一种氨基末端B型利钠肽前体的纳米磁微粒化学发光检测试剂盒制备方法及检测应用与流程

一种氨基末端b型利钠肽前体的纳米磁微粒化学发光检测试剂盒制备方法及检测应用
技术领域
1.本发明涉及医用诊断试剂技术领域，具体涉及一种氨基末端b型利钠肽前体的纳米磁微粒化学发光检测试剂盒制备方法及检测应用。


背景技术：

2.nt-probnp是心室肌细胞分泌，通过心肌细胞拉伸进入血液循环的含有76个氨基酸的多肽，不具有生物学活性，由肾脏清除。nt-probnp的生物半衰期时间长，约90-120min，体外稳定性好。血中浓度与心功能障碍程度呈正相关。血浆中的清除速度慢，能够准确反映心肌的缺血状态，反映心功水平。nt-probnp在以往的研究中已被证实，可作为心力衰竭的临床诊断指标应用，用于早期发现心力衰竭病人，对心衰患者的危险度分级，预测心源性猝死，对心衰患者的治疗疗效监测及预后评估等。《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》中成分肯定了nt-probnp作为心衰生物学标志物的重要价值，提出了nt-probnp测定与心衰诊断和鉴别诊断的标准。
3.心衰的主要发病机制之一为心肌病理性重构，导致心衰发展的两个关键过程之一为心肌死亡(坏死、凋亡、自噬等)的发生，如急性心肌梗死、重症心肌炎等。基于此研究背景提示，nt-probnp作为心衰及预后的一项独立检测指标，有可能在导致心衰发展的关键过程之中即具有浓度的变化指征。而越来越多的临床研究数据也证实了这一点，尤其是在急性心肌梗死ami患者群体中，多项研究表明nt-probnp在急性心肌梗死早期，其血清水平已发生异常增高。下文中将详细介绍nt-probnp与ami的临床诊断的联系，以确认将nt-probnp作为ami诊断指标的重要意义。
4.现有的nt-probnp检测试剂方法学众多，有酶联免疫(elisa)、免疫荧光法等，随着临床检测的要求逐渐提高，迫切需要检测灵敏度更高，线性范围宽，性能更加稳定的nt-probnp检测试剂，以辅助临床诊断，满足临床的需要，而传统检测方法的试剂存在检测灵敏度低、稳定性差等特点，因此需要研发一种具有更高灵敏度、稳定性更好的nt-probnp检测试剂，利用超顺磁性的纳米磁微粒的化学发光法检测nt-probnp，灵敏度高，稳定性好，相比于市场传统方法学的试剂来说，更符合临床检测的需求。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明的目的是开发一种氨基末端b型利钠肽前体的纳米磁微粒化学发光检测试剂盒制备方法及检测应用，提高了试剂的灵敏度、高特异性的单克隆抗体保证了试剂的特异性，此外蛋白稳定剂的优化以及血清阻断剂的使用提高了试剂的稳定性，此外试剂具备宽线性范围，可以满足临床的需求，且整个体系稳定性好，操作简便，可适于临床全自动化学发光测定仪配套使用。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的第一方面，提供一种nt-probnp的纳米磁微粒化学发光检测试剂盒，包
括：
8.包被有第一nt-probnp单克隆抗体的磁性微粒；
9.碱性磷酸酶标记的第二nt-probnp单克隆抗体。
10.优选的，所述第一nt-probnp单克隆抗体具体为nt-probnp单抗1g4。
11.优选的，所述磁性微粒的粒径为1μm。
12.优选的，所述第二nt-probnp单克隆抗体具体为nt-probnp单抗8f10。
13.优选的，所述纳米磁微粒化学发光检测试剂盒中还包括：tris缓冲液和化学发光底物amppd。
14.本发明的第二方面，提供纳米磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
15.(1)将第一nt-probnp单克隆抗体通过标记反应，偶联上生物素，得到生物素化的第一nt-probnp单克隆抗体；然后将生物素化的第一nt-probnp单克隆抗体与链霉素亲和素修饰的磁性微粒进行偶联反应，得到包被有第一nt-probnp单克隆抗体的磁性微粒；与包被缓冲液共同组成m试剂；
16.(2)将第二nt-probnp单克隆抗体通过标记反应，标记上碱性磷酸酶，得到碱性磷酸酶标记的第二nt-probnp单克隆抗体；与tris缓冲液共同组成r试剂。
