核苷类药物生物转化研究中排除内源性物质干扰的方法与流程

1.本发明涉及药学领域，尤其涉及一种核苷类药物生物转化研究中排除内源性物质干扰的方法。


背景技术：

2.核苷类药物是临床上用于治疗病毒感染性疾病、肿瘤、艾滋病的一类重要的药物。越来越多的核苷类似物进入药物研发阶段，在核苷类似物研发过程种，对于核苷类似物进行药性评价非常重要，很多时候，是药物研发成败的关键。药性评价中非常重要的一个方面是需要对核苷类似物进行分析及生物转化研究。核苷类似物生物转化研究，现行方法一般为液质联用高分辨质谱来进行。因为核苷类似物母核一般为核苷母核，在分析过程中，会被内源性物质干扰，对核苷类似物(或者说核苷类药物)生物转化研究带来困难。


技术实现要素：

3.为了解决核苷类似物生物转化研究中内源性物质干扰的问题，本发明公开了一种核苷类药物生物转化研究中排除内源性物质干扰的方法，包括以下步骤：
4.s1、采用放射性同位素标记待测核苷类药物；
5.s2、对所述步骤s1中标记了放射性同位素的待测核苷类药物进行生物转化试验；
6.s3、对经过所述步骤s2的生物转化试验产生的样品和空白对照分别用高效液相联用放射性同位素/高分辨质谱检测，找出与空白对照同一保留时间的带有放射性同位素的特征峰作为待分析的拟代谢产物，以及找出与所述步骤s2的生物转化试验产生的样品同一保留时间的空白对照的特征峰作为内源性物质；
7.s4、分别富集所述步骤s3中的待分析的拟代谢产物和内源性物质，并分别进行衍生化反应，分别得到衍生化拟代谢产物和衍生化内源性物质；
8.s5、用高效液相联用放射性同位素/高分辨质谱分别检测所述步骤s4中的衍生化拟代谢产物和衍生化内源性物质来进行判断，判断原则为：若所述衍生化拟代谢产物的保留时间均与所述衍生化内源性物质的保留时间对应，则所述内源性物质中含有与所述待分析的拟代谢产物相同的物质；若所述衍生化拟代谢产物的保留时间部分与所述衍生化内源性物质的保留时间对应，则所述待分析的拟代谢产物包含第一类物质和第二类物质，且所述内源性物质包含所述第一类物质但不包含所述第二类物质；若所述衍生化拟代谢产物的保留时间均不与所述衍生化内源性物质的保留时间对应，则所述内源性物质中不含有与所述待分析的拟代谢产物相同的物质，排除了所述内源性物质的干扰。在本发明中术语“生物转化试验”可以理解为包含了文字上的简单替换，比如“生物转化实验”、“生物转化研究”等。
9.在一些实施方案中，所述步骤s1中：放射性同位素选自c-14、h-3、i-125中的一种或多种。
10.在一些实施方案中，所述步骤s1中：放射性同位素标记在待测核苷类药物的不被
代谢成小分子的部位。
11.在一些实施方案中，所述步骤s1中：待测核苷类药物的不被代谢成小分子的部位选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，尿嘧啶及其衍生物。
12.在一些实施方案中，所述步骤s2中：生物转化试验选自动物体内生物转化研究、人体内生物转化研究和体外基质生物转化研究中的一种或者多种；所述体外基质选自血浆、肝细胞、肝微粒体、肝s9中的一种或者多种。
13.在一些实施方案中，所述步骤s3中：所述空白对照用于排除基质干扰；所述基质干扰包括内源性物质干扰；
14.所述同一保留时间和所述保留时间对应均包含分析化学领域允许的时间误差范围。
15.在一些实施方案中，所述高效液相联用放射性同位素检测器/高分辨质谱指高效液相通过三通分流，分别进入放射性同位素检测器和高分辨质谱检测器。
16.在一些实施方案中，所述步骤s4中：所述衍生化反应选自甲基化反应、酯化反应、酰化反应中的一种或者多种。进一步地，所述酰化反应为乙酰化反应。
17.在一些实施方案中，还包括步骤s6、采用质谱对所述待测核苷类药物经所述生物转化试验得到的尚未鉴定出的代谢产物重新进行物质种类鉴定。
18.在一些实施方案中，所述步骤s6中：尚未鉴定出的代谢产物为排除所述步骤s5中衍生化拟代谢产物的保留时间与衍生化内源性物质的保留时间对应的特征峰表示的物质。
19.本发明在对核苷类似物进行生物转化研究的过程中，将放射性同位素标记的核苷类似物作为示踪剂，使用高效液相联用放射性同位素/高分辨质谱进行分析，可以将核苷类似物的代谢产物进行初步的识别，对于与内源性物质相同的代谢产物，进行衍生化反应，比如乙酰化和甲基化，然后再使用高效液相联用放射性同位素/高分辨质谱进行分析，可以此结果用于验证核苷类似物的代谢产物，排除内源性物质的干扰，有效提高核苷类似物生物转化研究的效率及准确性。
20.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
