一种人工熊胆粉中叔丁胺、仲丁胺以及三乙胺含量检测方法与流程

1.本发明涉及一种人工熊胆粉中叔丁胺、仲丁胺以及三乙胺含量检测方法。


背景技术：

2.熊胆粉是熊科动物黑熊或棕熊胶囊的粉末制品，具有清热、平肝、利胆、解痉、溶石等功效。临床上常用于小儿热盛惊风、癫痫、抽搐、黄疸等。采用人工合成方法将来源广泛的家禽胆汁制品转化成与天然熊胆粉疗效一致的替代资源人工熊胆粉，既保护了生态环境，又有利于推动中药技术的现代化进程。
3.现有的关于人工熊胆粉中三种胺含量检测方法主要包括以下专利和文献：
4.1.cn202010611542.8：一种头孢噻肟钠中三乙胺的检测方法及其应用；
5.2.“顶空气相色谱法测定头孢曲松钠中三乙胺的残留量”(魏永红，冯翎，宋世丘；《中国医院用药评价与分析》，2019年第21卷第2期)；
6.3.“气相色谱测定工业废水中的三乙胺”(张云枫，闫好民，黄虹霞，李凌；《浙江化工》2018,49(03),45～47)；
7.4.“药物中三乙胺残留溶剂测定方法”(牛旻晖，臧佳良，温浩；《煤炭化工》2017，40(05)，152～153及156)。
8.根据现有的文献以及相关发明和药典，对人工熊胆粉中三乙胺、叔丁胺和仲丁胺三种胺含量的控制，均缺少相应的检测方法。而在人工熊胆粉的化学合成工艺过程中存在使用叔丁胺、仲丁胺、三乙胺等溶剂，因此该产品中可能存在三种胺溶剂残留，现有的色谱方法对于三种胺的定量存在峰形拖尾严重、分离效果不好、专属性差、三种胺定量限高于人工熊胆粉中三种胺的残留量等缺陷，严重影响人工熊胆粉中三种胺含量的有效定量计算。故此，现有三种胺含量检测方法有待于进一步完善。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于：克服现有技术中的不足之处，提供一种快速有效测定人工熊胆粉中叔丁胺、仲丁胺以及三乙胺含量检测方法，本发明采用缓冲溶液(稀释剂)前处理，顶空进样的方式进行气相色谱法(gc) 检测。区别于传统气相色谱法检测胺含量，本方法所述缓冲溶液为n,n
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二甲基甲酰胺(dmf)和浓度为8.0mol/l三羟甲基氨基甲烷水溶液按体积比9:1的混合溶液，能快速以及有效的游离出人工熊胆粉样品中各种结合态胺，大大减低了叔丁胺、仲丁胺以及三乙胺在样品中的检测限以及定量限，同时筛选了非极性的气相色谱柱填料，解决了气相色谱条件下三种胺的峰形拖尾以及分离效果不好的问题。最终快速、准确有效的分离和准确定量人工熊胆粉中的胺残留。提高了检测效率，大大减低了检测成本，有利于人工熊胆粉工业化大生产过程以及成品的质量控制。
10.为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
11.一种人工熊胆粉中叔丁胺、仲丁胺以及三乙胺含量检测方法，采用气相色谱分析方法，按下述步骤进行：
12.步骤一、选定色谱条件
13.色谱柱：phenomenex zb-1毛细管柱(或效能相当毛细管柱)，色谱柱规格为60m
×
0.53mm，3.0um；
14.载气：氮气；
15.载气流速：3.0ml/min；
16.进样口温度为200℃；
17.分流比：20:1；
18.检测器：氢火焰离子化检测器；
19.检测器温度为220℃；
20.顶空进样量：5ml；
21.升温程序为：从50℃起保留10min，以每分钟升高1℃的速率升至 70℃，保留5min，再以每分钟升高40℃的速率升至220℃，保留10min；
22.顶空温度设置：箱体温度80℃，流路温度85℃，传输线温度90℃，循环时间65min，样品预热时间60min；
23.步骤二、配制对照品溶液和待测供试品溶液
24.a、对照品溶液的配制
25.取叔丁胺、仲丁胺、三乙胺对照品，置于已加有稀释剂并称重的容量瓶中，用稀释剂溶解成浓度各为0.01mg/ml的叔丁胺、仲丁胺以及三乙胺的对照品混合溶液；
26.b、待测供试品溶液的配制
27.取人工熊胆粉样品用稀释剂溶解为浓度为100mg/ml的供试品溶液；
28.所述的稀释剂为n,n-二甲基甲酰胺(dmf)和浓度为8.0mol/l三羟甲基氨基甲烷水溶液按体积比9:1的混合溶液。