17.优选的，步骤(1)中，所述包被缓冲液为添加蛋白稳定剂和血清检测阻断剂。
18.本发明的第三方面，提供所述的纳米磁微粒化学发光检测试剂盒在非治疗性或诊断性检测氨基末端b型利钠肽前体nt-probnp含量中的应用。
19.本发明的第四方面，提供一种检测nt-probnp含量的方法，包括以下步骤：
20.将包被有第一nt-probnp单克隆抗体的磁性微粒、碱性磷酸酶标记的第二nt-probnp单克隆抗体、tris缓冲液和待测样品混合，在37℃温育反应5min；通过磁场分离除去未结合的物质；然后加入化学发光底物amppd，对反应中所产生的相对发光强度进行测量，基于相对发光强度与nt-probnp浓度间的关系，对待测样品中的氨基末端b型利钠肽前体nt-probnp含量进行测定。
21.本发明的有益效果：
22.1、本发明制备的试剂盒中磁微粒包被nt-probnp单克隆抗体大大提高了检测特异性，以及避免漏检的情况，提高了检测的灵敏度，具备氨基末端b型利钠肽前体检测试剂的要求。同时对反应缓冲液进行的优化，添加了适合该项目的蛋白稳定剂，提高了反应体系的稳定性。
23.2、通过筛选优化缓冲体系，增加了蛋白稳定剂，以及血清检测阻断剂，提高了试剂的准确度，有效避免假阳性的情况发生。
具体实施方式
24.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
25.正如背景技术部分所介绍的，现有的nt-probnp检测方法众多，有酶联免疫(elisa)、免疫荧光法等，而传统检测方法的试剂存在检测灵敏度低、稳定性差等特点，使得
nt-probnp的稳定性、灵敏度等都有待提高。
26.基于此，本发明开发了一种氨基末端b型利钠肽前体的纳米磁微粒化学发光检测试剂盒制备方法及检测应用。本发明制备的试剂盒具有检测灵敏度高、特异性好、稳定性好的特点。与常规检测nt-probnp的检测试剂相比，具有很大优势，能够满足临床应用的需求。
27.本发明试剂盒的检测原理：本试剂盒采用化学发光免疫夹心法测定血清中nt-probnp水平。将样本添加到含有包被着两种抗人nt-probnp单克隆抗体的超顺磁性微粒、缓冲溶液和nt-probnp-ap标记抗体的反应管中。nt-probnp-ap标记抗体和人nt-probnp分子上不同的抗原位点反应。样本中nt-probnp与固定在超顺磁性微粒上的单克隆抗体nt-probnp结合，从而形成夹心复合物。在反应管内温育完成后，结合在固相上的物质置于磁场内被吸附，而未结合的物质被冲洗除去，然后将化学发光底物amppd添加到反应管内，然后由全自动发光测定仪对反应中所产生的光进行测量。所产生光的量与样本中的nt-probnp的浓度成正比，样本内分析物的量由所储存的校准曲线来确定。
28.本发明是通过以下方式实现的:
29.nt-probnp检测试剂盒：
30.其主要成分包括m试剂和r试剂，其主要成分详见下表1。
31.表1
[0032][0033][0034]
nt-probnp检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[0035]
1制备m试剂
[0036]
1.1制备nt-probnp-生物素抗体
[0037]
将nt-probnp单克隆抗体通过标记反应，偶联上生物素酯，制得nt-probnp-生物素抗体
[0038]
1.2分别将nt-probnp-生物素抗体与链霉亲和素磁珠进行偶联反应，将生物素化nt-probnp抗体包被到链霉亲和素磁珠上。
[0039]
1.3上述反应于室温下进行，所用的包被缓冲液为tris缓冲液，添加阻断剂，以避免假阳性反应，最后进行定容。
[0040]
2制备r试剂：
[0041]
2.1制备nt-probnp-ap抗体
[0042]
将nt-probnp单克隆抗体通过标记反应，标记上ap，制得nt-probnp-ap抗体母液。
[0043]
2.2配制r试剂tris缓冲液，将nt-probnp-ap抗体加入tris缓冲液中，充分混匀，定容。
[0044]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