21.图1是本发明一个具体实施方式的流程图。
22.图2是放射性同位素标记的化合物a给药到小鼠体内后尿液样品中放射性代谢物谱图和质谱数据(乙酰化前)。其中，i是放射性同位素标记的化合物a经生物转化试验产生的样品的放射性图谱，主要为代谢产物b；ii是i图尿液样品高效液相联用高分辨质谱图谱，i图同位素峰b相同保留时间下可通过质谱检测到内源性物质c。
23.图3是代谢产物b和内源性物质c乙酰化后的图谱。其中，i是代谢产物b乙酰化后的放射性图谱；ii是内源性物质c乙酰化产物的高分辨质谱图谱。
具体实施方式
24.为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
25.须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
26.实施例1
27.如图1所示，本实施例的具体技术流程如下：
28.1.选择合适核素，一般为c-14或h-3，选择合适的位点，一般为不被代谢成小分子的部位，同时考虑标记合成的难易程度，对核苷类似物(或者具体为核苷类药物)进行放射性同位素标记。
29.2.将放射性同位素标记的化合物作为示踪剂，对核苷类似物进行体外或体内生物转化研究，比如动物或人体内生物转化研究和体外基质(血浆，肝细胞，肝微粒体，肝s9等)生物转化研究。
30.3.对生物转化实验产生的样品用高效液相联用放射性同位素/高分辨质谱进行分析。以放射性同位素峰为指征，结合高分辨质谱特征，寻找可能的代谢产物。对于某些与内源性物质相同的代谢产物，会被基质干扰，无法分辨是否是生成的代谢产物还是内源性物质，为易与内源性物质混同的可能的代谢产物，也是本发明待分析的拟代谢产物。而另一些不易混同的代谢产物，这里称为普通代谢产物。
31.4.对于易与内源性物质混同的可能的代谢产物，先对其进行富集，然后进行化学衍生反应，一般为甲基化和乙酰化反应，得到衍生化拟代谢产物。对用于排除基质干扰的空白对照与易与内源性物质混同的可能的代谢产物同一保留时间的特征峰组分，也同样进行富集和化学衍生化得到衍生化内源性物质。
32.5.对于衍生化拟代谢产物和衍生化内源性物质，用高效液相联用放射性同位素/高分辨质谱进行分析。以放射性同位素峰为指征，结合高分辨质谱特征，寻找可能的代谢产物的衍生化产物。放射性峰指征及高分辨质谱数据，可以将受试核苷类似物的代谢产物与核苷类内源性物质干扰区别开，从而排除相关内源性物质的干扰。判断原则为：若所述衍生化拟代谢产物的保留时间均与所述衍生化内源性物质的保留时间对应，则所述内源性物质中含有与所述待分析的拟代谢产物相同的物质；若所述衍生化拟代谢产物的保留时间部分与所述衍生化内源性物质的保留时间对应，则所述待分析的拟代谢产物为混合物，且所述内源性物质中含有与所述待分析的拟代谢产物部分相同的物质；若所述衍生化拟代谢产物的保留时间均不与所述衍生化内源性物质的保留时间对应，则所述内源性物质中不含有与所述待分析的拟代谢产物相同的物质，排除了所述内源性物质的干扰。
33.实施例2
34.c-14标记核苷酸类化合物a(一种腺嘌呤核苷单磷酸衍生物)，给药(20mg/100μci/kg)到小鼠体内，收集血浆、尿液和粪便样品，将血浆和粪便样品用有机试剂甲醇提取，得到的样品用高效液相联用放射性同位素/高分辨质谱进行分析，得到样品放射性代谢物谱图和质谱数据。其中，尿液样品放射性代谢物谱图中有主要的代谢产物b(图2)，经高分辨质谱鉴定，发现该保留时间可以找到内源性物质c的质谱数据，但是空白尿液相同保留时间也有内源性物质c的质谱数据，因此不能确定此代谢产物b是内源性物质c，还是来自背景干扰。
35.为了鉴别代谢产物b是否是内源性物质c，对尿液样品和空白尿液分别进行乙酰化。乙酰化以后，用高效液相联用放射性同位素/高分辨质谱进行分析，得到样品放射性代谢物谱图和质谱数据，可以发现衍生化以后，尿液样品中主要放射性物质代谢产物b变成一个主要的放射性峰和四个次要的放射性峰(图3)，高分辨质谱显示，该主要的放射性峰为内源性物质c的双乙酰化产物；四个次要的放射性峰中的前三个为内源性物质c的三乙酰化脱水产物。
36.衍生化前后的放射性峰和质谱数据对应，显示尿液样品中的放射性峰主要为内源性物质c。如果没有放射性同位素指示和化学衍生化相结合，不能判断核苷酸类化合物a尿液样品中的代谢产物b是否是内源性物质c，此方法可以将受试核苷类似物的代谢产物与核苷类内源性干扰区别开，从而排除相关内源性物质的干扰。
37.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。