29.步骤三、进行顶空进样、色谱测定并计算人工熊胆粉样品中叔丁胺、仲丁胺和三乙胺含量
30.精密量取叔丁胺、仲丁胺以及三乙胺的对照品混合溶液各5ml以及供试品溶液5ml，按顶空进样后，分别注入气相色谱仪，按步骤一所述的色谱条件测定，记录色谱图中叔丁胺，仲丁胺和三乙胺的峰面积，按照外标法，计算人工熊胆粉样品中叔丁胺、仲丁胺和三乙胺含量。
31.本发明中，一种人工熊胆粉中叔丁胺、仲丁胺以及三乙胺含量检测方法，还包括系统适应性测定：
32.取叔丁胺、仲丁胺、三乙胺对照品，置于已加有适量稀释剂并称重的容量瓶中，用稀释剂溶解成浓度各为0.01mg/ml的叔丁胺、仲丁胺以及三乙胺的对照品混合溶液，摇匀即得系统适用性溶液；取5ml进样记录色谱图各峰的分离度和理论塔板数。
33.综上所述，本发明的有益效果：
34.1.本发明方法操作过程简单、专属性强，能够快速准确的测定人工熊胺粉中叔丁胺、仲丁胺以及三乙胺含量的含量；
35.2.相对现有的一些三种胺含量检测方法，本发明方法应用缓冲溶液来前处理样品，能快速以及有效的游离出人工熊胆粉样品中各种结合态胺，大大降低了三种胺在人工熊胆粉样品中的检测限以及定量限,提高了检测方法的灵敏度；
36.3.现有的胺含量检测方法中，无法在一个色谱条件下分离和定量三种胺，而本方法解决了这个问题，同时在顶空进样的方式进行气相色谱检测，利用弱极性的毛细管柱(zb-1),解决了三种胺峰形拖尾以及分离效果不好的问题；
37.4.对于人工熊胆粉中三种胺的溶剂残留限度要求是各种胺含量不超过100ppm，而本专利应用顶空进样的方式结合氢火焰离子检测器(fid) 检测器，再配合缓冲溶液对样品的前处理，能同样达到更加昂贵的质谱检测器(gc-ms)检测灵敏度要求。因此该方法灵敏度高、可靠性强，检测成本低，适用于人工熊胆粉工业化大生产中间产品控制以及成品的质量控制。
附图说明
38.图1为叔丁胺对照溶液的色谱图；
39.图2为仲丁胺对照溶液的色谱图；
40.图3为三乙胺对照溶液的色谱图；
41.图4为人工熊胆粉样品供试品溶液的色谱图。
具体实施方式
42.下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
43.实施例
44.本发明采用气相色谱分析方法，对人工熊胆粉中叔丁胺、仲丁胺以及三乙胺含量进行检测，检测步骤如下：
45.步骤一、选定色谱条件
46.色谱柱：phenomenex zb-1毛细管柱(或效能相当毛细管柱)，色谱柱规格为60m
×
0.53mm，3.0um；
47.载气：氮气；
48.载气流速：3.0ml/min；
49.进样口温度为200℃；
50.分流比：20:1；
51.检测器：氢火焰离子化检测器；
52.检测器温度为220℃；
53.顶空进样量：5ml；
54.升温程序为：从50℃起保留10min，以每分钟升高1℃的速率升至 70℃，保留5min，再以每分钟升高40℃的速率升至220℃，保留10min；
55.顶空温度设置：箱体温度80℃，流路温度85℃，传输线温度90℃，循环时间65min，样品预热时间60min；
56.步骤二、配制对照品溶液和待测供试品溶液
57.a、对照品溶液的配制
58.取叔丁胺、仲丁胺、三乙胺对照品，置于已加有适量稀释剂并称重的容量瓶中，用稀释剂溶解成浓度各为0.01mg/ml的叔丁胺、仲丁胺以及三乙胺的对照品混合溶液；
59.b、待测供试品溶液的配制
60.取人工熊胆粉样品用稀释剂溶解为浓度为100mg/ml的供试品溶液；
61.所述稀释剂为n,n-二甲基甲酰胺(dmf)和8.0mol/l的三羟氨基甲烷水溶液按体积比9:1的混合溶液。
62.步骤三、进行顶空处理、色谱测定并计算人工熊胆粉样品中叔丁胺、仲丁胺和三乙胺含量
63.精密量取叔丁胺、仲丁胺以及三乙胺的对照品混合溶液各5ml以及供试品溶液5ml，按顶空进样后，分别注入气相色谱仪，按步骤一所述的色谱条件测定，测定结果如图1～4所示，记录色谱图中叔丁胺，仲丁胺和三乙胺的峰面积以及供试品溶液的峰面积。
64.按外标法计算叔丁胺，仲丁胺和三乙胺的含量c，如式(1)和式(2) 所示：
[0065][0066][0067]
式中：
[0068]
rf为叔丁胺、仲丁胺和三乙胺的响应因子；
[0069]cs
为对照溶液浓度，mg/ml；