[0045]
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：
[0046]
第一nt-probnp单克隆抗体为1g4，购自珠海博美生物科技有限公司；抗体亚型：igg1其针对的抗原表位区域为13-27。
[0047]
第二nt-probnp单克隆抗体为8f10，购自购自珠海博美生物科技有限公司。
[0048]
磁性微粒为dynabeads
tm myone
tm
，粒径为1μm。
[0049]
生物素为thermo scientific
tm ez-link
tm nhs-lc-生物素。
[0050]
实施例1：nt-probnp的纳米磁微粒化学发光检测试剂盒
[0051]
1、试剂盒组成：
[0052]
(1)m试剂：包被有第一nt-probnp单克隆抗体的磁性微粒；tris缓冲液。
[0053]
(2)r试剂：碱性磷酸酶(ap)标记的第二nt-probnp单克隆抗体；tris缓冲液。
[0054]
2、试剂盒的制备：
[0055]
(1)将第一nt-probnp单克隆抗体通过标记反应，偶联上生物素，得到生物素化的第一nt-probnp单克隆抗体；然后将生物素化的第一nt-probnp单克隆抗体与链霉素亲和素修饰的磁性微粒室温下置于混匀仪上反应30min进行偶联反应，得到包被有第一nt-probnp单克隆抗体的磁性微粒；与tris缓冲液共同组成m试剂；
[0056]
(2)将第二nt-probnp单克隆抗体和碱性磷酸酶(ap)室温下置于混匀仪上反应20min，然后终止反应，通过标记反应标记上碱性磷酸酶，得到碱性磷酸酶标记的第二nt-probnp单克隆抗体；与tris缓冲液共同组成r试剂。
[0057]
实施例2：nt-probnp的纳米磁微粒化学发光检测试剂盒方法学考察
[0058]
1.最低检出限
[0059]
用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的rlu值，计算其平均值和标准差(sd)。得出根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-化学发光(rlu)值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将所对应的rlu值带入方程式中，求出对应的浓度值，结果如下表2：
[0060]
表2
[0061][0062]
上述结果表明，本发明制备的氨基末端b型利钠肽前体化学发光法检测试剂的最低检出限为0.9598pg/ml。
[0063]
2.准确度
[0064]
测定准确度样本，重复检测3次，分别计算相对偏差，所得结果见表3。
[0065]
表3
[0066][0067]
3.重复性
[0068]
测定高低浓度质控品，各重复检测10次，计算10次测试结果的变异系数，所得结果见表4。
[0069]
表4
[0070][0071]
以上实验数据表明，本发明制备的氨基末端b型利钠肽前体重复性检测cv均在3％以内，重复性良好。
[0072]
4.线性
[0073]
将接近线性范围上限的高值样本进行稀释，配制成至少5个浓度的样本，其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本均重复检测3次，计算每一浓度的样本平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r，所得结果见表5。
[0074]
表5
[0075]
[0076][0077]
以上实验数据表明，本技术涉及的nt-probnp试剂的线性相关系数r＝0.9996，符合技术要求。
[0078]
综上，本发明针对现有nt-probnp检测试剂的不足之处，设计开发了一种nt-probnp化学发光法检测试剂盒，提高了试剂的灵敏度、高特异性的单克隆抗体保证了试剂的特异性，此外蛋白稳定剂的优化以及血清阻断剂的使用提高了试剂的稳定性，此外试剂具备宽线性范围，可以满足临床的需求，且整个体系稳定性好，操作简便，可适于临床全自动化学发光测定仪配套使用。
[0079]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。