
21.s2：应用cd34（高度糖基化的i型跨膜糖蛋白）和cd117（ⅲ型跨膜醅氨酸激酶受体蛋白）指标做双免疫荧光染色。
22.s3：以cd34+和cd117+细胞为tcs细胞。
23.s4：将癌旁组织放入电镜通用固定液中，切片后于透射电子显微镜下观察tcs细胞的形态。
24.s5：通过相同高倍镜计数后作统计分析。
25.实施例三：s1：取肝细胞癌患者术后肿瘤标本，在距肿瘤1-2cm范围内的癌细胞旁组织，在室
温液体溶剂中利用高速破碎、高速研磨、高速搅拌和超分子渗透技术，快速对癌细胞旁组织进行破碎、研磨至细微颗粒，提取形态完整的组织细胞，将癌细胞旁组织细胞固定在4%的多聚甲醛缓冲液中，石蜡包埋在jb-p5型石蜡包埋机中并存档，然后用rm2016型病理切片仪制备3μm厚的组织切片。切片用二甲苯一式三份(每次15min)，纯乙醇脱水2次(每次5min)，乙醇梯度为85%和75%(5min)，切片在柠檬酸钠抗原提取液(servicebio：g1202，ph为6.0)中孵育3次，用pbs(servicebio：g0002，ph为7.4)在摇床上浸泡5min，目的组织用液体阻滞剂pen标记，在室温下浸泡3%bsa溶液中30min，制成冰冻切片。
26.s2：应用cd34（高度糖基化的i型跨膜糖蛋白）和pdgfr（血小板衍生生长因子受体）指标做免疫荧光染色。
27.s3：以cd34+和pdgfr+细胞为tcs细胞。
28.s4：将癌旁组织放入电镜通用固定液中，切片后于透射电子显微镜下观察tcs细胞的形态。
29.s5：通过相同高倍镜计数后作统计分析。
30.该通过telocytes对肝细胞癌的预后评价方法，通过应用cd34（高度糖基化的i型跨膜糖蛋白）/cd117（ⅲ型跨膜醅氨酸激酶受体蛋白）/pdgfr（血小板衍生生长因子受体）/vimentin（波形纤维蛋白）指标做免疫荧光染色，以cd34+/cd117+/pdgfr+/vimentin-细胞为tcs细胞，可以为临床医师提供患者预后评价的准确指标，解决了为肝细胞癌患者预后评价指标可能性的问题。
31.综上所述：采用免疫组织化学方法检测cd34、cd117、cd28、pdgfr-a和cd28/vimentin、cd34/cd117、cd34/pdgfr双标记免疫荧光，不同比例的条形图与同步器显示，显著的使细胞和端足的形态变得更加清晰，将肝细胞癌患者癌旁病理组织中高表达的tcs作为患者术后预后较差的指标，指导临床医师给予患者除手术外的其他综合治疗方法是有必要的。
32.端粒细胞cd34和cd117呈阳性表达，细胞形态与端粒数目有关。pdgfr-a在细长端足中呈阳性表达。tell细胞免疫组化检测cd28阴性，端足细胞cd34阳性，cd34/pdgfr-a双免疫荧光标记提示心肌细胞间形成3d网络，端粒易于分辨。
33.t细胞在肾皮质系统和髓质肾系统中cd34和pdgfr-a阳性，cd117阴性。两种系统的形态相似，cd28和vimentin的双免疫荧光标记对肾组织和髓质肾系统的细胞进行了广泛的染色，但未见明显的细胞凋亡。双染色免疫荧光标记cd34/pdgfr-a阳性的telcell呈纺锤形，有两个端足，并形成一个网络。
34.t细胞在cd34和cd117中呈阳性表达，端粒表达pdgfr-a。肝实质组织和肝静脉系统中的远程细胞免疫表型不全。肝静脉系统中cd28/vimentin在肝实质组织和cd34/cd117中均未检测到t细胞，cd28/vimentin和cd34/cd117双免疫荧光标记为阴性对照。
35.该通过telocytes对肝细胞癌的预后评价方法，通过采用多组双免疫荧光标记，并设置对照组的研究方法，通过对细胞形态与端粒数目进行观察，利用透射电镜来测定细胞和体外培养的细胞的超微结构，来分析相关细胞外囊泡和信号蛋白的遗传信息，对肝细胞癌的预后评价研究具有重要意义。
36.判断标准：通过对细胞形态与端粒数目进行观察，和双免疫荧光标记是否能够清晰的粪便细
胞端粒来判断，本技术方案中，实施例二为最佳实施例。
37.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个......”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
38.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。