一种测量荧光曲线下面积来估算水体的初级生产力的方法

1.本发明涉及微藻及水产领域，更特别地，本发明涉及一种测量荧光曲线下面积来估算水体的初级生产力的方法。


背景技术：

2.初级生产力，是水中营光合作用的植物(包括细菌)在单位面积、单位时间内固定太阳光能量产生有机物质量的能力。光合微藻还被证明是开放淡水和海水中初级生产力的主要贡献者，藻类的光合作用几乎占全球初级生产力总量的一半以上，构成了所有水生食物网的基础。
3.可以使用叶绿素chla含量来推断光合作用，且该数据是微藻生物量的良好指标，并能在一定程度上反映水质情况，所以可以通过水体中的chla的含量来计算天然水体的初级生产力。
4.本团队已经就水体初级生产力的估算进行了多年研究，并开发了多种估算水体初级生产力的方法，包括例如通过fo来估算水体的初级生产力(发明专利zl 201610100962.3)、基于pea荧光曲线测定水体初级生产力(发明专利zl 201911406759.9)等。但是，以上方法均存在一定的技术缺陷。首先，对于fo而言，在胁迫条件(例如寒冷、高盐等)下，测量的fo会异常升高，导致估值出现偏差。而pea荧光曲线虽然不受胁迫条件的影响，但是如果水体或藻细胞总含有其他色素例如藻胆素等，会影响估值。
5.因此，需要一种具有更广适用范围的初级生产力估算方法。


