一种测定培养基中尿素含量的方法

1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种测定培养基中尿素含量的方法。


背景技术：

2.微藻作为低等植物，广泛分布于海洋、湖泊、陆地等地方。这些微藻有极高的固碳效率，为实现“碳达峰、碳中和”目标有极高的潜在的贡献价值。尿素通常作为微藻的氮源，其含量的多少将影响微藻的生长，因此能够准确定性和定量微藻培养基中的尿素变化对于微藻的生长尤为关键。而一般微藻会分泌一些代谢物到水体中，无法利用常规方法准确检测尿素的浓度变化。
3.目前，国内外对尿素的测定方法有很多，归纳起来主要有以下几种：直接比色法、间接比色法、色谱法、中红外光谱法等。1)直接比色法即用某种特殊试剂与尿素直接作用，产生显色反应，然后在特定的波长下用分光光度计测定其吸光度，再换算成尿素含量。较常用的直接比色法有二乙酰一肟法、邻苯二甲醛法、对二甲氨基苯甲醛法3种，而亚硝酸盐-格里斯试剂法在现阶段只能定性不能定量。2)间接比色法就是通过检测尿素在酶解后的产物，再换算成尿素含量。但是干扰多。现在常用的间接比色法有如脲酶-波氏比色法、酶偶联法、甲酚红法、酶电极法等。3)色谱分析方法具有高速、高效、高灵敏等特点，适用于复杂混合物的分离，实现多组分的同时测定，被广泛应用于环境监测、食品、农业等领域。经文献的查阅，色谱法测定尿素主要是基于液相色谱相关联的技术。
4.色谱法：色谱分析方法具有高速、高效、高灵敏等特点，适用于复杂混合物的分离，实现多组分的同时测定，被广泛应用于环境监测、食品、农业等领域。经文献的查阅，色谱法测定尿素主要是基于液相色谱相关联的技术。1)高效液相色谱-荧光检测器法，在近来通过测定尿素与次溴酸在一定条件下反应产生的发光体，结合荧光检测器的高效液相色谱法检测尿素的浓度，该方法主要运用在临床上，但是该方法目前来说精确性一般，线性相关系数r只达到0.93，且存在干扰，故该方法还需要进一步改进。2)液相色谱同位素稀释串联质谱法，以尿素同位素标记物(urea-13c，15n2)为内标，zorbaxrx-sil为色谱分离柱，乙腈溶液为流动相，使用电喷雾三重四级杆串联质谱的多重反应监测模式测定，以及同位素稀释的括号法进行定量。在血清尿素检测中，该法前处理操作简单、快速，不需进行复杂的衍生化反应且定量准确，重复精度高。采用美国nist血清标准物质进行验证，测定结果与标准值的相对偏差小于0.5％，证明了该法具有较高准确性。
5.然而，以上方法依然存在耗时长，操作繁琐，灵敏度低，干扰多以及不能同时定量、定性等缺陷。因此，本发明基于气相-质谱联用检测的基础上开发一种易操作、操作时间短、干扰少、灵敏度高并且定性和定量尿素的方法，为各个领域科学研究及应用，尤其是微藻培养提供一种检测尿素的技术支持。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种尿素的测定方法，该方法可定量检测尿素，具有易操
作、操作时间短、干扰少、灵敏度高的特点。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.一种测定培养基中尿素含量的方法，包括以下步骤：
9.1)取待测培养基样本，经膜过滤、氦气吹干后，依次加入吡啶、含甲基三氯硅烷的n，o-双(三甲基硅烷基)三氟乙酸溶液，震荡后水浴，获得待测液；
10.2)采用气相-质谱检测所述待测液中式i结构的尿素衍生物，计算培养基中尿素含量；
[0011][0012]
一些实施方案中，所述培养基为微藻培养基，可以是未进行培养的培养基，也可以是培养过微藻的培养基；所述微藻包括纤细裸藻和/或小球藻。
[0013]
一些实施方案中，步骤1)中所述吡啶和含甲基三氯硅烷的n，o-双(三甲基硅烷基)三氟乙酸溶液的体积比为4:1。
[0014]
一些实施方案中，步骤1)中所述震荡的时间为30秒。
[0015]
一些实施方案中，步骤1)中所述水浴为50℃水浴5min。
[0016]
一些实施方案中，步骤1)中所述膜过滤的滤膜孔径为0.22μm。
[0017]
一些实施方案中，步骤1)中所述含甲基三氯硅烷的n，o-双(三甲基硅烷基)三氟乙酸溶液中甲基三氯硅烷的质量分数为1％。
[0018]
一些实施方案中，所述气相-质谱检测的条件为：
[0019]
气相-质谱的进样口、四级杆、离子源、传输线温度分别为150℃、150℃、280℃、320℃；
[0020]
升温程序为：温度60℃维持1-3分钟，升温到180℃维持1-3分钟，总共运行12-15分钟；
[0021]
分流比为100:1；
[0022]
进样体积为1μl；
[0023]
纯氦气流速为1.2ml/min
[0024]
设置扫描模式，50-500m/z。
[0025]
本发明所述步骤2)之前还包括：制备梯度浓度的标准品液，对所述标准溶液采用气相-质谱检测，以峰面积为纵坐标，尿素浓度为横坐标，标建立标准曲线。
[0026]