[0070]as
为对照溶液峰面积；
[0071]ai
为供试溶液峰面积；
[0072]ci
为供试溶液浓度，mg/ml；
[0073]
根据以上公式计算得本实施例中叔丁胺，仲丁胺和三乙胺的含量分别为0.00032％、0％、0.0010％。
[0074]
系统适应性测定：
[0075]
取叔丁胺、仲丁胺、三乙胺对照品，置于已加有适量稀释剂并称重的容量瓶中，用稀释剂溶解成浓度各为0.01mg/ml的叔丁胺、仲丁胺以及三乙胺的对照品混合溶液，摇匀即得系统适用性溶液；取5ml进样记录色谱图各峰的分离度和理论塔板数。
[0076]
为了进一步验证本方法的可行性，还进行了以下实验：
[0077]
1.叔丁胺、仲丁胺和三乙胺线性实验
[0078]
取叔丁胺的对照品适量，用稀释剂分别配置为0.006mg/ml、 0.008mg/ml、0.010mg/ml、0.0.012mg/ml、0.014mg/ml的供试品溶液。分别取5ml溶液，放入气相色谱仪中，记录色谱图，各浓度的峰面积见下表1和表2。
[0079]
表1叔丁胺检测限和定量限实验结果
[0080][0081]
表2叔丁胺线性实验结果
[0082][0083]
以浓度对峰面积做线性回归，得线性方程相关系数r＝0.9993。
[0084]
结果表明：叔丁胺在0.00602mg/ml～0.01404mg/ml浓度范围内线性良好。
[0085]
取仲丁胺的对照品适量，用稀释剂分别配置为0.006mg/ml、0.008mg/ml、0.010mg/ml、0.012mg/ml、0.014mg/ml的供试品溶液。分别取5ml溶液，放入气相色谱仪中，记录色谱图，各浓度的峰面积见下表3和4。
[0086]
表3仲丁胺检测限和定量限实验结果
[0087][0088]
表4仲丁胺线性实验结果
[0089][0090]
以浓度对峰面积做线性回归，得线性方程相关系数r＝0.9993。
[0091]
结果表明：仲丁胺在0.00649mg/ml～0.01513mg/ml浓度范围内线性良好。
[0092]
取三乙胺的对照品适量，用稀释剂分别配置为0.006mg/ml、 0.008mg/ml、0.010mg/ml、0.0.012mg/ml、0.014mg/ml的供试品溶液。分别取5ml溶液，放入气相色谱仪中，记录色谱图，各浓度的峰面积见下表5和6。
[0093]
表5三乙胺检测限和定量限实验结果
[0094][0095]
表6三乙胺线性实验结果
[0096][0097]
以浓度对峰面积做线性回归，得线性方程相关系数r＝0.9983。
[0098]
结果表明：三乙胺在0.00602mg/ml～0.01404mg/ml浓度范围内线性良好。
[0099]
2.叔丁胺、仲丁胺和三乙胺准确度试验
[0100]
①
叔丁胺准确度试验
[0101]
对照品溶液的制备：精密称定叔丁胺100mg，稀释并定容，使浓度为0.01mg/ml，作为对照品溶液。
[0102]
供试品溶液的制备：分别精密称定叔丁胺100mg，稀释并定容，得到浓度分别为0.016mg/ml，0.020mg/ml和0.024mg/ml的对照溶液。精密称定供试品1000mg，置于10ml量瓶中，分别加入浓度为0.016mg/ml， 0.020mg/ml和0.024mg/ml叔丁胺对照溶液各5ml，用稀释剂定容至刻度，摇匀，即得80％、100％、120％的样品，每个浓度各配置三份。
[0103]
按上述检测方法分别测定回收率，结果如下表7：
[0104]
表7叔丁胺回收率测定结果
[0105][0106]
结果表明：本法测定准确度良好。
[0107]
②
仲丁胺准确度试验
[0108]
对照品溶液的制备：精密称定仲丁胺100mg，稀释并定容，使浓度为0.010mg/ml，作为对照品溶液。
[0109]
供试品溶液的制备：分别精密称定仲丁胺100mg，稀释并定容，得到浓度分别为0.016mg/ml，0.020mg/ml和0.024mg/ml的对照溶液。精密称定供试品1000mg，置于10ml量瓶中，分别加入浓度为0.016mg/ml， 0.020mg/ml和0.024mg/ml仲丁胺对照溶液各5ml，用稀释剂定容至刻度，摇匀，即得80％、100％、120％的样品，每个浓度各配置三份。
[0110]