技术实现要素：

6.为了解决以上技术问题，本发明提供了一种检测水体中的叶绿素a含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.1)建立所述水体中的荧光曲线下面积-叶绿素a含量的相关性方程；
8.2)从含有与所述水体一样的藻种类的水体中取样，测定并绘制所述样品的荧光曲线，并计算荧光曲线下面积；
9.3)将所述荧光曲线下面积代入所述荧光曲线下面积-叶绿素a含量的相关性方程中，计算得到叶绿素a含量。
10.在一个优选实施方案中，所述荧光曲线为400-650nm的激发光下685nm处的发射光强曲线。
11.在一个具体实施方案中，述水体为实验室光合微藻培养液、水产养殖水体或自然水体。
12.在一个具体实施方案中，所述光合微藻为蓝藻、绿藻、隐藻、裸藻、甲藻中的一种或任意几种的混合。
13.在一个具体实施方案中，所述光合微藻为高原链带藻藻、7942蓝藻、莱茵衣藻4533、小球藻c2和盐藻dm815的一种或任意几种的混合。
14.本发明还提供了一种测量水体的初级生产力的方法，将上述方法得到的叶绿素a含量代入以下方程中得到水体的初级生产力：
15.p＝k
·r·
c(chla)
·
dh
16.其中：p为初级生产力，单位为mg/(m3·
d)；r为同化系数；c(chla)为叶绿素a含量，单位为mg/m3；dh为日照时间，单位为h；k为经验常数。
17.本发明通过建立685nm处的荧光曲线下面积与叶绿素a含量的关系，得到了一种估算水体初级生产力的方法，该方法不仅具有更好的相关性，并且克服了以fo为指标时存在的胁迫条件下误差较大的问题，以及以pea荧光曲线为指标时存在的藻胆素干扰问题。
附图说明
18.图1为高原链带藻培养物的荧光曲线下面积-叶绿素a含量的相关性曲线。
19.图2为养殖水体水样的荧光曲线下面积-叶绿素a含量的相关性曲线。
20.图3为藻培养物混合物的荧光曲线下面积-叶绿素a含量的相关性曲线。
具体实施方式
21.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
22.发明人在研究工作中发现，当激发光400nm-650nm，发射波长在685nm得到微藻荧光曲线下面积与叶绿素a含量以及psii光合电子传递活性成正比，并且我们进一步发现，该荧光曲线下面积不受胁迫条件和其他色素的影响，这为我们在不同条件估算水体初级生产力提供更好的指标。
23.1、藻株及培养
24.本文用到了集胞藻pcc6803、聚球藻pcc7942、小球藻c2、高原链带藻、盐藻dm815以及莱茵衣藻cc4533。其中，集胞藻pcc6803、聚球藻pcc7942、小球藻c2在bg11培养基培养，培养条件为温度30℃、光照强度30μmol m-2
s-1
、120rpm振荡；莱茵衣藻cc4533在tap培养基中培养，培养条件为温度25℃、光照强度40μmol m-2
s-1
、120rpm振荡。高原链带藻在bg11培养基培养，培养条件为温度25℃、光照强度30μmol m-2
s-1
、120rpm振荡；盐藻dm815在dm培养基培养，培养条件为温度30℃、光照强度30μmol m-2
s-1
、120rpm振荡。
25.2、水产养殖水体的水样采集
26.水样取自兰考县的一个养殖池塘。于各取样点收集1l水样，共4l水样，以0.45μm的滤膜过滤水样对其荧光曲线下面积和细胞密度、chla含量分别进行测定。
27.3、荧光曲线下面积测定
28.使用荧光分光光度计f-4700进行荧光曲线的测定。测量前，取2ml藻液放在比色皿中放入样品架上。在发射光波长685nm；激发光波长400nm-650nm下，测量光下测定荧光曲线。使用统计软件对荧光曲线进行积分，求得曲线下面积。
29.4、细胞密度测定
30.采用细胞计数板进行细胞计数，计数时，通常数五个中方格的总细胞数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总细胞数，然后再换算成1ml藻悬液中的总细胞数。
31.设五个中方格中的总细胞数为a，藻悬液稀释倍数为b，如果是25个中方格的计数板，则：
32.1ml藻悬液中的总细胞数＝a/5
×
25
×
104×b33.＝50000a*b(个)
34.5、传统方法测定chla含量
35.取不同细胞密度的藻液1ml，12000rpm离心3min，弃上清，加入1ml 100％(v/v)甲醇，充分震荡，4℃避光萃取24h。12000rpm离心3min，取上清用紫外分光光度计在470nm、625.4nm、665.2nm处测定其吸光度，以100％(v/v)甲醇为空白对照。计算公式如下：
36.叶绿素a(chla)(μg ml-1
)＝16.72a
665.2-9.16a
652.4
37.6、纯培养微藻的荧光曲线下面积与chla含量的关系
38.将集胞藻pcc6803、聚球藻pcc7942、小球藻c2以及莱茵衣藻cc125和cc4533培养至对数期，取藻样分成两部分，一部分分别进行梯度稀释，以4倍的梯度稀释5次，得到6个浓度梯度；另一部分用于等体积混合，然后以4倍的梯度稀释5次，得到6个浓度梯度，通过上文中的方法测定绘荧光，计算荧光曲线下面积，并测定chla含量。
39.结果如图1(高原链带藻)和3(微藻培养物的混合物)所示，荧光曲线下面积均与chla含量具有强烈的线性相关性。根据我们的进一步研究显示，以上所测试的微藻涵盖了原核藻类和真核藻类的培养物，均成线性关系。
40.7、水产养殖水体水样的荧光曲线下面积与chla含量和初级生产力的关系
41.对进行梯度稀释，通过上文中的方法测定绘制荧光曲线，计算p荧光曲线下面积，并测定chla含量和藻细胞密度，并计算初级生产力。初级生产力计算公式：
42.p＝k
·r·
c(chla)
·
dh，
43.其中，p为初级生产力，mg/(m3·
d)；r为同化系数，采取平均同化系数3.2mg/(mg
·
h)；c(chla)为叶绿素a含量，mg/m3；dh为日照时间h，开封平均日照时间为4.98h；k为经验常数，一般晴天为2.0，阴天为1.5，采用经验常数平均值1.97。
44.结果如图2所示，养殖水体水样的荧光曲线下面积均与chla含量有强烈的线性相关性。
45.8、使用荧光曲线下面积测定水样的chla含量和初级生产力
46.取集胞藻pcc6803、聚球藻pcc7942、小球藻c2、莱茵衣藻cc125和cc4533以及养殖水体的水样，分别测定荧光曲线下面积，用传统方法检测chla含量，并通过chla含量计算初级生产力。对这些水样测定绘制荧光曲线，将荧光曲线下面积代入到线性方程中计算chla含量和初级生产力。结果显示，对于纯培养的微藻水样以及这些微藻水样的混合水样，根据荧光曲线下面积计算得到的chla含量和初级生产力与传统方法之间的偏差为1-2％，属于误差范围内；对于养殖水体水样，根据荧光曲线下面积计算得到的chla含量和初级生产力与传统方法之间的偏差为1-5％，属于误差范围内。从实验数据显示，通过荧光曲线下面积来估算chla含量和初级生产力是可行并可靠的。
47.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。