一些实施方案中所述梯度浓度的标准品溶液由水和尿素组成，尿素的浓度为0.05～1mg/ml；优选地，所述尿素的浓度具体可为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml和0.05mg/ml。
[0027]
本发明在缚酸剂吡啶作用下，将尿素和bstfa(含1％tmcs)进行衍化反应，尿素中两个氨基中的氢基分别被三甲基硅取代，由原来分子量为60.06的尿素衍化形成了分子量为204.11的衍生物，形成了被气相-质谱检测到的质谱图，根据该质谱图可对培养基中的尿素进行定性分析，根据标准样品的标准曲线和气相-质谱检测结果可对培养基中的尿素进
行定量分析，且易操作、操作时间短、干扰少、灵敏度高。
附图说明
[0028]
图1示本发明检测原理以及尿素衍生化后的质谱图；
[0029]
图2示标准品的保留时间；
[0030]
图3为微藻培养基中尿素的出峰时间；
[0031]
图4为根据标准品的浓度梯度以及峰面积建立的标准曲线以及r相关系数；
[0032]
图5为根据标准曲线和样品的峰面积计算出微藻培养基中尿素的浓度。
具体实施方式
[0033]
本发明提供了一种测定培养基中尿素含量的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0034]
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0035]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0036]
实施例1
[0037]
(一)制样
[0038]
1.用0.22μm膜过滤1ml微藻培养基，取100μl微藻培养基转移到安捷伦小瓶子中；
[0039]
2.利用普通氦气对上清液吹干，大概20分钟；
[0040]
3.在已经氮吹干的瓶子里加入400μl吡啶，再加入100μln,o-双(三甲基硅烷基)三氟乙酸(bstfa)(含1％甲基三氯硅烷,tmcs),震荡30秒；
[0041]
4.在水浴锅温度50℃为水浴5分钟；
[0042]
5.样品上机检测。
[0043]
(二)建立标准样品曲线
[0044]
1.称10mg尿素到安捷伦瓶子，加入1ml去离子水，充分溶解；
[0045]
2.配置尿素浓度梯度为1,0.5,0.25,0.1,0.05mg/ml，体积为500μl；取100μl按照以上2-5步骤进行。
[0046]
(三)气相-质谱条件
[0047]
气相-质谱的进样口、四级杆、离子源、传输线温度分别为150℃、150℃、280℃、320℃。机箱温度60℃维持1-3分钟，升温到180℃维持1-3分钟，总共运行12-15分钟。分流比：100:1。纯氦气流速1.2ml/min。进样体积1μl。设置扫描模式，50-500m/z。
[0048]
结果分析
[0049]
1、本发明检测尿素浓度的原理以及其衍生化后的质谱图(图1)；尿素在缚酸剂吡啶下和bstfa(含1％tmcs)发生了衍化反应，其两个氨基中的氢基分别被三甲基硅取代。由原来分子量为60.06的尿素衍化形成了分子量为204.11的衍生物，最后形成了被气相-质谱检测到的质谱图。根据该质谱图可对尿素进行定性分析。
[0050]
2、确定标准样品的保留时间(图2)；在设定的气相-质谱条件下，尿素衍生化后的
物质的保留时间为8.671,峰图正常，没有和其他峰混合在一起。根据该保留时间以及峰面积可对待测液中尿素尿素衍生物的浓度进行定量，进一步通过计算，获得培养基中尿素浓度。
[0051]
3、确定微藻培养基中尿素衍生物的出峰时间(图3)；微藻培养基中的尿素衍生化的物质的保留时间为8.671，和图2标准样品的保留时间一样，并且能够和其他峰很好的分离开，说明在设定的气相-质谱条件下，微藻培养基中的尿素不仅能够衍生化，而且不受到其他物质的干扰。该结果为微藻微藻培养基中的尿素的定量提供了依据。
[0052]
4、根据标准样品中尿素的浓度梯度以及峰面积制作和分析线性回归曲线方程以及r相关系数(图4)；结果显示，尿素的浓度在0.1～1mg/ml范围内经过衍生化后的物质和峰面积呈正相关，其中r2相关系数达到了0.9956，符合定量的标准。
[0053]
5、根据回归曲线方程和样品的峰面积计算出微藻培养基中尿素的浓度(图5)。结果显示，利用本发方法检测到微藻培养第0天时培养基中的尿素浓度为0.98g/l,到了第3天时，尿素浓度降低了0.74g/l(24.49％),说明微藻吸收了培养基中的尿素。到了培养后期(第6天)，培养基中的尿素浓度降低到了0.32g/l(67.34％)，说明微藻到了培养后期，吸收尿素的速度提高了。该结果将为优化微藻培养的方法提供了研究基础。同时说明了本发明成功应用到微藻培养中尿素的定性和定量。
[0054]
以上结果显示，尿素浓度在0.1～1mg/ml范围内和峰面积呈正相关，其中r2相关系数达到了0.9956，符合定量的标准。培养基中尿素浓度在0.1mg/ml时依然能够被检测到，说明该检测尿素的方法的灵敏度极高，另外，根据图3可知，目标峰(尿素衍生物)和其他杂峰有很好的分离效果，说明该方法具有检测干扰少的特点。