按上述检测方法分别测定回收率，结果如下表8：
[0111]
表8仲丁胺回收率测定结果
[0112][0113]
结果表明：本法测定准确度良好。
[0114]
③
三乙胺准确度试验
[0115]
对照品溶液的制备：精密称定三乙胺100mg，稀释并定容，使浓度为0.010mg/ml，作为对照品溶液。
[0116]
供试品溶液的制备：分别精密称定三乙胺100mg,稀释并定容，得到浓度分别为0.016mg/ml，0.020mg/ml和0.024mg/ml的对照溶液。精密称定供试品1000mg，置于10ml量瓶中，分别加入浓度为0.016mg/ml， 0.020mg/ml和0.024mg/ml三乙胺对照溶液各5ml，用稀释剂定容至刻度，摇匀，即得80％、100％、120％的样品，每个浓度各配置三份。
[0117]
按上述检测方法分别测定回收率，结果如下表9：
[0118]
表9三乙胺回收率测定结果
[0119][0120]
结果表明：本法测定准确度良好。
[0121]
3.叔丁胺、仲丁胺和三乙胺的精密度考察
[0122]
精密称定叔丁胺100mg，稀释并定容，使浓度为0.008mg/ml， 0.010mg/ml，0.012mg/ml作为精密度溶液。各连续进样3次，记录峰面积的精密度如下表10。
[0123]
表10叔丁胺精密度试验结果
[0124][0125]
结果表明：方法的精密度良好。
[0126]
精密称定仲丁胺100mg，稀释并定容，使浓度为0.008mg/ml， 0.010mg/ml，0.012mg/ml作为精密度溶液。各连续进样3次，记录峰面积的精密度如下表11。
[0127]
表11仲丁胺精密度试验结果
[0128][0129]
[0130]
结果表明：方法的精密度良好。
[0131]
精密称定三乙胺100mg，稀释并定容，使浓度为0.008mg/ml，0.010mg/ml，0.012mg/ml作为精密度溶液。各连续进样3次，记录峰面积的精密度如下表12。
[0132]
表12三乙胺精密度试验结果
[0133][0134][0135]
结果表明：方法的精密度良好。
[0136]
4.叔丁胺、仲丁胺和三乙胺溶液稳定性试验
[0137]
精密称定叔丁胺100mg，仲丁胺100mg，三乙胺100mg，稀释并定容，使浓度均为0.01mg/ml作为对照溶液。分别在常温下0、2、4、8、12、 24小时，进样，记录主成分的峰面积变化，结果如下表13。
[0138]
表13对照溶液稳定性考察结果
[0139][0140]
结果表明：常温下24小时内对照溶液稳定性良好。
[0141]
5.方法耐用性试验
[0142]
将通过改变不同的载气流速、不同的进样口温度和不同的检测器温度(具体改变
范围见下表14)来评估当测定条件参数有微小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。要求各个变动的色谱条件参数下，叔丁胺，仲丁胺和三乙胺的对照溶液的测定结果符合认可标准。考察结果见下表15。
[0143]
表14测定条件参数变化
[0144][0145][0146]
表15考察结果
[0147][0148]
由上表可知，各条件下，叔丁胺、仲丁胺和三乙胺对照溶液的理论塔板数均大于5000，相邻峰的分离度均大于1.5，说明在测定条件有小的变动时，测定条件符合要求，耐用性试验通过。
[0149]
6.样品含量测定
[0150]
精密称取叔丁胺、仲丁胺和三乙胺对照品适量，用稀释剂配制成 0.01mg/ml的对照溶液，取人工熊胆粉样品各三批用稀释剂配制成 100mg/ml的供试溶液，上述溶液分别取5ml进样，记录色谱图。不同批次的人工熊胆粉样品中叔丁胺、仲丁胺和三乙胺含量结果见表16。
[0151]
表16不同批次的人工熊胆粉样品中叔丁胺，仲丁胺和三乙胺含量结果
[0152]
批号叔丁胺的含量仲丁胺的含量三丁胺的含量
zy02101811010.00031％00.00099％zy02101812010.00033％00.00105％zy02101812020.00029％00.00096％
[0153]
由此可见，本发明方法适用于人工熊胆粉中叔丁胺、仲丁胺和三乙胺含量检测，且该方法易于操作，检测结果准确，检测成本低、可靠性强、检测效率高。